劉曉庚 吳李瑞 董思佳 楊奕明 劉季敏 胡妍君 張宇豪 秦怡航

(南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院；江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心； 江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1，南京 210023) (安徽國星生物化學(xué)有限公司2，馬鞍山 243100)

氟既是人體必需微量元素，但又是一種累積性物質(zhì)，體內(nèi)含量超過一定程度會(huì)引起氟中毒。氟以氟離子形態(tài)廣泛存在于水體、土壤、動(dòng)植物及食物中。目前測定食物中氟的方法主要有離子選擇電極電位滴定法(GB/T5009.18—2003)[1-5]、極譜法[6]、分光光度法[7,8]、熒光分析法[9]、氣相色譜法[10]、高效液相色譜法[11]和離子色譜法[12]等。電位滴定存在檢測限較高、極譜法有重現(xiàn)性不佳、光度法和熒光法有試劑不易得到和穩(wěn)定性差、而色譜法又存在操作較繁瑣和測定成本高等不足[13]。人們對(duì)生態(tài)環(huán)境和食品安全的要求越來越高，為尋得既快速準(zhǔn)確經(jīng)濟(jì)且適合基層檢測的谷物微量氟測定新方法，在大量調(diào)研和測定方法的探究性實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，探究出高倍富集放大雙點(diǎn)電位滴定法測定微量氟的新方法，并獲得了較理想的檢測效果。

1 高倍富集放大反應(yīng)測定氟的原理

高倍富集放大反應(yīng)測定法的基本原理是在一定條件下，Ca2+、F-與特定試劑組作用，定量生成是其氟含量5倍的具有較弱極性的難溶化合物氟磷酸鈣[Ca10(PO4)6F2，(Ksp(Ca10(PO4)6F2) = 2.48×10-6)][14,15]，從而使氟富集并分離，在酸性環(huán)境下將氟磷酸鈣完全溶解，以EGTA為滴定劑，用雙電點(diǎn)電位滴定法[16]測其鈣含量[17]，轉(zhuǎn)換成試樣中氟含量。其相關(guān)過程的反應(yīng)式為：

①10Ca2++2F-+6(PO4)3-==Ca10(PO4)6F2↓

②Ca10(PO4)6F2+2HCl==10Ca2++Cl2-+2HF+6(PO4)3-

③Ca2++H2Y2-==CaY2-+2H+

其計(jì)算式為：

式中：Ve為滴定液體積/mL；Ve,0為樣品空白滴定體積/mL；cEGTA為EGTA標(biāo)準(zhǔn)液濃度/mol/L；ms為試樣質(zhì)量/g；MF為氟的摩爾質(zhì)量/g/mol；k為干物質(zhì)含量。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

小麥、玉米、稻谷等由南京財(cái)經(jīng)大學(xué)中加生態(tài)儲(chǔ)藏中心提供。

EGTA、NaF、CaCl2、NaCl、KOH、Na3PO4、NH4Cl、HCl、HNO3、HAc、明膠和過氧化鈉等均為分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)用水為去離子純凈水。

總離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)緩沖劑(TISAB)由NaCl 1.0 mol/L、HAc 0.25 mol/L、NaAc 0.75 mol/L、檸檬酸鈉0.05 mol/L組成，pH 5.0，總離子強(qiáng)度為2.75。

2.2 儀器與設(shè)備

ZDJ-4A型自動(dòng)電位滴定儀；Ca離子選擇性電極；E-201-C pH復(fù)合電極。

2.3 方法

2.3.1 樣品前處理

參照粟智[19]的氧彈燃燒法進(jìn)行預(yù)處理，即：將干燥測定水分(<8%)的試樣磨碎，過60目篩，稱取試樣5.00 g，與0.25 g過氧化鈉助燃劑混勻，壓片。將5 mL 0.5 mol/L KOH吸收液加入氧彈器中，放置壓好的試劑片，灰化，用吸收液洗凈彈壁，合并后用0.2 mol/L HNO3中和至pH 7，并定容至100 mL備用。

2.3.2 測定操作方法

按王洪友[15]的方法，取一定量試液于刻度試管，依次加一定量的2 mol/L Na3PO4、2 mol/L KOH、2 mol/L HAc和1 mol/L CaCl2(此4種溶液后簡稱為含Ca2+復(fù)合富集劑)混合均勻后，再加入明膠，定容，靜置，待明膠粉末完全吸水膨脹后，于60 ℃水浴中加熱，攪拌至明膠完全溶解，得均勻透明的溶膠；將此膠倒入聚乙烯杯中，室溫下冷卻至溶膠完全凝固；再于恒溫浴和40 W超聲波輔助下反應(yīng)一定時(shí)間至沉淀層不再增加時(shí)，分出固體物并用35℃水洗至pH約7。再用2 mol/L HCl將固體物完全溶解，用1 mol/L KOH調(diào)至pH約7，并用TISAB定容至100 mL。取該試液20.00 mL，加1 mol/L KOH 5 mL，加鈣指示劑，混勻，于自動(dòng)電位滴定儀用EGTA標(biāo)準(zhǔn)液(用碳酸鈣作基準(zhǔn)物標(biāo)定)滴定至終點(diǎn)，并記錄計(jì)量點(diǎn)附近兩組V，E數(shù)據(jù)(V1，E1；V2，E2)并用雙點(diǎn)法計(jì)算終點(diǎn)體積Ve，同一樣品平行測定3次。以水做空白實(shí)驗(yàn)Ve,0。

2.3.3 富集放大反應(yīng)條件的確定2.3.3.1 單因素考察方法

影響高倍富集放大反應(yīng)的因素有：富集劑用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系酸度(pH)和攪拌速度等。用單因素變量法考察這些因素對(duì)測定的影響(以氟含量和RSD為衡量指標(biāo))，并確定其適宜條件。

2.3.3.2 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方法

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，為更準(zhǔn)確地確定其主要因素的最優(yōu)條件，對(duì)富集劑用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系pH四個(gè)主要影響因素用L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，以確定其最適宜條件。

2.3.4 方法學(xué)指標(biāo)的考察2.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限的測定

在最適宜條件下，取氟標(biāo)準(zhǔn)液，濃度(-lgcF)分別為1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0,6.0, 7.0 mol/L，測得其雙點(diǎn)電位滴定法E～-lgcCa標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)其斜率(k)和空白值測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差(Sb)算得鈣的檢測限(LODCa=3Sb/k)[17]，再據(jù)氟與鈣的富集放大反應(yīng)的計(jì)量關(guān)系便可求出本法測定氟的LODF(=LODCa/放大倍數(shù))。

2.3.4.2 方法精密度和準(zhǔn)確度的測定

方法的精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。方法準(zhǔn)確度以加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的回收率表示。

2.3.5 實(shí)際樣品的測定

在最適宜條件下，按2.3.1制得13個(gè)樣液，并用2.3.2操作方法對(duì)其分別進(jìn)行測定。

2.3.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2017和Origin9.0繪圖和數(shù)據(jù)處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 高倍富集放大反應(yīng)的選定

在單用CaCl2富集F-，但效果不佳且無放大效應(yīng)后?？紤]到氟磷酸鈣含氟且難溶，特別是反應(yīng)對(duì)氟的放大效應(yīng)達(dá)10倍[14,15]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。0.1 mol/L含Ca2+復(fù)合富集液對(duì)微量F-有良好的富集放大效果。因此，選擇含Ca2+復(fù)合液作為F-的富集放大劑。

圖1 0.1 mol/L含Ca2+復(fù)合富集劑與 1.0×10-7～1.0×10-5mol/L NaF反應(yīng)的富集放大效果

3.2 富集放大反應(yīng)條件的單因素實(shí)驗(yàn)

3.2.1 富集劑用量的影響

由圖1可見，當(dāng)c(F-)≥1.0×10-6mol/L時(shí)富集產(chǎn)生沉淀層十分明顯，因此固定c(F-) 1.0×10-6mol/L，僅改變含Ca2+復(fù)合富集劑濃度且分別為1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.000 5、0.000 1 mol/L作實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖2a。若復(fù)合富集劑用量太少，會(huì)因體系濃度過稀而達(dá)不到沉淀?xiàng)l件；如果用量過多則會(huì)導(dǎo)致配位效應(yīng)突出而使沉淀富集作用削弱。實(shí)驗(yàn)證明：1.00×10-6mol/LF-和0.05～0.20 mol/L含Ca2+復(fù)合富集劑反應(yīng)產(chǎn)生的沉淀富集放大效果為佳，故選用Ca2+復(fù)合富集劑的用量為n(F-)∶n(復(fù)合富集劑)= 1∶5×104～2×105為宜。

3.2.2 富集放大反應(yīng)酸度的影響

其他條件均不變，通過僅改變富集反應(yīng)體系的酸度(pH)且分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12下，測得其結(jié)果如圖2。富集反應(yīng)體系酸度控制在pH5 ～7為宜。

圖2 反應(yīng)酸度和復(fù)合富集劑對(duì)測定的影響

3.2.3 富集放大反應(yīng)溫度的影響

其他條件均不變，通過僅改變富集反應(yīng)的溫度且分別為10、15、20、25、30、35、40、45 ℃，測得其結(jié)果如圖3，富集反應(yīng)溫度控制在15～25 ℃為宜。

圖3 反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和洗滌次數(shù)對(duì)測定的影響

3.2.4 洗滌次數(shù)的影響

其他條件均不變，通過僅改變對(duì)富集所得固體物的洗滌次數(shù)且分別為0、1、2、3、4、5、6次下(洗滌的用水量相同)，測得其結(jié)果見圖3。沉淀物的洗滌對(duì)測定有顯著影響，特別是當(dāng)洗滌次數(shù)少于3次時(shí)，不僅測定結(jié)果嚴(yán)重偏高，而且測定的RSD大，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性均差，達(dá)不到分析要求；當(dāng)洗滌次數(shù)達(dá)4次以上時(shí)，其回收率趨近100%和RSD小且穩(wěn)定，完全符合微量分析要求；而洗滌次數(shù)太多不僅浪費(fèi)而且會(huì)因過度洗滌使沉淀物流失而導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。因此洗滌次數(shù)以4次為宜。

3.2.5 富集放大反應(yīng)時(shí)間的影響

其他條件均不變，通過僅改變富集反應(yīng)的時(shí)間且分別為30、60、90、120、150、180、210、240、300 h下，測得其結(jié)果見圖3。富集反應(yīng)時(shí)間應(yīng)控制在180 min以上為宜。

3.2.6 攪拌速率對(duì)富集放大反應(yīng)的影響

其他條件均不變，通過僅改變富集反應(yīng)的攪拌速率且分別為0、10、30、60、100、150、200、250、300、400 r/min下，測得其結(jié)果見圖3。攪拌速率對(duì)測定的影響不十分顯著。但攪拌過慢，反應(yīng)充分，測量結(jié)果偏低，攪拌快，會(huì)產(chǎn)生氣泡形成大漩渦而富集不徹底，因此富集過程中攪拌速率在200～300 r/min為宜。

3.3 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

為獲得此富集放大反應(yīng)的最適條件，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)富集劑用量、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)體系pH四個(gè)主要影響因素采用L9(34)正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1，結(jié)果分析見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 (n=3)

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析

注：F0.05(2,2)=19.0，F(xiàn)0.01(2,2)=99.0。

從表2可見，四個(gè)被優(yōu)化的主要因素對(duì)測定的影響程度是：B(富集反應(yīng)時(shí)間)>D(反應(yīng)體系酸度)>A(復(fù)合富集劑用量)>C(反應(yīng)溫度)；除富集反應(yīng)時(shí)間影響顯著外，其他影響因素均不顯著(P<0.05)，且反應(yīng)的溫度對(duì)測定的影響則最小，原因是所考察的反應(yīng)時(shí)間水平間跨度較大，而其它考察因素水平間相關(guān)甚小。正交優(yōu)化所得最適宜條件為A3B3C2D2，即富集反應(yīng)時(shí)間200 min，反應(yīng)溫度22 ℃，反應(yīng)體系酸度pH 5.5，復(fù)合富集劑用量為(m氟/m復(fù)合劑) = 1∶1×105。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低檢測限的測定

在最適宜條件下按2.3.4.1的方法測得其E～-lgcCa標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。從圖4可見，cF在1.0×10-6～1.0×10-1mol/L范圍內(nèi)均有良好定量的函數(shù)關(guān)系：E=38.657 lgc-174.44 (R2=0.996)。并可求得雙點(diǎn)法測鈣的檢測限(LODCa=2.8×10-6mol/L)。再依據(jù)富集放大反應(yīng)中鈣與氟的計(jì)量關(guān)系，便可得到本法測定氟的檢測限LODF=5.3×10-3μg/g，與高靈敏的極譜法[20]的檢測限相當(dāng)。

圖4 雙點(diǎn)電位滴定鈣離子的E～ (-lgcCa)標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.5 精密度與準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)的測定

在最適宜條件下按2.3.4.2的方法分別測得稻米和米皮中氟含量的RSD和加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的回收率及其RSD，結(jié)果見表3。由表3知，測得含氟量相差甚大的稻米和受氟污染米皮的RSD為1.9%～3.9%和加標(biāo)回收率為91.5%～100.3%，且氟含量低于200 μg/g樣的測定效果更佳?？梢姳痉y氟的重現(xiàn)性和精確性均良好。

表3 本法精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=3)

3.6 干擾因素實(shí)驗(yàn)

谷物中存在的Mg2+和Fe3+會(huì)影響本法測定[15,17]。因此測量時(shí)采取的排除干擾措施是：①在復(fù)合富集劑和TISAB中均含對(duì)Mg2+和Fe3+有掩蔽作用的檸檬酸或其鹽。②雙點(diǎn)電位滴定法的滴定劑是對(duì)Ca2+選擇性強(qiáng)的EGTA而不是選擇弱的EDTA，因?yàn)樵贓GTA滴定Ca2+條件下Mg2+和Fe3+已轉(zhuǎn)化為難溶的氫氧化合物故不影響此測定[21]。可見本法測定均已設(shè)計(jì)了消除干擾的處理無需額外的相應(yīng)措施。

3.7 實(shí)樣的測定

按2.3.1方法處理試樣，再按2.3.2在最適宜條件下進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。由表4可知，原糧中含氟量為1.27～1.48 μg/g樣，加工副產(chǎn)物中含氟量為1.84 ～ 2.67 μg/g樣，加工制品的小麥粉和稻米中含氟量分別為0.63 μg/g樣和0.57 μg/g樣；試樣本底和加標(biāo)的測定的RSD分別為1.9%～2.7%、0.8%～2.3%，均比較穩(wěn)定，但本底值的RSD比加標(biāo)的稍大，且不同測定對(duì)象RSD有差異(這可能是測定對(duì)象的組成成分存在明顯差異所致)。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果是完全符合微量分析的要求。

表4 實(shí)樣及其回收率測定結(jié)果(n=3)

4 結(jié)論

通過富集放大反應(yīng)和雙點(diǎn)電位滴定相結(jié)合的方法，可以快速、準(zhǔn)確地測定谷物中微量至常量的氟。對(duì)谷物中氟的富集、測定方法與條件進(jìn)行了驗(yàn)證分析，對(duì)影響富集反應(yīng)的主要參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，所得最適條件是：含Ca2+復(fù)合富集劑用量為(m氟/m復(fù)合劑)=1∶1×105，富集反應(yīng)200 min，反應(yīng)溫度22 ℃，反應(yīng)體系酸度pH 5.5，攪拌速率200～300 r/min，沉淀物洗滌4次。該法的LODF=5.3×10-3μg/g樣，當(dāng)cF在1.0×10-6mol/L～1.0×10-1mol/L內(nèi)呈良好定量關(guān)系：E= 38.657 lgc-174.44 (R2=0.996)；且加標(biāo)回收率為91.5%～100.3%，測定結(jié)果較穩(wěn)定(RSD≤2.7%)。本法集合了富集反應(yīng)的高倍放大效果和雙點(diǎn)電位滴定法高精準(zhǔn)的特點(diǎn)，測定選擇性高，Mg2+、Fe3+干擾小，測定濃度范圍大，測定速度快，靈敏度較高，可作為微量氟的定量分析方法，為修訂GB/T5009.18-2003《食品中氟的測定》提供參考。