盧霞　鄧志軍　劉夢(mèng)華　趙玉虎　司龍亭　李文虎　阿門

摘要：辣椒是世界上重要的蔬菜作物之一，基因組簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）標(biāo)記的開發(fā)對(duì)于辣椒分子育種和雜交種子純度檢測(cè)具有重要意義。為了檢測(cè)辣椒品種綠隴3號(hào)雜交種子的純度，基于辣椒全基因組序列開發(fā)了75對(duì)SSR標(biāo)記。結(jié)果表明，只有SSR標(biāo)記p50對(duì)父母本的擴(kuò)增結(jié)果表現(xiàn)為帶型清晰、共顯性，且具有高多態(tài)性，可進(jìn)一步用于雜交種的純度檢測(cè)。為了確保標(biāo)記p50的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)其PCR產(chǎn)物進(jìn)行了進(jìn)一步測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，在父母本中分別擴(kuò)增出了251、293 bp的序列。用標(biāo)記p50對(duì)綠隴3號(hào)辣椒進(jìn)行純度檢測(cè)，結(jié)果顯示，種子純度為100%，鑒定結(jié)果與田間純度一致。新SSR 分子標(biāo)記的開發(fā)，為辣椒雜交種子純度的鑒定提供了參考，也為辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子育種研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：辣椒;SSR;分子標(biāo)記;種子純度鑒定

中圖分類號(hào)： S641.303文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）07-0065-04

辣椒（Capsicum annuum L.）屬于茄科（Solanaceae）辣椒屬（Capsicum），是我國的主要蔬菜作物之一，既可鮮食，又是重要的調(diào)料。辣椒品種的好壞對(duì)其產(chǎn)量及品質(zhì)均有直接而明顯的影響，因而辣椒新品種的選育至關(guān)重要。利用雜種優(yōu)勢(shì)選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的雜交種，是辣椒育種中行之有效的途徑。目前，我國辣椒生產(chǎn)已經(jīng)廣泛使用雜交種，但是在實(shí)際制種過程中，由于人工去雄不及時(shí)、外來花粉干擾、母本自交、機(jī)械混雜等均影響了種子純度，因此，為了保證辣椒種子的質(zhì)量，純度鑒定是種子銷售中不可或缺的重要步驟[1]。在傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)角度，辣椒種子的純度鑒定主要依賴于果型、株型、絨毛等田間表型，其檢測(cè)周期長、用地多，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工，而且易受環(huán)境因素的影響，難以滿足當(dāng)年的生產(chǎn)需求。

近年來，分子生物學(xué)的發(fā)展使種子純度鑒定進(jìn)入基因水平。用分子標(biāo)記鑒定種子純度采用電泳方法檢測(cè)基因組DNA的結(jié)構(gòu)與組成，通過分析DNA水平上的差異來檢驗(yàn)品種純度與真實(shí)性，其遺傳性穩(wěn)定、多態(tài)性高，不受發(fā)育階段、取材部位等環(huán)境因素的制約，目前DNA分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于辣椒、番茄、茄子、黃瓜、西葫蘆、西瓜等主要蔬菜作物的鑒定與純度檢測(cè)中[2-8]。目前，在利用DNA分子標(biāo)記檢測(cè)辣椒種子純度方面已有部分研究，劉子記等對(duì)辣椒雜交種簡單重復(fù)序列（simple sequence repeats，簡稱SSR）分子標(biāo)記鑒定結(jié)果及表型鑒定結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果表明，篩選出的SSR分子標(biāo)記可用于熱辣3號(hào)雜交種純度的快速鑒定[9];張曼用篩選出的標(biāo)記CA885分別對(duì)2份辣椒品種F1代雜交種的96株單株進(jìn)行純度檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與田間鑒定結(jié)果一致[10]。辣椒全基因組測(cè)序的完成[11-13]，不僅有助于了解辣椒基因組的結(jié)構(gòu)與功能，而且對(duì)于辣椒SSR位點(diǎn)的開發(fā)、加速辣椒育種進(jìn)程都有重要的指導(dǎo)作用。隨著更多辣椒SSR位點(diǎn)得到開發(fā)及研究應(yīng)用，有望進(jìn)一步推動(dòng)SSR標(biāo)記在種子純度檢驗(yàn)、遺傳育種中的應(yīng)用[14]。

本研究以江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司選育的辣椒品種綠隴3號(hào)為試驗(yàn)材料，基于辣椒基因組序列，設(shè)計(jì)開發(fā)了1批SSR引物，篩選其中具有多態(tài)性、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的SSR引物，對(duì)綠隴3號(hào)雜交種子進(jìn)行分子純度鑒定，初步建立辣椒雜交種種子室內(nèi)純度鑒定的SSR體系，以期為辣椒雜交種子的純度鑒定及品種遺傳多樣性分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用辣椒品種購自江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，以綠隴3號(hào)的F1代及母本、父本種子作為試驗(yàn)材料，取144粒F1代種子、各12粒父母本種子播在穴盤中，在育苗棚中育苗，待長出第1張真葉時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 基因組DNA的提取與檢測(cè)

辣椒基因組DNA的提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，簡稱CTAB）法[15]。取30 mg幼嫩葉片放入2 mL離心管中，加入1個(gè)直徑為4 mm的鋼珠，蓋緊蓋子后將其放入液氮中90 s，然后用組織研磨儀磨樣;在磨好的樣中加入600 μL三氯甲烷CTAB緩沖液，55 ℃水浴20 min;12 000 r/min離心1 min，吸取400 μL 上清于干凈的1.5 mL離心管中，加入350 μL體積比為24 ∶[KG-*3]1的三氯甲烷-異戊醇溶液，充分混勻;12 000 r/min離心1 min，取300 μL上清于另1個(gè)干凈的1.5 mL離心管中，加入500 μL無水乙醇（提前于-20 ℃預(yù)冷）與50 μL乙酸銨，混勻，于-20 ℃冰箱放置2 h;13 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，將離心管放置于室溫條件下;待離心管中無乙醇味時(shí)，加入100 μL ddH2O溶解DNA。分別用超微量紫外可見分光光度計(jì)與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提DNA的濃度與質(zhì)量。

1.3 SSR分子標(biāo)記的開發(fā)

從茄科基因組數(shù)據(jù)庫（Sol Genomics Network）中下載辣椒的全基因組序列，通過Pilot Edit軟件與SSR搜索工具SSR Hunter軟件在基因組序列中有目的地搜索包含SSR位點(diǎn)的序列，以二、三、四、五、六核苷酸基序（motif）的最少重復(fù)次數(shù)在10次以上作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行SSR位點(diǎn)序列的選擇。用Primer 5設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)參數(shù)如下：引物長度為18～30 bp，最適長度為22 bp，正反引物的長度相差不超過3 bp，退火溫度為50～60 ℃，GC含量在40%左右，PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為100～300 bp。引物由浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增與檢測(cè)

PCR采用15 μL體系，包含1 μL DNA模板、7.5 μL Taq Mix、各1 μL正反向引物、4.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 變性60 s，58 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃ 延伸2 min，16 ℃終止反應(yīng)。

擴(kuò)增完成后，將擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳，電泳完成后，進(jìn)行硝酸銀溶液染色、氫氧化鈉甲醛溶液顯色。在自然光下，對(duì)每對(duì)引物擴(kuò)增出來的條帶進(jìn)行判斷，當(dāng)某對(duì)引物的擴(kuò)增條帶在父母本中具有多態(tài)性，并在F1代中同時(shí)顯示出父母本的特征條帶時(shí)，則確定該引物可用于純度鑒定，否則表明該引物不適合用于鑒定雜交種的純度。

1.5 SSR標(biāo)記的克隆與測(cè)序

為了驗(yàn)證所選標(biāo)記片段的大小，對(duì)父母本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，然后連接至pMD19-T載體上，送至浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物的篩選

利用筆者所在公司自主開發(fā)的75對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)辣椒品種綠隴3號(hào)及其父母本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。由圖1可以看出，標(biāo)記p50在綠隴3號(hào)父母本中都能擴(kuò)增出清晰的條帶，且在綠隴3號(hào)中表現(xiàn)為父母本帶型互補(bǔ)的條帶。重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明，標(biāo)記p50擴(kuò)增的帶型穩(wěn)定、多態(tài)性高，且為共顯性標(biāo)記。

2.2 新開發(fā)標(biāo)記p50的序列信息及相應(yīng)測(cè)序結(jié)果

2.2.1 標(biāo)記p50的序列信息 以栽培辣椒品種Zunla-1全基因組序列開發(fā)的標(biāo)記p50的序列信息見表1。

2.2.2 標(biāo)記p50擴(kuò)增DNA的測(cè)序結(jié)果 為了在分子水平上確定所選SSR標(biāo)記的準(zhǔn)確性與可靠性，對(duì)用標(biāo)記p50擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行了測(cè)序。由圖2的測(cè)序結(jié)果看出，綠隴3號(hào)父母本存在42 bp的序列差異，在其母本中擴(kuò)增出了293 bp的序列，而在其父本中擴(kuò)增出了251 bp的序列，父母本對(duì)應(yīng)的差異序列為（GAG）1與（AAG）13。該結(jié)果與聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果完全一致，因此，本試驗(yàn)選用標(biāo)記p50來鑒定綠隴3號(hào)辣椒的種子純度。

2.3 雜交種綠隴3號(hào)的純度鑒定

隨機(jī)選取144粒綠隴3號(hào)的種子，在育苗棚中育苗后，提取其葉片基因組DNA，并以標(biāo)記p50作為引物進(jìn)行SSR擴(kuò)增，檢測(cè)辣椒綠隴3號(hào)的純度。結(jié)果表明，綠隴3號(hào)所有種子均呈父母本互補(bǔ)帶型（圖3），雜交種子的純度達(dá)到100%。進(jìn)行大田種植后，根據(jù)植株的表型鑒定結(jié)果，在136株綠隴3號(hào)群體中，有2株的表型表現(xiàn)與親本一致，田間鑒定得到的種子純度為98.5%，與分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果基本一致。

3 討論

種子純度鑒定是商業(yè)育種中必不可少的重要步驟，是衡量種子質(zhì)量的關(guān)鍵。辣椒是我國的重要蔬菜作物之一，每年通過傳統(tǒng)的田間試驗(yàn)來鑒定其純度雖然有效，但是效率太低，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且易受外界環(huán)境因素的影響。而利用分子標(biāo)記技術(shù)，可以快速高效地完成種子純度鑒定，不但節(jié)約了種子公司的成本，為市場(chǎng)提供了優(yōu)質(zhì)種子，還對(duì)我國的辣椒育種具有重要的指導(dǎo)意義[1]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)成為作物品種真實(shí)性和純度鑒定的發(fā)展方向。目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在蔬菜作物品種鑒定與純度檢測(cè)方面已得到了廣泛應(yīng)用。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)辣椒全基因組測(cè)序的完成，為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了新途徑，使引物開發(fā)費(fèi)用逐漸降低[11，13]，更多的辣椒SSR位點(diǎn)被開發(fā)，將進(jìn)一步推動(dòng)SSR標(biāo)記在種子純度檢驗(yàn)、遺傳育種及其他研究領(lǐng)域中的應(yīng)用。

本研究基于栽培辣椒品種Zunla-1全基因組序列信息，開展了辣椒SSR位點(diǎn)的挖掘與設(shè)計(jì)，開發(fā)了75對(duì)SSR引物，并篩選出了1對(duì)特異性條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)、便于識(shí)別、方便對(duì)辣椒雜交種綠隴3號(hào)進(jìn)行種子純度分析的SSR引物p50。新開發(fā)的標(biāo)記p50在基因組中的起始位點(diǎn)為第606399 bp，重復(fù)單元為AAG，重復(fù)了26次。但是有趣的是，對(duì)綠隴3號(hào)親本的測(cè)序結(jié)果顯示，雙親存在42 bp的序列差異，且母本序列比基因組參考序列多12個(gè)GAA與1個(gè)GAG序列，而父本序列較參考序列少1個(gè)GAA序列，這與p50的重復(fù)單元及數(shù)量并不相同，表明GAG可能是1個(gè)高變異位點(diǎn)，因而在不同辣椒品種中的存在模式有差異。本研究結(jié)果可用于親緣關(guān)系較近的種質(zhì)資源遺傳分析研究。

本研究用標(biāo)記p50對(duì)綠隴3號(hào)及其父母本進(jìn)行SSR擴(kuò)增后，能夠準(zhǔn)確地將父母本、雜交種及假雜種區(qū)分開來，綠隴3號(hào)種子的純度為100%，與田間表型鑒定的結(jié)果高度一致。為了確保鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，對(duì)綠隴3號(hào)父母本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后，在母本中檢測(cè)出了293 bp的序列，在父本中檢測(cè)出了251 bp的序列，該測(cè)序結(jié)果與電泳結(jié)果完全一致，表明新開發(fā)的標(biāo)記p50符合綠隴3號(hào)的DNA特點(diǎn)，篩選出的引物針對(duì)性強(qiáng)，適用于綠隴3號(hào)辣椒雜交種純度的鑒定。綜合分析可知，本研究結(jié)果為親緣關(guān)系較近的辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子標(biāo)記輔助育種研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]白占兵，李雪峰，戴雄澤. 利用SSR分子標(biāo)記建立辣椒純度鑒定體系[J]. 辣椒雜志，2010（1）：32-34.

[2]王 飛，姚明華，尹延旭，等. 辣椒SSR多態(tài)性引物的篩選及品種純度鑒定[C]//中國園藝學(xué)會(huì).中國園藝學(xué)會(huì)2017年論文摘要集. 2017：126.

[3]盧國強(qiáng)，盧海林，潘學(xué)春，等. 辣椒品種鎮(zhèn)研22種子純度的SSR分子比較鑒定[J]. 辣椒雜志，2017（2）：33-35.

[4]張錄霞，甘中祥，李倍金，等. 利用InDel標(biāo)記鑒定加工番茄雜交種純度[J]. 分子植物育種，2016，14（6）：1533-1537.

[5]劉 軍，周曉慧，莊 勇. 茄子雜交品種種子純度的SSR分子標(biāo)記鑒定[J]. 分子植物育種，2013，11（6）：790-794.

[6]周勝軍，張 鵬，朱育強(qiáng)，等. 黃瓜‘浙秀1號(hào)種子純度的SSR鑒定[J]. 分子植物育種，2013，11（5）：557-561.

[7]林春晶，張春寶，董英山. DNA分子標(biāo)記在作物雜交種純度鑒定中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2015，13（3）：702-710.

[8]李超漢，劉 莉，劉 翔，等. 基于SSR標(biāo)記的5個(gè)西瓜新品種純度鑒定及特異性分析的研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（33）：177-185.

[9]劉子記，李靜婷，楊 衍，等. 辣椒雜交種SSR分子標(biāo)記鑒定及表型比較分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2014，29（1）：69-72.

[10]張 曼. 基于分子標(biāo)記的辣椒雜交種真實(shí)性和純度的檢驗(yàn)[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[11]Qin C，Yu C S，Shen Y，et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization[J]. PNAS，2014，111（14）：5135-5140.

[12]Lee J M，Nahm S H，Kim Y M，et al. Characterization and molecular genetic mapping of microsatelliite loci in pepper[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108（4）：619-627.

[13]Kim S，Park M，Yeom S I，et al. Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species[J]. Nature Genetics，2014，46（3）：270-278.

[14]杜培粉. 14個(gè)辣椒雜交種純度鑒定的SSR引物篩選[J]. 長江蔬菜，2017（14）：46-49.

[15]Aljanabi S M，Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（22）：4692-4693.