王麗強(qiáng) 劉 歡 羅振國(guó)

佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江省佳木斯市 154003

前列腺癌是男性中最常被診斷出的癌癥，并且是美國(guó)癌癥死亡的第二大主要原因[1]。尸檢研究發(fā)現(xiàn)，年齡<30歲的男性中有5%，>79歲的男性中有59%患有前列腺癌[2]。研究表明，前列腺癌與遺傳因素密切相關(guān)，且和人種、地區(qū)以及飲食等有一定相關(guān)性[3]。在中國(guó)，最近幾年前列腺癌的發(fā)病率一直在增加。盡管前列腺癌診斷治療方面取得了進(jìn)步，但患者的總生存率并未得到明顯提高。同多數(shù)癌癥一樣，其致癌機(jī)制仍未完全明了，其臨床病理上表現(xiàn)為異質(zhì)性多灶性疾病。因此，尋找前列腺癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵基因，對(duì)于患者的靶向治療頗具意義。VSTM2L基因在人類(lèi)基因組中的位置位于chr20:37 903 104～37 945 350，長(zhǎng)度為42 247bp，正常情況下主要表達(dá)于腦組織。有研究表明VSTM2L基因在結(jié)直腸癌及乳腺癌中表達(dá)上調(diào)[4-5]。Dorian R.A.Swarts等人使用基因表達(dá)譜分析探討肺類(lèi)癌進(jìn)展中涉及的途徑時(shí)證明VSTM2L基因低表達(dá)與患者預(yù)后正相關(guān)，但是其基因的功能及其通路沒(méi)有進(jìn)一步驗(yàn)證[6]。GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析表明VSTM2L基因在前列腺癌中表達(dá)值高于正常組織(P<0.05)。據(jù)我們所知在前列腺癌中尚沒(méi)有研究VSTM2L的文獻(xiàn)，關(guān)于VSTM2L在前列腺癌中的表達(dá)及意義知之甚少。因此，我們決定采用組織芯片結(jié)合免疫組織化學(xué)檢測(cè)前列腺癌中的VSTM2L蛋白，測(cè)定了前列腺正常組織、癌旁及癌組織中VSTM2L的蛋白表達(dá)，研究了前列腺癌組織中VSTM2L蛋白相對(duì)表達(dá)量與患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性，以探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前列腺癌組織芯片購(gòu)于上海芯超生物科技有限公司。組織芯片名稱(chēng)及編號(hào):前列腺癌組織芯片HProA100PG03，附贈(zèng)臨床病理資料及HE電子掃描圖片。芯片包括正常組織3例、癌旁組織2例及癌組織94例。篩選出進(jìn)行臨床病理相關(guān)性分析的合格例數(shù)92例，年齡56～96歲，中位年齡71歲。病理學(xué)上分化中等19例，分化差或未分化73例。淋巴結(jié)陰性者37例，陽(yáng)性者3例，其余52例淋巴結(jié)數(shù)據(jù)缺失。

1.2 免疫組化主要試劑 VSTM2L多克隆兔抗人抗體購(gòu)自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，貨號(hào)HPA043832，供應(yīng)商為Atlas Antibodies AB。UltraSensitive S-P免疫組化試劑盒，福州邁新。蘇木素，sigma aldrich。抗體稀釋液，Dako。

1.3 方法 步驟：將組織芯片放入烘箱中，溫度調(diào)至63℃，烘蠟1h。芯片烘烤完畢后，放入全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行脫蠟。使用DAKO 全自動(dòng)免疫組化預(yù)處理系統(tǒng)進(jìn)行抗原修復(fù)。芯片修復(fù)后用PBST緩沖液沖洗3次，1min/次；按試劑說(shuō)明稀釋度用抗體稀釋液稀釋為1∶100，滴加一抗，4℃冰箱過(guò)夜。室溫復(fù)溫30min，將片子用PBST緩沖液沖洗3次，1min/次。滴加生物素標(biāo)記二抗孵育10min，PBS沖洗3次， 3min/次。 除去PBS液，每張切片加1滴鏈霉菌抗生物素—過(guò)氧化物酶溶液室溫下孵育10min。PBS沖洗3次， 3min/次。滴加DAB 顯色液，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化，中性樹(shù)膠封片，置顯微鏡下觀(guān)察，Aperio掃描儀掃描組織芯片。

結(jié)果判定：使用Aperio ImageScope病理圖片查看軟件對(duì)每張病理組織切片在200倍放大下截取4張不同位置癌灶圖片，采用image pro plus 6.0圖像分析軟件分析每張圖片選定癌灶的平均光密度值,再以4張圖片平均光密度值的平均值作為每張病理切片VSTM2L蛋白最終相對(duì)表達(dá)量。在結(jié)果認(rèn)定中，小于中位數(shù)視為低表達(dá)，大于中位數(shù)視為高表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 VSTM2L蛋白在前列腺正常組織、癌旁及癌組織中的表達(dá)水平 組織芯片HE染色及VSTM2L免疫組化整體掃面結(jié)果(見(jiàn)圖1)。VSTM2L蛋白在3例前列腺正常組織，2例癌旁及94例癌組織中均有表達(dá)，正常組織表達(dá)弱陽(yáng)性，主要位于腺體細(xì)胞質(zhì)中，癌旁組織表達(dá)中等陽(yáng)性，主要位于腺體細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及部分間質(zhì)組織中，癌組織表達(dá)量顯著高于正常組織及癌旁組織，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜或部分細(xì)胞核中的棕黃色染色，多數(shù)病例間質(zhì)染色。但三組間平均表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見(jiàn)圖2、3)。

圖1 HProA100PG03組織芯片HE及VSTM2L

2.2 VSTM2L蛋白在前列腺癌組織中的表達(dá)與臨床病理變量的關(guān)系 相對(duì)于中位數(shù)，VSTM2L蛋白免疫組化表達(dá)量被分類(lèi)為低或高。為進(jìn)一步研究VSTM2L，本研究分析了VSTM2L蛋白表達(dá)狀態(tài)與常用臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。前列腺癌組織中VSTM2L蛋白表達(dá)與前列腺癌患者Gleason評(píng)分、年齡、病理分級(jí)相關(guān)(P<0.05)，但是VSTM2L蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P>0.05)，見(jiàn)表1。

圖2 各組織中VSTM2L蛋白表達(dá)情況 (SP×200)

A:正常前列腺組織 B:前列腺癌旁組織 C:前列腺癌組織

圖3 VSTM2L蛋白在前列腺良惡性組織中的表達(dá)

表1 VSTM2L蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

Lara Rossini等人在研究神經(jīng)保護(hù)劑Humanin(HN)細(xì)胞毒性和在神經(jīng)毒性損傷具有保護(hù)活性中，描述了一種新的HN神經(jīng)保護(hù)活性調(diào)節(jié)劑的鑒定(VSTM2L)，以前稱(chēng)C20orf102[7]。VSTM2L在酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與HN相互作用，在培養(yǎng)的細(xì)胞中分泌，存在于血清中，并在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中選擇性表達(dá)[7]。VSTM2L基因在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)GSE803芯片正常前列腺組織本底表達(dá)量相對(duì)于其他正常組織處于中等水平[8]。最新發(fā)表于BMC Bioinformatics的文章整合利用微陣列和RNA-Seq技術(shù)獲得來(lái)自不同乳腺癌數(shù)據(jù)集的異質(zhì)癌細(xì)胞系，證實(shí)了所獲得的基因組作為乳腺癌可能的生物標(biāo)志物的有效性，通過(guò)特征選擇過(guò)程，由六個(gè)基因組成的最終小子集被考慮用于乳腺癌診斷，前6位表達(dá)基因分別為SFRP1、GSTM3、SULT1E1、MB、TRIM29、VSTM2L，這些基因與它們參與乳腺癌之間的關(guān)系中，前五個(gè)基因以前被報(bào)道為乳腺癌中的基因，雖然在乳腺癌組織中檢測(cè)到VSTM2L，但迄今為止，其表達(dá)與目前文獻(xiàn)中的乳腺癌發(fā)展關(guān)系仍有待證實(shí)[9]。2012年葡萄牙腫瘤研究所領(lǐng)銜的研究原發(fā)性前列腺癌不同ETS重排的特異性和共有靶基因時(shí)，使用表達(dá)陣列數(shù)據(jù)鑒定出ETV1陽(yáng)性前列腺癌中包括VSTM2L基因在內(nèi)的15個(gè)靶基因特異性失調(diào)[10]。

據(jù)我們所知，這是首次研究VSTM2L與前列腺癌之間關(guān)聯(lián)性的文章。本研究的主要發(fā)現(xiàn)有如下兩點(diǎn)：首先，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，與前列腺正常及癌旁組織相比，前列腺癌組織中的VSTM2L蛋白表達(dá)上調(diào)，但由于前列腺正常及癌旁組織樣本量太小，代表性較差，統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在偏倚，與GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)VSTM2L基因表達(dá)結(jié)果存在差異，仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量；第二，這是描述VSTM2L蛋白對(duì)前列腺癌患者Gleason評(píng)分、病理分化等級(jí)意義的第一份報(bào)告。VSTM2L蛋白高表達(dá)與前列腺癌患者Gleason評(píng)分、病理分化和年齡之間存在相關(guān)性。不過(guò)由于組織芯片詳細(xì)資料缺少T分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期情況、生存資料，因此未能進(jìn)行更詳細(xì)的臨床相關(guān)性及評(píng)估對(duì)患者生存期的影響。VSTM2L在前列腺癌中的高表達(dá)暗示其有促腫瘤作用、與不良預(yù)后可能有關(guān)，可能作為前列腺癌的潛在治療靶點(diǎn)。但前列腺癌中VSTM2L表達(dá)改變的確切分子機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的體外和動(dòng)物研究以驗(yàn)證前列腺癌發(fā)生發(fā)展中VSTM2L表達(dá)改變的真正分子機(jī)制。