肖穎 袁曉 林順權

中圖分類號 R927 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）10-1217-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.10.12

摘 要 目的：檢測頭孢丙烯干混懸劑中的未知雜質，并對其進行結構鑒定。方法：采用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質譜法檢測并鑒定頭孢丙烯干混懸劑中的未知雜質。色譜柱為Thermo HyPURITYTM? C18，流動相為乙腈-0.013%甲酸水溶液（梯度洗脫），檢測波長為230 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為40 ℃，進樣量為20 μL;以電噴霧離子源行正離子全掃描，掃描范圍為質荷比（m/z）100～1 500，噴霧電壓為3.8 kV，金屬毛細管溫度為320 ℃，鞘氣壓力為60 Arb，輔助氣壓力為10 Arb，噴霧溫度為280 ℃。結果：在該色譜條件下，雜質K的檢測限為0.202 μg/mL，精密度、重復性試驗的RSD均小于4%。雜質K附近發(fā)現(xiàn)3個未知雜質，且互為異構體，離子保留時間為17.83～19.31 min，二級母離子均為m/z 436.150 0[M+H]+，可能為頭孢丙烯開環(huán)、脫水后的產物。結論：本方法檢測出頭孢丙烯干混懸劑中雜質K附近的3個未知雜質。

關鍵詞 高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質譜法;頭孢丙烯干混懸劑;雜質K;未知雜質

Identification of Unknown Impurities in Cefprozil Suspension by LC-HR-MS/MS

XIAO Ying1，YUAN Xiao2，LIN Shunquan2（1.Baiyunshan? Pharmaceutical? General? Factory， Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Holdings Co.， Ltd.， Guangzhou 510515， China;2.Guangzhou PI & PI Biotechnology Co.， Ltd.， Guangzhou 510530， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To determine unknown impurities in Cefprozil suspension， and to identify its structure. METHODS： LC-HR-MS/MS method was used to detect and identify unknown impurities in Cefprozil suspension. The determination was performed on Thermo HyPURITYTM? C18 with mobile phase consisted of acetonitrile-0.013% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 230 nm， and column temperature was 40 ℃. The sample size was 20 μL. ESI+ full scanning was carried out with electrospray ion source scanning range was mass-charge ratio （m/z） 100-1 500 with spray voltage of 3.8 kV， metal capillary temperature of 320 ℃， sheath gas pressure of 60 Arb， auxiliary gas pressure of 10 Arb， spray temperature of 280 ℃. RESULTS： Under this condition， the detection limit of impurity K was 0.202 μg/mL. RSDs of precision and reproducibility tests were both lower than 4%. Three unknown impurities were found around impurity K， which were isomers of each other. The retention time of ions were 17.83-19.31 min， and the secondary parent ion were all m/z 436.150 0[M+H]+， which may be the product of ring opening and dehydration of cefpropene. CONCLUSIONS： Three unknown impurities near impurity K in Cefprozil suspension were detected by this method.

KEYWORDS? ?LC-HR-MS/MS; Determination; Cefprozil suspension; Impurity K; Unknown impurities

頭孢丙烯是由美國Bristol-Myers Squibb公司于1983年開發(fā)的第2代頭孢菌素口服制劑[1-2]，于1992年以“Cefzil”的商品名在美國首次上市，其對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均表現(xiàn)出良好的抑制活性，且安全性高、毒副作用小[3]。頭孢丙烯對細菌感染的療效與阿莫西林克拉維酸、紅霉素、頭孢克肟相似且優(yōu)于或等于同為第2代頭孢菌素的頭孢克洛和頭孢呋辛酯[4]。

頭孢丙烯是美國FDA批準的第1個可用于治療兒童中耳炎和鼻竇炎的口服頭孢菌素類抗生素，目前該藥已知的特定雜質包括雜質A（α-對羥基苯甘氨酸）、雜質B（頭孢羥氨芐）、雜質D、 雜質G、雜質H、雜質I、雜質M，其他非特定雜質C、雜質E、雜質F、雜質J、雜質K、雜質L、雜質N[5]。有研究報道，頭孢丙烯結構中含有β-內酰胺環(huán)，所以其在水或酸性溶液等情況下易發(fā)生水解開環(huán)而失去抗菌活性[6]。

頭孢丙烯干混懸劑為兒童用藥劑型，加入的輔料相較片劑更多，制劑受輔料影響也較大，因而制劑中仍有一些未知的雜質。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在某廠生產的頭孢丙烯干混懸劑中，在雜質K色譜峰附近還有其他未知的雜質，且這些雜質在貯存過程中還會逐漸增加。

目前，液質聯(lián)用技術（LC-MS）[7]在各類藥物的雜質分析中已被廣泛應用[8-12]，尤其是抗生素類如β-內酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、大環(huán)內酯類、喹諾酮類等藥物的雜質分析[13]。本文采用高效液相色譜-串聯(lián)高分辨質譜法（LC-HR-MS/MS）定性研究了頭孢丙烯干混懸劑中雜質K附近的未知雜質，并進行結構鑒定，旨在為頭孢丙烯干混懸劑生產中的雜質控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Q-Exactive Focus型高分辨質譜儀、Dionex UltiMate 3000 RS型超高效液相色譜（UPLC）儀（包括四元泵洗脫系統(tǒng)、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;1260型HPLC儀（美國Agbilent公司）;AR2140型分析天平（上海奧豪斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

頭孢丙烯干混懸劑（批號：02180802，規(guī)格：0.125 g）及其空白輔料均由廣州白云山醫(yī)藥集團股份有限公司白云山制藥總廠提供;頭孢丙烯雜質K標準品[廣州牌牌生物科技有限公司，批號：PITBBX-K-EP-20181017-01，純度：96.64%（以4個異構體的總和計）];乙腈、甲酸均為質譜純，磷酸二氫銨為分析純，其余試劑均為分析純，水為自制純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 雜質K對照品溶液 精密稱取頭孢丙烯雜質K標準品適量，用水配制成質量濃度為0.02 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取頭孢丙烯干混懸劑100 mg，溶于水5 mL中，超聲（功率：360 W，頻率：40 kHz，下同）使溶解，濾過，取濾液，即得。

2.1.3 空白輔料溶液 精密稱取頭孢丙烯干混懸劑空白輔料1.97 g，溶于水5 mL中，超聲使溶解，濾過，即得。

2.2 色譜與質譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo HyPURITYTM C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A）-0.013%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）;檢測波長：230 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：40 ℃;進樣量：20 μL。

2.2.2 質譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描;掃描模式：全掃描;掃描范圍：質荷比（m/z）100～1 500;噴霧電壓：3.8 kV;金屬毛細管溫度：320 ℃;鞘氣壓力：60 Arb;輔助氣壓力：10 Arb;噴霧溫度：280 ℃;相對碰撞能（NCE）：10、20、30。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 精密量取“2.1”項下雜質K對照品溶液、空白輔料溶液和供試品溶液各20 μL，按“2.2”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。另對頭孢丙烯干混懸劑進行高溫（以水溶解，60 ℃水浴2 h）、酸（以0.1 mol/L鹽酸溶液溶解，60 ℃水浴6 h）、堿（以0.08 mol/L氫氧化鈉溶液溶解，室溫靜置1 h）、氧化（以1%過氧化氫溶液溶解，室溫靜置1 h）、光照（以水溶解，4 500 lx光照18 h）破壞后，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，再按“2.2”項下條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，空白輔料對頭孢丙烯2個主峰（異構體Z、E）測定均無干擾;頭孢丙烯干混懸劑經高溫、酸、堿、氧化、光照破壞后也均無明顯降解。色譜圖見圖1（圖中，1～6號峰依次為頭孢丙烯異構體Z、頭孢丙烯異構體E、雜質K1、雜質K2、雜質K3、雜質K4，下同）。

2.3.2 檢測限考察 精密稱取頭孢丙烯雜質K標準品適量，用流動相A配制成質量濃度為500 μg/mL的貯備液;將上述貯備液用流動相A逐級稀釋，按“2.2”項下條件分別進樣測定，計算能被檢測出的雜質K的最低質量濃度，即為檢測限。結果，當信噪比為3.1 ∶ 1時得雜質K的檢測限為0.202 μg/mL。

2.3.3 精密度試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份，使用不同的儀器于2日內，按“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積。結果，12次測得的峰面積的RSD為3.90%，表明本方法精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積，按外標法計算雜質K的含量。結果，含量的RSD為3.70%（n=6），表明本方法重復性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗 將雜質K對照品溶液分別在室溫放置0、1、2、4、6、8 h時按“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積。結果，各時間點峰面積的RSD為0.98%～1.02%（n=6）。

2.4 未知雜質的結構鑒定

2.4.1 LC-HR-MS檢測 分別取雜質K對照品溶液、供試品溶液，以及供試品溶液與雜質K對照品溶液的混合溶液（混合體積比約為20 ∶ 1），按“2.2”項下條件進行LC-HR- MS測定，結果見表2～表4，LC-HR-MS圖見圖2～圖4（圖中，7～9號峰依次為雜質Z1、雜質Z2、雜質Z3，下同）。

通過對比LC-HR-MS檢測結果發(fā)現(xiàn)，頭孢丙烯雜質K對照品（4個異構體，分別命名為K1、K2、K3、K4）與供試品中4個未知雜質保留時間和準分子離子基本一致。另外，供試品中還發(fā)現(xiàn)了3個未知雜質，保留時間分別為17.75、18.60、19.23 min，其準分子離子基本相同，推測其互為異構體，統(tǒng)稱為雜質Z（分別命名為Z1、Z2、Z3）;再根據準分子離子，推測雜質Z可能為頭孢丙烯開環(huán)乙酯。

2.4.2 LC-HR-MS/MS二級裂解檢測 為進一步確認雜質K和雜質Z的結構，按“2.2”項下條件對供試品溶液進行LC-HR-MS/MS二級裂解，雜質Z1、Z2、Z3的LC-HR-MS/MS圖見圖5，雜質K和雜質Z1、Z2、Z3的LC-HR-MS/MS檢測結果見表5，分析結果見表6。

“2.2”項條件下，雜質K的二級母離子m/z約為 390[M+H]+，故其相對分子量為389，與頭孢丙烯相同，提示兩者可能互為異構體，推測雜質K為頭孢丙烯四元環(huán)水解再與7位側鏈氨基脫水合環(huán)，3位側鏈雙鍵發(fā)生水合與2位羧基脫水酯化后所得的化合物，其實測準分子離子與理論準分子離子誤差小于5 ppm，結合二級質譜碎片信息，確定雜質K結構。雜質K二級質譜裂解途徑見圖6，結構見圖7。

在“2.2”項條件下，雜質Z的二級母離子m/z約為436[M+H]+，故其相對分子量為435，與頭孢丙烯分子量差46，多1個乙醇分子量，推測雜質Z為頭孢丙烯四元環(huán)水解開環(huán)與乙醇發(fā)生酯化所得的化合物，其實測準分子離子與理論準分子離子誤差小于5 ppm，結合二級質譜碎片信息，確定雜質Z結構。雜質Z二級質譜裂解路徑見圖8，結構見圖9。

3 討論

本研究以頭孢丙烯雜質K為對象，采用LC-HR- MS/MS法對頭孢丙烯干混懸劑中的雜質K及其附近的未知雜質進行了定性研究，并進行了方法學驗證。結果顯示，這些雜質為雜質Z，包含Z1、Z2、Z3，互為異構體。本文前期研究結果顯示，雜質K（含K1、K2、K3、K4，互為異構體）為頭孢丙烯干混懸劑在長期貯存條件下降解產生，雜質Z（含Z1、Z2、Z3）推測為頭孢丙烯干混懸劑中頭孢丙烯受輔料的影響，在放置過程中頭孢丙烯開環(huán)并脫水所得。干混懸劑及混懸劑由于加入的輔料種類比較多，因此這一類劑型設計處方時，應充分考慮輔料與原料的相容性，了解并考察在產品的放置過程中其雜質的降解與產生過程，合理設計處方。

綜上所述，本文定性研究了頭孢丙烯干混懸劑中的雜質K、雜質Z，可為頭孢丙烯干混懸劑生產中的雜質控制提供參考。

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（收稿日期：2019-12-10 修回日期：2020-03-20）

（編輯：鄒麗娟）