謝鵬, 任真奎, 呂菊, 胡玉梅, 吳昌學(xué)*, 禹文峰*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 3.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗科，貴州 興義 562400)

腦卒中是世界上排名第二的死亡原因，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。腦血管破裂或阻塞引起的大腦缺血再灌注損傷是導(dǎo)致腦卒中的主要原因，缺血再灌注損傷是卒中大腦損傷的一個不可逆性事件。研究表明，缺血再灌注導(dǎo)致的細胞線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、能量耗竭、氨基酸興奮性中毒、神經(jīng)炎癥和鈣離子負荷超載等過程都參與了缺血再灌注損傷[2-4]，提示缺血再灌注損傷是一個復(fù)雜的病理過程。因此，明確缺血再灌注損傷的分子機理對認識腦卒中的發(fā)病機制及治療具有重要意義。自噬體是指細胞內(nèi)部形成一個包裹胞質(zhì)成分或衰老細胞器的雙層膜泡[5]，自噬體外膜與溶酶體膜融合，形成自噬溶酶體，利用溶酶體內(nèi)的水解酶降解被包裹的成分，并將降解的小分子物質(zhì)合成新的細胞成分。正常生理狀態(tài)下，自噬過程會維持在本底水平以維持細胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但在應(yīng)激、饑餓等刺激條件下可被誘導(dǎo)至較高的水平[6-7]。細胞內(nèi)自噬水平的異常調(diào)控會導(dǎo)致如癌癥、肌肉疾病、代謝疾病、感染和神經(jīng)退行性疾病等一系列疾病的發(fā)生[8-9]；自噬是一個具有雙重作用的生理過程，對維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有積極作用，但異常的細胞自噬調(diào)控過程會導(dǎo)致機體出現(xiàn)“自噬性的死亡”[10-11]。近年的研究顯示，組織缺血缺氧會導(dǎo)致細胞產(chǎn)生自噬反應(yīng)，進而調(diào)節(jié)機體自身的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，當(dāng)自噬功能障礙時又會反過來協(xié)同加劇細胞組織壞死[12-14]。目前自噬在缺血再灌注損傷中的作用尚不清楚，因此，本研究通過對氧糖剝奪/復(fù)氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)體外構(gòu)建的缺血再灌注高分化大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細胞(PC12)模型來探討自噬在缺血再灌注損傷中的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

PC12細胞系購買自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，DMEM培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)、胎牛血清(美國Gibco 公司)、DMEM無糖培養(yǎng)基(美國Gibco 公司)、磷酸鹽緩沖溶液(以色列Biological Industries)、蛋白酶抑制劑(CST)、0.25%胰酶消化液(美國Gibco公司)、雙染細胞凋亡檢測試劑盒(貝博生物)和ROS檢測試劑盒(貝博生物)、ECL-Plus發(fā)光液(賽默飛世爾科技有限公司)、PVDF膜(美國Millipore公司)，微管相關(guān)蛋白輕鏈-1A/1B (microtubule-associated protein 1A/1B-light, LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ)、泛素結(jié)合蛋白(P62)、自噬相關(guān)基因BECN1(Beclin-1)和凋亡分子裂解型胱天蛋白水解酶3 (Cleaved-caspase3)抗體購買自美國CST。

1.2 方法

1.2.1PC12細胞培養(yǎng)及缺血再灌注模型建立 1%雙抗+10%FBS+89%DMEM培養(yǎng)基配方傳代培養(yǎng)細胞，當(dāng)細胞密度長至80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。細胞按2×105/孔密度接種至六孔板內(nèi)，細胞密度長至70%時進行缺血再灌注模型建立。對合適密度的細胞吸棄原培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗細胞兩遍后加2 mL無糖培養(yǎng)基(不含血清)，置于三氣培養(yǎng)箱[37 ℃，1%氧氣(O2)+94%氮氣(N2)+5%二氧化碳(CO2)]進行OGD處理，OGD 4 h后棄原培養(yǎng)基，PBS洗細胞兩遍，加高糖培養(yǎng)基2 mL(不含血清),置于正常培養(yǎng)箱(37 ℃，5%CO2)行復(fù)氧糖處理以模擬再灌注(reoxygenation)，后于不同時間段(0、6、12、18和24 h)進行后續(xù)干預(yù)處理。

1.2.2實驗分組及干預(yù)處理 實驗分為正常對照組(Control)、缺氧4 h組(OGD4)、缺氧4 h復(fù)氧(OGD4/R)不同時間段組(OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18、OGD4+R24)、自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)預(yù)處理再缺氧/復(fù)氧組(OGD/R+3-MA)。Control組細胞在含正常糖培養(yǎng)基置于正常氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)作為對照；OGD4/R組細胞按上述方法進行培養(yǎng)處理；OGD/R+3-MA組細胞先進行3-MA(2.5 mmol/L)預(yù)處理2 h后再行OGD4/R24處理作為藥物干預(yù)處理組。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 分組干預(yù)處理后的細胞按照說明書操作步驟進行流式分析檢測細胞的凋亡水平變化。不含EDTA的胰酶消化細胞后離心收集，預(yù)冷PBS洗滌細胞兩次，去除PBS后用結(jié)合液400 μL懸浮細胞，在懸液中加入Annexin V-FITC染色液5μL，輕輕混勻后避光孵育15 min，再加入PI染色液10 μL輕輕混勻避光孵育5 min，上機流式細胞儀檢測細胞凋亡率變化，結(jié)果以百分比表示。

1.2.4DCFH-DA熒光探針法檢測細胞活性氧(ROS) 收集干預(yù)處理后的細胞樣本按照操作說明書步驟進行，用不含血清的培養(yǎng)基按照1 ∶1 000的比例稀釋活性氧檢測探針，離心收集后的細胞用預(yù)冷的PBS洗細胞，離心后用按比例稀釋的探針1 mL重懸細胞置于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育細胞45 min，其間輕輕顛倒混勻4次，孵育結(jié)束后用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，1 000 r/min離心收集細胞，最后用培養(yǎng)基0.5 mL懸浮細胞進行上機檢測分析，平均熒光強度表示ROS含量，結(jié)果以相對Control組的倍數(shù)表示。

1.2.5細胞自噬(P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ)和凋亡(Cleaved-caspase3)相關(guān)分子檢測 采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62、自噬相關(guān)基因Beclin-1和凋亡分子Cleaved-caspase3的表達變化。細胞經(jīng)過干預(yù)處理后，吸棄培養(yǎng)基，PBS洗細胞兩遍，盡量吸棄PBS后按每孔120 μL的量加裂解液(RIPA)，置于冰上裂解細胞5 min后用細胞刮刀收集細胞至1.5 mL干凈的離心管中，于冰上繼續(xù)裂解20 min后，12 000 r/min離心收集上清至新的干凈1.5 mL離心管中。采用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，5×SDS buffer，100 ℃，5～10 min變性蛋白后按每孔30 μg等量上樣30 mA恒流電泳分離蛋白，220 mA恒流轉(zhuǎn)膜120 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉室溫封閉膜1.5 h，PBST洗膜5 min后孵育一抗，4 ℃搖床過夜；次日，每10 min 1×TBST洗膜3次,室溫孵育二抗2 h,每10 min TBST洗膜3次，ECL-Plus發(fā)光液于GeneGnome XRQ曝光，GAPDH作為內(nèi)參，ImageJ軟件進行蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OGD4 h后復(fù)氧不同時間PC12細胞凋亡的影響

與Control組比較，OGD4+R6、OGD4+R12、OGD4+R18和OGD4+R24組誘導(dǎo)了PC12細胞凋亡率明顯升高，細胞凋亡率伴隨復(fù)氧時間的延長而增加，其中OGD4+R24組細胞凋亡率最高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為細胞流式圖；B為凋亡率柱狀圖；(1)與control組比較P<0.05。圖1 OGD4 h后復(fù)氧不同時間對PC12細胞凋亡的影響Fig.1 Effects of apoptosis of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.2 OGD4 h后不同復(fù)氧時間對PC12細胞ROS的影響

與Control組比較，OGD4、OGD4+R6和OGD4+R12、OGD4+R18和OGD4+R24組誘導(dǎo)ROS升高，細胞 ROS伴隨復(fù)氧時間的延長而增加，其中OGD4+R24組細胞ROS最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為ROS熒光強度，B為ROS相對表達倍數(shù)柱狀圖；(1)與control組比較,P<0.05。圖2 OGD4 h后復(fù)氧不同時間對PC12細胞ROS的影響Fig.2 Effects of ROS production of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.3 OGD4 h后復(fù)氧不同時間對P12細胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Cleaved-caspase3表達的影響

與Control組比較，OGD4 h后復(fù)氧不同時間段(R0、R6、R12、R18和R24 h)組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率、P62、Beclin-1和C-caspase3的表達均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。結(jié)果顯示，OGD4+R24組細胞自噬和凋亡相關(guān)分子水平上升最高，因此后續(xù)的實驗中選擇OGD4+R24組作為藥物干預(yù)的模型組。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對表達量柱狀圖； (1)與control組比較P<0.05。圖3 OGD4 h后復(fù)氧不同時間對PC12細胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和C-caspase3表達的影響Fig.3 Expression of P62,Beclin-1,LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ and C-caspase3 of PC12 cells on the different time of reoxygenation after OGD 4 h

2.4 3-MA減少對OGD/R處理后P12細胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Cleaved-caspase3表達的影響

與OGD4+R24組比較，OGD/R+3-MA組相關(guān)的自噬分子P62、Beclin-1的表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比率以及凋亡分子C-caspase3的表達明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Western blot條帶圖，B為相對表達量柱狀圖； (1)與OGD/R組比較，P<0.05。圖4 3-MA對OGD/R處理后PC12細胞P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和C-caspase3表達的影響Fig.4 Effects of 3-MA on OGD/R induced expression of P62,Beclin-1,LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ and C-caspase3

3 討論

腦卒中主要是由于大腦缺血和缺血后再灌注損傷所導(dǎo)致的疾病。目前，大腦缺血再灌注損傷的分子病理假說主要有以下幾個方面：(1)缺血導(dǎo)致的局部血流供應(yīng)中斷和能量耗竭使神經(jīng)元發(fā)生不可逆性的壞死[15]；(2)缺血后再灌注引發(fā)的興奮性氨基酸中毒反應(yīng)；(3)缺血和再灌注階段過量生成的自由基(ROS和NO)引發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[16]；(4)缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細胞發(fā)生神經(jīng)炎癥反應(yīng)[13]；(5)缺血再灌注導(dǎo)致神經(jīng)細胞線粒體功能障礙，進而引發(fā)神經(jīng)細胞凋亡等幾個方面的假說[17]。缺血再灌注損傷復(fù)雜的分子機制為腦卒中的預(yù)防和治療帶來了困難[18-19]。因此，闡明缺血再灌注損傷的分子機制對腦卒中的預(yù)防及治療具有重要意義。

近年來有研究表明，自噬參與了諸如癌癥、代謝類疾病和神經(jīng)退行型性等疾病的病理過程[20-22]。但是對于其確切的分子機理認識是不清楚的。研究報道，在缺血再灌注心肌的細胞模型上，觀察到了自噬水平的異常升高且加劇了心肌細胞的損傷，給予自噬相關(guān)的抑制劑可以有效緩解缺血再灌注誘導(dǎo)的細胞損傷[23]。與此相反地，有研究表明，藥物或者非編碼RNA等在MCAO模型大鼠上可以激活神經(jīng)細胞自噬并發(fā)揮減緩缺血再灌注損傷的作用[24-25]。顯然，自噬在缺血再灌注損傷中的確切分子機制是不清楚的，有待更多的實驗研究闡釋。

本研究PC12細胞運用于經(jīng)典的OGD/R模型上，探討不同再灌注時間對細胞損傷和自噬的影響。研究發(fā)現(xiàn)，隨著缺血后再灌注時間的延長，細胞的凋亡水平和ROS含量是不斷增加的，ROS是機體細胞代謝過程產(chǎn)生一類強氧化性物質(zhì)，機體本身具有清除活性氧的能力，但是過量生成的活性氧會導(dǎo)致機體抗氧化系統(tǒng)障礙，ROS氧化生物有機體細胞的細胞器導(dǎo)致細胞功能障礙，這樣的過程對神經(jīng)細胞而言是致命性的損傷。神經(jīng)細胞功能障礙是多種神經(jīng)退型性疾病的主要原因。在缺血后再灌注的不同時間段，本研究檢測到自噬的水平是不斷增加的，細胞的凋亡水平也是伴隨著升高的。自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1/GAPDH的比例增加，裂解型的Caspase3表達水平升高，有趣的是，在再灌注的剛開始6 h內(nèi)，自噬水平升高的同時凋亡水平并沒有顯著升高，但是隨著再灌注的時間延遲，凋亡的水平逐漸升高，并伴隨著功能障礙性的自噬出現(xiàn)。據(jù)此推測，在再灌注的早期階段，自噬對細胞發(fā)揮著積極地保護作用，但隨著后期再灌注時間的延長，自噬功能障礙，自噬小體堆積進而反過來加劇細胞的損傷，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)自噬性的死亡，表現(xiàn)為自噬特異性降解的底物分子P62的表達增加。因此，再灌注的后期階段，本研究給予自噬特異性的抑制劑3-MA預(yù)處理，結(jié)果顯示，3-MA可以有效降低缺血再灌注誘發(fā)的細胞凋亡，減少細胞的自噬水平。

綜上所述，本次研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注的后期階段(18～24 h)誘導(dǎo)PC12細胞發(fā)生自噬性的死亡，表現(xiàn)為細胞凋亡水平升高，自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅰ向LC3Ⅱ翻轉(zhuǎn)的比率增加，自噬特異性降解底物P62表達堆積；特異性自噬抑制劑3-MA可以顯著降低缺血再灌注后期階段誘導(dǎo)的自噬水平并減少再灌注誘導(dǎo)的凋亡水平升高。