賡迪，龐月笙，陶志，王莎，劉曉璇，王如峰

北京中醫(yī)藥大學 生命科學學院，北京 102488

近期流行的新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是烈性傳染病之一，被世界衛(wèi)生組織(WHO)定性為“國際關(guān)注的突發(fā)公共衛(wèi)生事件”[1]，對人類健康造成了極大危害。COVID-19的病原體是一種新型冠狀病毒，WHO將其命名為2019 novel coronavirus(2019-nCoV)，國際病毒分類委員會將其命名為severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)。當前，在全國人民的共同努力下，疫情得到了有效控制，中醫(yī)藥在此次與2019-nCoV的斗爭中發(fā)揮了積極作用。在國家衛(wèi)生健康委員會公布的新冠肺炎診療方案中高度重視中醫(yī)藥的應用，并在中醫(yī)治療部分建議：可根據(jù)病情、當?shù)貧夂蛱攸c以及不同體質(zhì)等情況，進行辨證論治[2]。

金蓮花湯是2003年非典型肺炎(SARS)流行期間采用的防治處方之一。該方由金蓮花6 g、蒲公英15 g、大青葉10 g、葛根10 g、蘇葉6 g組成，水煎服[3-4]。全方有清熱解毒、散風透邪的功效，適用于“瘟疫”的預防或治療。中醫(yī)所稱的“瘟疫”是指具有強烈傳染性和流行性的一類疾病，西醫(yī)所稱的SARS、流行性感冒應該包含在其中。COVID-19也屬于中醫(yī)“瘟疫”的范疇，被命名為“肺瘟”[5]。金蓮花湯以清熱解毒藥為主，含有抗病毒活性成分[6-11]。前期研究證明，金蓮花湯具有顯著的抗H1N1流感病毒作用[12-13]，并且其中某些成分可通過作用于Toll樣受體3、4、7(TLR3、TLR4、TLR7)信號通路減少炎癥因子白細胞介素1(IL-1)、白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、一氧化氮(NO)的分泌，從而緩解病毒引起的“細胞因子風暴”[14]。本研究還對金蓮花湯的化學成分進行了研究[15-16]，發(fā)現(xiàn)其主要化學成分為黃酮類、酚酸類、生物堿類，其中黃酮類含量最高，酚酸類次之，生物堿類含量較少。為了進一步探討金蓮花湯抗2019-nCoV的潛力，本研究利用分子對接技術(shù)，以2019-nCoV水解酶Mpro蛋白為靶點，對金蓮花湯中的27種主要成分進行了虛擬篩選。

1 材料

Autodock[17]軟件是用于分子對接的開源程序，Autodock 1.5.6用于分子預處理，Autodock vina1.1.2用于分子對接。Mpro蛋白的結(jié)構(gòu)信息來源于RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org)。金蓮花湯中27種化合物的結(jié)構(gòu)信息來源于Pubchem(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫，數(shù)據(jù)庫中無結(jié)構(gòu)式信息的化合物利用ChemDraw Ultra 8.0自行繪制。

2 方法

2.1 結(jié)構(gòu)預處理

在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載Mpro蛋白晶體結(jié)構(gòu)(編號為6LU7)，用Autodock1.5.6軟件進行刪除水分子、加氫以及元素的電荷分配處理，處理結(jié)果保存為pdbqt格式文件。在Pubchem數(shù)據(jù)庫中搜索并下載金蓮花湯中22種化合物的結(jié)構(gòu)，蘆丁(CID：5280805)、木犀草苷(CID：5280637)、山柰酚(CID：5280863)、染料木苷(CID：5281377)、芹菜素(CID：5280443)、野黃芩苷(CID：185617)、葒草素(CID：5281675)、大豆苷(CID：107971)、牡荊素(CID：5280441)、3′-羥基葛根素(CID：5748205)、葛根素(CID：5281807)、大豆苷元(CID：5281708)、3′-甲氧基葛根素(CID：5319485)、2″-O-β-L-葒草素半乳糖苷(CID：44257952)、迷迭香酸(CID：5281792)、金蓮酸(CID：6451636)、咖啡酸(CID：689043)、原兒茶酸(CID：72)、阿魏酸(CID：445858)、藜蘆酸(CID：7121)、靛玉紅(CID：10177)、金蓮花堿(CID：11160309)。金蓮花苷、金蓮花碳苷Ⅰ、2″-O-(2?-甲基丁?；?異當藥黃素、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、藜蘆酸葡萄糖酯5種化合物的結(jié)構(gòu)式用ChemDraw Ultra 8.0繪制。陽性對照選取蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中6LU7蛋白自帶抑制劑N-[(5-methylisoxazol-3-yl)carbonyl]alanyl-L-valyl-N1-((1R，2Z)-4-(benzyloxy)-4-oxo-1-{[(3R)-2-oxopyrrolidin-3-yl]methyl}but-2-enyl)-L-leucinamide(N3)。將所有化合物結(jié)構(gòu)用ChemBio3D Ultra 14.0轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)并用MMFF94力場進行優(yōu)化，然后使用Autodock Tools 1.5.6[18-19]將其保存為pdbqt格式文件。

2.2 分子對接

根據(jù)原配體N3的位置，確定Mpro活性位點的坐標為center_x=-10.636，center_y=12.346，center_z=68.207；size_x=25，size_y=25，size_z=25。為了增加計算的準確度，將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20。除了特別說明，其他參數(shù)均采用默認值。最后，選取打分值最高的構(gòu)象和原配體的構(gòu)象進行比較并計算均方根偏差(RMSD)。通過Autodock vina 1.1.2運算得到金蓮花湯中27種化合物與Mpro蛋白質(zhì)的對接結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 Mpro蛋白與抑制劑N3的對接結(jié)果

由圖1可見，對接前后的構(gòu)象一致，RMSD=1.821 7 ?，<2 ?說明對接方法與參數(shù)設(shè)置合理。Mpro蛋白晶體與其原配體N3的親和力為-6.8 kcal·mol-1，氫鍵結(jié)合位點位于THR190、GLN189、HIS164、GLY143、PHE140、GLU166，在GLU166位點還有1個鹽橋(見圖1B)。

3.2 Mpro蛋白與金蓮花湯27種化合物的對接結(jié)果

金蓮花湯的27種主要成分中，除葒草素-2″-O-β-L-半乳糖苷不能與Mpro蛋白的活性區(qū)域結(jié)合之外，其他26種成分均與靶點蛋白的活性區(qū)域結(jié)合。在3類成分中，黃酮類成分與靶點的親和力分值在-6.9～-9.1 kcal·mol-1(見表1)，其中，蘆丁與靶點的親和力最高為-9.1 kcal·mol-1，說明黃酮類成分抑制Mpro蛋白活性的潛力最大。有機酸類和生物堿類成分與靶點親和力相對較弱，有機酸類成分與靶點的親和力分值在-4.7～-7.4 kcal·mol-1，而2個生物堿類化合物靛玉紅和金蓮花堿的親和力分值分別為-7.4、-6.3 kcal·mol-1。

注：A為Mpro蛋白的活性區(qū)域；B為Mpro蛋白與抑制劑N3的結(jié)合位點；綠色標記分子是數(shù)據(jù)庫下載的晶體中的原配體N3；紫色標記的分子是本實驗對接后的構(gòu)象。圖1 Mpro蛋白與抑制劑N3的對接示意圖

與靶蛋白結(jié)合的26種化合物主要以氫鍵的方式與靶蛋白結(jié)合。其中，與N3有3個共同結(jié)合位點的化合物包括3′-羥基葛根素(GLY143、GLN189、THR190)、葛根素(GLY143、GLU166、THR190)、3′-甲氧基葛根素(GLY143、GLN189、THR190)、迷迭香酸(PHE140、GLU166、GLN189)、原兒茶酸(GLY143、GLU166、GLN189)；與N3有2個共同結(jié)合位點的化合物包括木犀草苷(GLY143、THR190)、山柰酚(GLU166、GLN189)、染料木苷(GLY143、GLN189)、野黃芩苷(GLN189、THR190)、葒草素(GLU166、THR190)、金蓮花碳苷Ⅰ(GLN189、THR190)、藜蘆酸葡萄糖酯(PHE140、GLY143)、咖啡酸(GLY143、GLN189)、阿魏酸(GLY143、GLN189)、金蓮花堿(PHE140、GLN189)；與N3有1個共同結(jié)合位點的化合物包括蘆丁(GLU166)、芹菜素(PHE140)、金蓮花苷(GLU166)、牡荊素(GLY143)、2″-O-(2?-甲基丁?；?異當藥黃素(THR190)、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素(THR190)、金蓮酸(GLY143)；而大豆苷、大豆苷元、藜蘆酸、靛玉紅與N3無共同結(jié)合位點。另外，有7種化合物(木犀草苷、金蓮花苷、大豆苷、葛根素、金蓮酸、阿魏酸、藜蘆酸)在靶蛋白的CYS145處以氫鍵結(jié)合，9種化合物(野黃芩苷、葒草素、2″-O-(2?-甲基丁?；?異當藥黃素、金蓮花碳苷Ⅰ、2″-O-(2?-甲基丁酰基)牡荊素、大豆苷元、迷迭香酸、藜蘆酸、靛玉紅)與HIS41也存在分子相互作用，其中野黃芩苷和迷迭香酸與HIS41形成氫鍵，而葒草素、2″-O-(2?-甲基丁?；?異當藥黃素、金蓮花碳苷Ⅰ、2″-O-(2?-甲基丁?；?牡荊素、大豆苷元、藜蘆酸、靛玉紅則與該位點形成π-π堆積作用。

表1 金蓮花湯中主要化合物與Mpro的結(jié)合位點及親和力

續(xù)表1

續(xù)表1

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4 討論

2019-nCoV的蛋白水解酶(2019-nCoV Mpro)，也被稱為3C樣蛋白酶(3C-like proteinase，3CLpro)，由306個氨基酸組成，形成二聚體后產(chǎn)生水解酶活性。其145位的半胱氨酸(CYS)和41位的組氨酸(HIS)是形成催化二聚體的關(guān)鍵位點，這2個位點在冠狀病毒中相對保守[20]。在病毒復制過程中，2019-nCoV Mpro將病毒翻譯出的多聚蛋白體切割成功能蛋白，這是新冠病毒生命周期中的重要一環(huán)，因此，篩選Mpro的抑制劑可阻止病毒的復制和組裝。

本研究采用分子對接方法測定了金蓮花湯中27種主要成分對Mpro蛋白的親和力。除了1種成分之外，26種成分均可與靶蛋白的不同位點結(jié)合，其中20種成分的親和力≥N3的親和力，這些成分大多數(shù)是黃酮類化合物。N3與Mpro蛋白的結(jié)合位點有6個，而26種化合物中只有5種，即葛根素、3′-羥基葛根素、3′-甲氧基葛根素、迷迭香酸、原兒茶酸與N3的共有Mpro蛋白結(jié)合位點最多(3個)，這說明金蓮花湯中的主要成分同Mpro蛋白的結(jié)合方式可能與N3不同。26種化合物中有7種與CYS145形成氫鍵，這是Mpro蛋白形成催化二聚體的核心位點，提示這7種化合物可能有抑制二聚體形成的作用。另外，有超過一半化合物(14種)與CYS145位點臨近的SER144通過氫鍵結(jié)合，也可能對二聚體形成起干擾作用。從化合物類別來看，黃酮類成分與靶點的親和力相對較強，有機酸類成分和生物堿類成分相對較弱。這與前者所含羥基和酮基多于后兩者有關(guān)，本研究中發(fā)現(xiàn)這2種基團，特別是黃酮的糖基中的羥基容易和Mpro蛋白中氨基酸的雜原子形成氫鍵。在研究的化合物中，黃酮類的分子尺寸>酚酸類和生物堿類，其羥基的分布也相對均勻，這也可能是結(jié)合力相對較強的原因。近期發(fā)表的關(guān)于抗2019-nCoV的文獻中也報道了黃酮類化合物如山柰酚、木犀草素、黃芩素等抗2019-nCoV的潛力，與本研究的結(jié)果一致[21-24]。根據(jù)本研究前期進行的金蓮花湯主成分的定量分析結(jié)果[15]，黃酮類是金蓮花湯中含量最多的成分，有機酸類含量次之，生物堿類含量最少。從成分的藥味歸屬來看，親和力較高的前10種成分分別來自金蓮花湯的所有組方藥味，包括來自大青葉的蘆丁(-9.1 kcal·mol-1)、山柰酚(-8.0 kcal·mol-1)，來自蒲公英的木犀草苷(-8.4 kcal·mol-1)、芹菜素(-7.8 kcal·mol-1)，來自葛根的染料木苷(-7.8 kcal·mol-1)、大豆苷(-7.5 kcal·mol-1)，來自于蘇葉的野黃芩苷(-7.8 kcal·mol-1)以及來自金蓮花的葒草素(-7.6 kcal·mol-1)、金蓮花苷(-7.6 kcal·mol-1)、牡荊素(-7.5 kcal·mol-1)。這說明該方所有藥味均有Mpro蛋白結(jié)合潛力。整體來看，活性強弱排序為大青葉>蒲公英>葛根>金蓮花>蘇葉。大青葉和蒲公英均為性寒味苦藥，具有清熱解毒的功效。葛根性涼味甘辛，能升陽透疹、解熱生津。有研究報道大青葉和葛根有抗病毒、解熱和抗炎活性[25-26]，蒲公英則臨床用于呼吸道感染和各種炎性疾病[27]。金蓮花性寒，味苦，能清熱解毒、消腫明目，其主要成分具有抗病毒作用，而且其代表成分具有殺滅病毒和抑制“細胞因子風暴”的雙重作用[14]。蘇葉性溫，味辛，能解表散寒、理氣和營，有抗菌作用[28]。

本研究中的26種成分可與Mpro蛋白結(jié)合，其中20種的親和力強于原配體N3，這些成分如黃酮類大都具有相同或相似的基本骨架，在整體上可以呈現(xiàn)出對結(jié)合位點或靶蛋白的疊加效應[29]，這也是中藥的優(yōu)勢所在。這些成分主要以氫鍵的形式與Mpro蛋白結(jié)合，某些成分的主要結(jié)合位點位于形成催化二聚體的核心位置CYS145及其鄰位SER144，對Mpro蛋白的抑制作用可能更直接。因此，金蓮花湯表現(xiàn)出Mpro蛋白結(jié)合活性，具有抗2019-nCoV的潛力，值得進一步研究。

致謝：上海科技大學饒子和院士團隊提供2019-nCoV Mpro蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。