何洪標，梁俏敏，鄭曙光

廣東省中山市陳星海醫(yī)院(中山 5281415)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是一種高發(fā)病率、高病死率的惡性腫瘤。據調查研究報告，我國患結直腸癌病的人數以及此疾病死亡人數逐年增加，這與人們的飲食習慣密切相關，目前大家比較熱衷于追求刺激味蕾的重口味食物。結直腸癌的治療手段有化療、放療以及手術等[1]。結直腸癌高發(fā)于老年群體，但是由于老年患者一系列身體機能的衰退，對治療的要求更高，目前現(xiàn)有的治療手段難以滿足老年人治療的要求。因此研究出一種更好的治療手段迫在眉睫[2]，故本研究提出結直腸鋸齒狀息肉病相關通道蛋白表達水平對患者病情的影響，為臨床研究提供依據。

資料與方法

1 一般資料 2015年3月至2019年8月，對中山市陳星海醫(yī)院消化內科85例結直腸鋸齒狀息肉病患者及健康體檢中心85例健康居民進行了臨床調查研究。入組患者均簽署研究同意書。本研究獲得中山市陳星海醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。直腸鋸齒狀息肉病診斷參照WHO公布的鋸齒狀息肉綜合征診斷標準：近端結腸中發(fā)現(xiàn)至少有5個鋸齒狀病變，并且其中至少2個鋸齒狀息肉直徑超過10 mm；有SPS家族史并發(fā)現(xiàn)存在1個及以上的結直腸鋸齒狀息肉；整個結直腸腸腔中發(fā)現(xiàn)超過20個以上的鋸齒狀息肉。符合上述三個指標任意一個即可診斷。共同納入標準：無重要臟器功能障礙；無腫瘤史；無消化系統(tǒng)手術史；臨床資料完整；Karonfsky評分超過60分。共同排除標準：哺乳期婦女、孕婦或其他特殊情況者；近30 d有接受消化系統(tǒng)系統(tǒng)性治療的患者；糖尿病、高血脂癥、高血壓等慢性疾病者。健康組85例，男51例，女34例；年齡34～55歲，平均(50.12±4.02)歲；BMI(22.81±0.64)kg/m2。疾病組85例，男53例，女32例；年齡34～55歲，平均(52.05±3.02)歲；BMI(22.79±0.21)kg/m2；病程10～21個月，平均(14.25±3.28)個月。兩組患者均衡性好，可比性高。

2 檢測方法 對兩組相關通道蛋白采用免疫組化方法進行定性檢測，具體包括P-gP(P-糖蛋白，P - glycoprotein)；Survivin(凋亡抑制蛋白，Apoptotic inhibitor protein)；HSP70(重組人HSP70蛋白，Recombinant human HSP70 protein)；EHD2(EHD2人源全長重組蛋白，EHD2 human full-length recombinant protein)。在內鏡輔助下取病理標本，將切片脫蠟至水，滴加3%過氧化氫液室溫下避光孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶活性。而后將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)中，入微波爐中修復8 min，PBS沖洗3 min×3次，濾紙吸干PBS液。滴加正常山羊血清，室溫下孵育15 min，中和非特異性反應。滴加BRAF(1∶100濃度)、EphB2兔抗人特異性抗體(1∶150濃度)，入濕盒內4℃冰箱過夜。次日滴加生物素標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育20 min。滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，室溫下孵育15 min。DAB底物顯色，鏡下控制反應時間，蘇木精復染，鹽酸(濃度1.0%)酒精分化5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。陽性染色均為棕黃色(或棕褐色顆粒)，多集中于細胞質中，少量在細胞膜。

3 結果判定 按染色強度評分：無染色(0分)，淡黃色(1分)，棕黃色(2分)，棕褐色(3分)。按陽性細胞所占百分比評分：<5.0%(0分)、5.0%～25.0%(1分)、26.0%～50.0%(2分)、51.0%～75.0%(3分)、>75%)4分。兩項評分的乘積為每張切片組織染色結果，最終根據乘積結果進行定性判定，>3分記為陽性，≤3分則為陰性。

4 統(tǒng)計學方法 選用SPSS21.0統(tǒng)計學軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料采用均值±標準差表示，采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 兩組相關通道蛋白檢出情況比較 兩組對象四種通道蛋白(P-gP、Survivin、HSP70、EHD2)檢出情況比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，疾病組患者通道蛋白檢出率均高于對照組。見表1。

表1 兩組對象相關通道蛋白檢出情況比較(例)

2 不同情況或病情疾病組患者相關通道蛋白檢出情況比較 P-gP檢出情況比較，性別、年齡、息肉直徑、分化程度、浸潤深度、臨床分期對其影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Survivin檢出情況比較，年齡、息肉直徑、浸潤深度、臨床分期對其影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HSP70檢出情況比較，性別、分化程度對其影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。EHD2檢出情況比較，年齡對其影響有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

討 論

結直腸鋸齒狀息肉包括傳統(tǒng)鋸齒狀腺瘤、增生性息肉以及SSP/P，其特點為惡性潛能的組織學發(fā)生病變。SSP/P是散發(fā)性結直腸癌癌前病變的重要標志。結直腸鋸齒狀息肉病變的病理學特點以及內鏡的表現(xiàn)因病變類型而異，組織學特征是確診此疾病的重要手段[3]。鋸齒狀息肉病綜合征患者患結直腸癌的概率極高，患者通常具有數個鋸齒狀息肉。結直腸癌在臨床上較為常見，在我國經濟飛速發(fā)展的形勢下，人們的經濟水平日益提高，生活質量也發(fā)生了質的飛躍，導致人們的生活方式發(fā)生了轉變，人們更傾向于追求味蕾的刺激，而結直腸癌作為消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增長的趨勢[4]。

經過研究發(fā)現(xiàn)疾病組患者四種通道蛋白(P-gP、Survivin、HSP70、EHD2)檢出率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義。P-gP檢出情況比較，性別、年齡、息肉直徑、分化程度、浸潤深度、臨床分期對其影響有統(tǒng)計學意義。Survivin檢出情況比較，年齡、息肉直徑、浸潤深度、臨床分期對其影響有統(tǒng)計學意義。HSP70檢出情況比較，性別、分化程度對其影響有統(tǒng)計學意義。EHD2檢出情況比較，年齡對其影響有統(tǒng)計學意義。分析患者不同臨床特征對各通道蛋白表達含量的影響，性別因素可能與結直腸鋸齒狀息肉流行特征有關，該病在男女人群中的發(fā)病率本身存在一定固有差異，這種流行趨勢可能一定程度影響了多項通道蛋白的檢出含量。同時，由于本研究篩選的通道蛋白為疾病特征性蛋白，息肉直徑較大、分化程度和浸潤深度相對較高、臨床分期級別較高的臨床患者，其通道蛋白表達含量相對較高。也可能與病情較重的患者，其內環(huán)境紊亂更為嚴重，原發(fā)病灶持續(xù)存在進而影響了通道蛋白的表達有關，具體原因還需進一步深入分析。

表2 不同情況或病情疾病組患者相關通道蛋白檢出情況比較(例)

Survivin是一種很好的治療候選基因，它可以作為診斷腫瘤的標志物。它在細胞凋亡時發(fā)揮重要的作用，同時它也參與腫瘤細胞生長、凋亡和放療抵抗等多種功能調節(jié)[5]。Survivin蛋白與結直腸癌的演進和轉移呈正相關的關系，在腫瘤組織中Survivin蛋白會處于極高表達的狀態(tài)，它對血管的生成起促進作用，臨床上將Survivin蛋白又稱為腫瘤細胞的存活素，因為這種蛋白具有增強腫瘤細胞的侵襲、耐藥性以及增殖等能力。Survivin蛋白可以通過作用于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3以及Caspase-9從而對腫瘤的惡化進程起促進作用。同時它能夠對腫瘤細胞的凋亡起到抑制作用[6-8]。 Survivin蛋白除與抑制凋亡和保護細胞存活外，還參與腫瘤血管形成，對腫瘤的浸潤、轉移等有關[9]。Survivin蛋白能夠促進腫瘤細胞大量增殖和瘤細胞轉移的發(fā)生。Survivin通道蛋白的表達能夠隨著結直腸癌患者血清中腫瘤標志物CEA的含量增多而增加。因此造成疾病組患者Survivin通道蛋白檢出率均高于對照組。P-gP是一種能量依賴性的跨膜蛋白，它是由MDR-1基因編碼的。P-gp蛋白陽性率的高低受淋巴結轉移和TNM分期進程的影響，如果檢出P-gP蛋白陽性率出現(xiàn)升高趨勢就提示P-gp蛋白高水平的表達。P-gp蛋白與腫瘤細胞的多藥耐藥性有一定的關系，在能量充足的前提下，它能夠依靠“藥泵”的功能將各種化合物轉運出細胞外，例如與化療有關的藥物[10-14]。P-gP可以參與信號通路,比如它可以阻斷一些信號通路，如P13K/AKT信號通路，從而可以使細胞的藥物敏感性得到增強。在臨床上P-gP通常作為判斷腫瘤耐藥性以及此疾病化療效果的標志物。

HSP70是一種協(xié)同免疫的蛋白質。HSP70在正常情況下呈現(xiàn)低水平表達。當機體受到高溫刺激以及處于應激狀態(tài)時會導致HSP70的合成迅速增加以提高機體的抗應激能力。HSP70與細胞的多個環(huán)節(jié)密切相關，如細胞的生長、分化等。據資料顯示HSP70可能與患者出現(xiàn)熱耐受有關，從而會導致抗癌效果差[15-17]。熱休克應答可使細胞產生HSP70，為熱應激后產生的一系列保護性應激蛋白的一部分，對細胞的生存起重要作用[18]。EHD2是一種存在于膜內的內吞調控蛋白，它具有調節(jié)信號轉導以及抑制惡性腫瘤的功能，據資料表明EHD2在結直腸癌中的表達會顯著增強。結直腸癌的分化程度以及淋巴轉移都會對EHD2的表達產生一定的影響，在結直腸癌處于較低的分化程度時，EHD2這種蛋白的表達也較低[19-20]。本實驗還發(fā)現(xiàn)P-gP、Survivin、HSP70、EHD2這四種通道蛋白都與結直腸癌的分化程度以及淋巴轉移具有一定的關系，四者存在協(xié)同的作用，至于其中具體的機制需要進一步實驗分析。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)P-gP、Survivin、HSP70、EHD2這四種通道蛋白與結直腸癌的發(fā)生、轉變以及發(fā)展等具有較為密切的關系，對P-gP、Survivin、HSP70、EHD2這四種通道蛋白的檢測有利于對疾病的診斷以及病情的評估，故結直腸鋸齒狀息肉病相關通道蛋白表達水平對患者病情評估價值可在臨床實踐中應用。