劉厚伯，李 春，李 林，上官艷妮，黃惻隱，劉 怡，鄭明輝，徐德林，①

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099；2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 芝麻研究中心，河南 鄭州 450002)

生長(zhǎng)素又稱吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中具有重要作用，不但能調(diào)節(jié)植物細(xì)胞和器官的生長(zhǎng)發(fā)育[1]，還能夠單獨(dú)或與其他激素協(xié)同作用參與植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[2-3]。Aux/IAA基因可調(diào)控生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[4]，且Aux/IAA蛋白具有4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，其中，Domain Ⅰ具有轉(zhuǎn)錄抑制功能，包含1個(gè)兩親性基序LxLxLx[5]；Domain Ⅱ具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，含有蛋白質(zhì)泛素化降解的靶位點(diǎn)，核心序列為VGWPP；Domain Ⅲ和Domain Ⅳ負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的二聚化[6]，前者含有βαα基序[1]，后者含有酸性區(qū)域和SV40核定位序列(NLS，PKKKRKV)[6]。研究表明：Aux/IAA基因可參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，并可調(diào)控植物體內(nèi)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[7-12]，為近年的研究熱點(diǎn)。

白及〔Bletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.〕為多年生草本植物，具有抗菌、止血和抗腫瘤等功效[13]，且觀賞價(jià)值較高[14]。近年來(lái)，隨著環(huán)境不斷惡化和人類過(guò)度采挖，白及的野生資源越來(lái)越少，加上其人工培育品種質(zhì)量參差不齊[15]、遺傳背景不清，嚴(yán)重制約了白及的研究和開發(fā)利用。由于Aux/IAA基因?qū)χ参锏纳L(zhǎng)發(fā)育和遺傳改良有重要作用，因此，有必要對(duì)其Aux/IAA基因進(jìn)行研究。

鑒于此，基于白及的全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，作者采用生物信息學(xué)方法對(duì)白及Aux/IAA基因進(jìn)行分析，以期為白及Aux/IAA基因的表達(dá)調(diào)控和功能鑒定以及白及生長(zhǎng)繁育相關(guān)代謝途徑研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

以采自貴州省正安縣的白及成熟種子萌發(fā)獲得的組培苗為實(shí)驗(yàn)材料。從擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.〕信息資源(TAIR)數(shù)據(jù)庫(kù)(https：∥www.arabidopsis.org/)中獲得擬南芥Aux/IAA蛋白序列，并從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲得鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)Aux/IAA蛋白序列。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 隨機(jī)采集組培苗的原球莖、移栽前組培苗(包括根、莖和葉)、移栽2個(gè)月的組培苗(包括根、莖和葉)及移栽1年后的組培苗(包括根、莖、葉、花和種子)，每個(gè)階段采集的組培苗均為同一區(qū)域內(nèi)形狀、色澤和大小基本一致的植株，各采集3株。采集后迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，提取單株總RNA，用液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 基因鑒定和序列分析 經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后，將不同生長(zhǎng)時(shí)期所有的單株總RNA進(jìn)行等量混合，先進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，再拼接組裝成unigenes[16]。利用BLASTp工具進(jìn)行比對(duì)搜索(設(shè)置缺省參數(shù))，手動(dòng)去除錯(cuò)配序列；利用Pfam 32.0在線軟件(http：∥pfam.xfam.org/)檢索白及的轉(zhuǎn)錄組序列(登錄號(hào)PF02309)，對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行整合和去冗余，并去除不完整序列，得到候選序列；利用ORFfinder在線軟件(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析上述序列的開放閱讀框(ORF)。利用SMART(http：∥smart.embl-heidelberg.de/)和InterPro(http：∥www.ebi.ac.uk/interpro/)在線軟件分析白及Aux/IAA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 蛋白質(zhì)序列分析 利用ProtParam在線軟件(https：∥web.expasy.org/protparam/)分析預(yù)測(cè)白及Aux/IAA蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族氨基酸指數(shù)和總平均親水性等理化性質(zhì)；利用Plant-mPLoc server在線軟件(http：∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)進(jìn)行蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；利用SOPMA在線軟件(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用MEME 5.0.5在線軟件(http：∥meme-suite.org/)分析蛋白質(zhì)的基序，設(shè)定基序?qū)挾茸畲笾禐?0，基序數(shù)為20[17]，其余參數(shù)為默認(rèn)值；利用DNAMAN v9軟件對(duì)蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 GO功能分類和KEGG富集分析 利用String在線軟件(https：∥string-db.org/)對(duì)白及Aux/IAA蛋白的氨基酸序列進(jìn)行GO功能分類和KEGG富集分析，以1×10-5為界限[16]。

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析 利用MEGA 7.0軟件的Clustal W程序，采用鄰接法構(gòu)建模式植物擬南芥32條Aux/IAA蛋白已知序列、近緣植物鐵皮石斛16條Aux/IAA蛋白已知序列和白及Aux/IAA蛋白預(yù)測(cè)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，并進(jìn)行自舉評(píng)估(bootstrapping)，重復(fù)檢測(cè)1 000次，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因鑒定及序列分析

研究結(jié)果表明：在拼接組裝的132 502條unigenes中，共發(fā)現(xiàn)142條unigenes與生長(zhǎng)素有關(guān)；經(jīng)過(guò)對(duì)Pfam檢索結(jié)果的整合、去冗余和去除不完整序列，共篩選出5個(gè)Aux/IAA基因，按照其在白及轉(zhuǎn)錄組中對(duì)應(yīng)序列的ID順序依次命名為BsAux/IAA1、BsAux/IAA2、BsAux/IAA3、BsAux/IAA4和BsAux/IAA5，序列長(zhǎng)度分別為5 985、2 427、942、879和780 bp，開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度分別為2 739、1 053、537、492和492 bp。

2.2 蛋白質(zhì)序列分析

2.2.1 一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(表1)表明：BsAux/IAA1、BsAux/IAA2、BsAux/IAA3、BsAux/IAA4和BsAux/IAA5的氨基酸殘基數(shù)為163～912。上述5個(gè)BsAux/IAA蛋白的理論相對(duì)分子質(zhì)量為18 172.97～101 442.89，理論等電點(diǎn)為pI4.40至pI11.51，且BsAux/IAA1、BsAux/IAA3、BsAux/IAA4和BsAux/IAA5的pI值小于7，據(jù)此推測(cè)這4個(gè)BsAux/IAA蛋白可在酸性亞細(xì)胞環(huán)境中發(fā)揮作用。上述5個(gè)BsAux/IAA蛋白中，BsAux/IAA2和BsAux/IAA4的不穩(wěn)定指數(shù)較低(分別為33.17和33.14)，其余3個(gè)BsAux/IAA蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)較高(48.10～63.81)，據(jù)此判定BsAux/IAA2和BsAux/IAA4為穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定指數(shù)小于40[18])，其余3個(gè)BsAux/IAA蛋白為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定指數(shù)大于40[18])。脂肪族氨基酸指數(shù)能夠反映蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，上述5個(gè)BsAux/IAA蛋白的脂肪族氨基酸指數(shù)為69.45～79.63，說(shuō)明這5個(gè)BsAux/IAA蛋白的熱穩(wěn)定性較高。疏水性分析結(jié)果表明：上述5個(gè)BsAux/IAA蛋白的總平均親水性為-0.577～-0.006，說(shuō)明這5個(gè)BsAux/IAA蛋白為親水性蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明：5個(gè)BsAux/IAA蛋白均定位于細(xì)胞核中。

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(表2)表明：BsAux/IAA1、BsAux/IAA3和BsAux/IAA5均表現(xiàn)為無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，α-螺旋所占比例次之，延伸鏈所占比例較小，β-轉(zhuǎn)角所占比例最小；而BsAux/IAA2則表現(xiàn)為α-螺旋所占比例均最大，無(wú)規(guī)則卷曲所占比例次之，延伸鏈所占比例較小，β-轉(zhuǎn)角所占比例最??；BsAux/IAA4表現(xiàn)為無(wú)規(guī)卷曲所占比例最大，延伸鏈所占比例次之，α-螺旋所占比例較小，β-轉(zhuǎn)角所占比例最小。

表1 白及Aux/IAA蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Table 1 Analysis on primary structure of Aux/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.

蛋白質(zhì)ProteinID氨基酸殘基數(shù)Amino acid residue number分子式Molecular formula理論相對(duì)分子質(zhì)量Theoretical relative molecular mass理論等電點(diǎn)Theoretical isoelectric point (pI)不穩(wěn)定指數(shù)Instability index脂肪族氨基酸指數(shù)Aliphatic amino acid index總平均親水性Grand average of hydropathicityBsAux/IAA1c67850_g1912C4475H6971N1263O1380S28101 442.895.9363.8179.63-0.450BsAux/IAA2c67584_g2350C1644H2765N553O401S4638 169.2611.5133.1774.20-0.006BsAux/IAA3c52097_g1178C858H1369N239O271S1119 721.415.2153.6377.81-0.400BsAux/IAA4c53159_g1163C790H1237N219O243S817 947.315.9433.1469.45-0.448BsAux/IAA5c48979_g1163C780H1227N217O271S618 172.974.4048.1072.88-0.577

表2 白及Aux/IAA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

Table 2 Analysis on secondary structure of Aux/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.

蛋白質(zhì)Protein比例/% Percentageα-螺旋α-helix延伸鏈Extended strandβ-轉(zhuǎn)角β-turn無(wú)規(guī)則卷曲Random coilBsAux/IAA130.2615.355.7048.68BsAux/IAA256.5712.296.8624.29BsAux/IAA325.2824.726.1843.82BsAux/IAA416.5620.255.5257.67BsAux/IAA531.9019.636.1342.33

2.2.2 基序和保守結(jié)構(gòu)域分析 蛋白質(zhì)保守性分析結(jié)果(圖1、圖2、圖3和表3)表明：5個(gè)BsAux/IAA蛋白共有20個(gè)motif，分別命名為motif1至motif20，其中motif1、motif2、motif3和motif9為保守基序；但是，僅BsAux/IAA1具有4個(gè)完整的典型保守結(jié)構(gòu)域，分別為Domain Ⅰ、Domain Ⅱ、Domain Ⅲ和Domain Ⅳ，依次對(duì)應(yīng)保守基序motif9、motif3、motif2和motif1。并且，5個(gè)BsAux/IAA蛋白均含有motif1，BsAux/IAA3至BsAux/IAA5均含有motif2，BsAux/IAA2至BsAux/IAA4均含有motif3，BsAux/IAA3和BsAux/IAA4均含有motif9，其余基序只存在于2個(gè)BsAux/IAA蛋白中。上述結(jié)果表明：motif1為BsAux/IAA蛋白中非常重要的保守基序。

不同色塊的長(zhǎng)度和順序分別代表各基序在蛋白質(zhì)序列中的實(shí)際大小和位置The length and order of the boxes with different colors represent the actual size and location of each motif in protein sequence，respectively.

圖1 白及Aux/IAA蛋白的基序序列(A)及位置(B)

Fig.1 Motif sequence(A)and location(B)of Aux/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.

不同色塊的長(zhǎng)度和順序分別代表各基序在蛋白質(zhì)序列中的實(shí)際大小和位置The length and order of the boxes with different colors represent the actual size and location of each motif in protein sequence，respectively.

圖2 白及Aux/IAA蛋白的基序標(biāo)志及共有基序

Fig.2 Motif symbol and consensus of Aux/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.

下劃線示保守域The underlines represent conserved domains.黑色、紅色和藍(lán)色分別表示同源性100%、75%～100%和50%～75%的氨基酸殘基Black，red，and blue represent the amino acid residues with homology of 100%，75%-100%，and 50%-75%，respectively.

圖3 白及Aux/IAA蛋白的結(jié)構(gòu)域分析

Fig.3 Analysis on domains of Aux/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.

表3 白及Aux/IAA蛋白的基序分布

Table 3 Motif distribution of Aux/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.

基序Motif氨基酸殘基數(shù)Amino acid residue number序列Sequence對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域Corresponding domainmotif133YAJAYEDREGDWMLVGDVPWEMFISNCRRLRIMDomain Ⅳmotif238IFVKVSMDGAPYLRKIDLKVYDGYEELRDALEDMFKCFDomain Ⅲmotif319KAQVVGWPPVRSNRRNSFQDomain Ⅱmotif99TELRLGLPGDomain Ⅰ

2.2.3 GO功能分類和KEGG富集分析 GO功能分類(表4)結(jié)果表明：5個(gè)BsAux/IAA蛋白的功能均包含細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程和分子功能3個(gè)大類。在細(xì)胞組分大類中，5個(gè)BsAux/IAA蛋白均被注釋到細(xì)胞核和細(xì)胞器；在生物學(xué)過(guò)程大類中，被注釋到信號(hào)通路、發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、轉(zhuǎn)錄、代謝過(guò)程、激素反應(yīng)和鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的BsAux/IAA蛋白分別有5、5、5、5、5、3和1個(gè)；在分子功能大類中，被注釋到結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、催化活性、蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性和電壓門控鈉通道活性的BsAux/IAA蛋白分別有5、4、1、1和1個(gè)。KEGG富集分析結(jié)果表明：5個(gè)BsAux/IAA蛋白均參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

表4 白及Aux/IAA蛋白的GO功能分類1)

Table 4 GO function classification of Aux/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.1)

1)√：表示蛋白質(zhì)具有該功能Indicating the protein has this function.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果(圖4)表明：這些Aux/IAA蛋白被分成GroupⅠ和GroupⅡ 2個(gè)亞家族，且GroupⅠ又被分成a和b 2個(gè)亞群；供試5個(gè)BsAux/IAA蛋白均屬于GroupⅠ亞家族，其中BsAux/IAA3、BsAux/IAA4和BsAux/IAA5屬于a亞群，而BsAux/IAA1和BsAux/IAA2屬于b亞群?？傮w來(lái)看，BsAux/IAA1、BsAux/IAA2、BsAux/IAA4和BsAux/IAA5與鐵皮石斛Aux/IAA的親緣關(guān)系較近，而BsAux/IAA3與擬南芥Aux/IAA的親緣關(guān)系較近。

3 討論和結(jié)論

生長(zhǎng)素是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要內(nèi)源激素，Aux/IAA基因是調(diào)控植物體內(nèi)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵基因[19]。本研究共鑒定出5個(gè)白及Aux/IAA基因，明顯低于黃瓜(CucumissativusLinn.)[20]、水稻(OryzasativaLinn.)[21]、油菜(BrassicanapusLinn.)[1]、木瓜(CaricapapayaLinn.)[22]和土豆(SolanumtuberosumLinn.)[23]，這可能與本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果(受到取樣和測(cè)序限制)進(jìn)行分析有關(guān)，具體原因有待深入研究。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明：5個(gè)白及Aux/IAA蛋白均被定位在細(xì)胞核中，說(shuō)明白及Aux/IAA蛋白可能在細(xì)胞核中起作用，推測(cè)這可能是因?yàn)锳ux/IAA蛋白含有2個(gè)核定位信號(hào)(NLS)[24]。

根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果，僅有BsAux/IAA1蛋白包含Domain Ⅰ、Domain Ⅱ、Domain Ⅲ和Domain Ⅳ 4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，與擬南芥[25]、水稻[26]、玉米(ZeamaysLinn.)[10]和黃瓜[27]等植物的Aux/IAA蛋白保守結(jié)構(gòu)域相似，可見，植物Aux/IAA蛋白具有一定的保守性。但BsAux/IAA2、BsAux/IAA3、BsAux/IAA4和BsAux/IAA5蛋白卻存在不同程度的保守結(jié)構(gòu)域缺失。例如：BsAux/IAA2、BsAux/IAA3和BsAux/IAA5均缺少具有轉(zhuǎn)錄抑制功能的保守結(jié)構(gòu)域Domain Ⅰ(motif9)[5]，BsAux/IAA2和BsAux/IAA3缺少具有蛋白質(zhì)降解功能的保守結(jié)構(gòu)域Domain Ⅱ(motif3)[28]，BsAux/IAA2和BsAux/IAA5缺少具有自身二聚化功能的保守結(jié)構(gòu)域Domain Ⅲ(motif2)[29]。推測(cè)造成BsAux/IAA蛋白部分保守結(jié)構(gòu)域缺失的原因可能是在白及生長(zhǎng)繁育進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了基因突變導(dǎo)致的序列改變，致使部分BsAux/IAA蛋白只具備Aux/IAA蛋白的典型功能或擁有新功能，且不再參與生長(zhǎng)素的信號(hào)響應(yīng)。

Bs：白及Bletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.；At：擬南芥Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.；Do：鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo.

圖4 白及與擬南芥和鐵皮石斛Aux/IAA蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.4 Phylogenetic tree of AUX/IAA proteins ofBletillastriata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.，Arabidopsisthaliana(Linn.)Heynh.，andDendrobiumofficinaleKimura et Migo

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明：BsAux/IAA1、BsAux/IAA2、BsAux/IAA4和BsAux/IAA5與鐵皮石斛Aux/IAA的親緣關(guān)系較近，而BsAux/IAA3與擬南芥Aux/IAA的親緣關(guān)系較近，說(shuō)明多數(shù)BsAux/IAA蛋白與鐵皮石斛Aux/IAA蛋白的功能相似。

GO功能分類結(jié)果表明：5個(gè)BsAux/IAA蛋白具有細(xì)胞組分、生物學(xué)過(guò)程和分子功能3大類功能，且均具有結(jié)合功能，說(shuō)明BsAux/IAA基因具有組織特異性、發(fā)育依賴性和非生物脅迫應(yīng)答性，這為白及新品種的遺傳改良及在轉(zhuǎn)錄水平控制Aux/IAA基因表達(dá)等研究提供了新方向。然而，由于取樣和測(cè)序的局限性，本研究?jī)H鑒定出白及部分Aux/IAA蛋白的序列，關(guān)于白及Aux/IAA蛋白的研究還有待深入。

綜上所述，白及Aux/IAA蛋白具有一定的保守性，可能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，并具有組織特異性、發(fā)育依賴性和非生物脅迫應(yīng)答性。