胡智成，金濤，費(fèi)櫻

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附院 臨床檢驗(yàn)中心，貴州 貴陽 550004; 3.瑞典哥德堡大學(xué) 風(fēng)濕與炎癥醫(yī)學(xué)研究中心，瑞典 41346)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)屬于葡萄球菌屬，為革蘭陽性球菌，是人類重要的致病菌之一，可引起社區(qū)或醫(yī)院性感染，如果未能及時(shí)治療，感染可擴(kuò)散至周圍組織或經(jīng)菌血癥轉(zhuǎn)移至其他器官[1]。金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致感染性關(guān)節(jié)炎最常見的致病菌[2]，該菌可分泌多種毒力因子，血管性血友病因子結(jié)合蛋白(von Willebrand factor binding protein，vWbp)是其中之一。vWbp可與血管性血友病因子(von Willebrand factor，VWF)結(jié)合引發(fā)凝血反應(yīng)[3]。醋酸去氨加壓素(desmopressin，DDAVP)是臨床上最常用于治療輕中度血管性血友病(von Willebrand disease，VWD)的藥物[4]，可促進(jìn)病人血液中的VWF和凝血因子VIII釋放,提高血小板功能和機(jī)體的凝血功能[5]。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠感染性關(guān)節(jié)炎模型[6]來研究VWF在感染性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 NMRI雌性小鼠，6～12周齡，購自荷蘭實(shí)驗(yàn)室(Envigo，the Netherlands)；VWF基因敲除鼠，6～12周齡，由比利時(shí)魯汶大學(xué)血栓研究實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予[7]。小鼠的飼養(yǎng)條件及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理均符合瑞典哥德堡動(dòng)物研究倫理委員會(huì)的要求。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 DDAVP商品名為Minirin，規(guī)格為4 g/L，購自Ferring L?kemedel AB 公司(馬爾默，瑞典)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)中用到的金黃色葡萄球菌菌株為野生型(WT Newman)，菌株由德國圖賓根大學(xué)微生物遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。菌株用大豆胰蛋白酶肉湯甘油-80 ℃保存，每次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的菌液均定量接種血瓊脂平板以進(jìn)行菌液濃度及細(xì)菌存活能力的驗(yàn)證，菌株的處理參照文獻(xiàn)[8]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

共有兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)一，研究VWF在感染性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中的作用：隨機(jī)抽取VWF基因敲除鼠(VWF-/-)(n=7)和NMRI小鼠(n=7)分別進(jìn)行編號設(shè)立實(shí)驗(yàn)組和對照組，每只小鼠通過尾靜脈注射0.3×107CFU的WT Newman菌液。動(dòng)物采用混養(yǎng)以保證實(shí)驗(yàn)組和對照組有相同的飼養(yǎng)條件，每籠5～10只，自由飲水取食。定期監(jiān)測小鼠的體質(zhì)量和關(guān)節(jié)炎的發(fā)展情況。10 d后處死小鼠，收集血清以檢測細(xì)胞因子水平，收集四肢用于影像學(xué)檢測骨損傷情況，收集腎臟用于評估細(xì)菌承載量[9]。實(shí)驗(yàn)二，研究在使用DDAVP增加小鼠VWF含量后對小鼠感染性關(guān)節(jié)炎的影響：隨機(jī)抽取NMRI小鼠進(jìn)行編號設(shè)立Minirin組(n=13)和PBS組(n=12)，Minirin組每只小鼠腹腔注射Minirin 0.1μg[10]，PBS組注射等量的PBS 1 h后，每只小鼠通過尾靜脈注射0.3×107CFU的WT Newman菌液；其余處理與實(shí)驗(yàn)一相同。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1小鼠體質(zhì)量、存活率和關(guān)節(jié)炎指數(shù) 于實(shí)驗(yàn)開始后每日觀察小鼠一般情況、記錄存活數(shù)，且于實(shí)驗(yàn) 第3、5、7、10天記錄小鼠的體質(zhì)量，計(jì)算體質(zhì)量變化率=檢測體質(zhì)量(第n天)/原始體質(zhì)量×100%；評估小鼠的關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，評估標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]，0分為無炎癥，1分為輕微的可見腫大和紅斑，2分為中等的腫大和紅斑，3分為明顯的腫大和紅斑；關(guān)節(jié)炎指數(shù)統(tǒng)計(jì)的是每只小鼠四肢評分總和的均值，關(guān)節(jié)炎頻率是指有關(guān)節(jié)炎的小鼠數(shù)占總數(shù)的百分比，多關(guān)節(jié)炎的定義是指兩個(gè)或兩個(gè)以上關(guān)節(jié)同時(shí)有關(guān)節(jié)炎癥狀。

1.3.2小鼠雙腎膿腫程度和雙腎細(xì)菌承載量 小鼠處死后，收集雙側(cè)腎臟并對其膿腫程度進(jìn)行評分，標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[12]。0分為完全健康的雙腎；1分為雙腎無形狀改變，但有1～2處小型膿腫形成；2分為多于2處膿腫，但總面積<75%；3分為大面積的膿腫，且分布面積>75%。評估之后將腎臟研磨用定量的PBS稀釋后轉(zhuǎn)種血平板，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并估算雙腎的細(xì)菌承載量。

1.3.3小鼠四肢的影像學(xué)分析 小鼠處死后，收集的小鼠四肢關(guān)節(jié)用4%福爾馬林保存，使用微型CT掃描儀進(jìn)行掃描，所得圖像進(jìn)行三維立體(3D)結(jié)構(gòu)重建。所用儀器型號為Skyscan1176 micro-CT(Bruker，Antwerp, Belgium)，參數(shù)為55 kV、455 mA、0.2 mm鋁濾光片，曝光時(shí)間47 ms；得到的圖像用軟件NRECON(版本1.5.1，Bruker)進(jìn)行3D重構(gòu)，然后使用軟件CT-vox(版本2.4，Bruker)進(jìn)行分析。每個(gè)關(guān)節(jié)都由兩名對實(shí)驗(yàn)分組未知的課題組員進(jìn)行評估：0分，完全健康的關(guān)節(jié)；1分，有輕度骨破壞；2分，中度骨破壞；3分，明顯的骨破壞。骨損傷指數(shù)是每個(gè)關(guān)節(jié)評分的均值骨損傷頻率是有骨破壞的關(guān)節(jié)數(shù)占總關(guān)節(jié)數(shù)的比例。

1.3.4白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和角質(zhì)形成細(xì)胞衍生的細(xì)胞因子(keratinocyte-derived cytokine，KC)檢測 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測小鼠血清中的IL-6和KC，使用試劑為DuoSet ELISA Development Kit(R&D Systems Europe, Ltd)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 第一階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1一般情況 隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠精神逐漸萎靡，活動(dòng)量、攝食量減少，出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、關(guān)節(jié)僵直等情況，嚴(yán)重可出現(xiàn)跛行甚至殘疾。

2.1.2小鼠體質(zhì)量變化率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)炎發(fā)生頻率 實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠體質(zhì)量變化率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.05)，見圖1A；從實(shí)驗(yàn)第3天起，實(shí)驗(yàn)組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)炎頻率均明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見圖1B和圖1C。

注：(1)與對照組相比，P<0.05；(2)與對照組相比，P<0.01。圖1 兩組小鼠體質(zhì)量、關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)炎頻率的變化Fig.1 The changes of body weight, arthritis index and arthritis frequency in two groups

2.2 第二階段實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1小鼠體質(zhì)量變化率、存活率 兩組小鼠體質(zhì)量在感染后呈持續(xù)下降趨勢(圖2A)；小鼠病死情況于感染后第6天開始出現(xiàn)，最終Minirin組的存活率為76.9%，PBS組的存活率為91.7%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.4)，見圖2B。

圖2 Minirin組和PBS組小鼠體質(zhì)量、存活率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)炎頻率和多關(guān)節(jié)炎頻率的變化Fig.2 The changes of body weight, survival rate, arthritis index, arthritis frequency, and multiple arthritis frequency in Minirin and PBS groups

2.2.2小鼠關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)炎頻率和多關(guān)節(jié)炎頻率 兩組小鼠在感染后第3天開始均出現(xiàn)程度不一的關(guān)節(jié)炎癥狀、關(guān)節(jié)及皮膚表面出現(xiàn)紅腫等炎癥變化。與PBS組比較，Minirin組關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)炎頻率和多關(guān)節(jié)炎頻率較低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2C、圖2D和圖2E。

2.2.3小鼠關(guān)節(jié)影像學(xué)檢查 Minirin組和PBS組骨損傷指數(shù)和骨損傷頻率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.18)，見圖3A。PBS組小鼠骨損傷頻率為21.7%，Minirin組為30.1%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.99)，見圖3B。影像學(xué)檢查顯示，Minirin組和PBS組均出現(xiàn)骨損傷表現(xiàn)，與無損傷的關(guān)節(jié)比較，受損的骨關(guān)節(jié)可見骨結(jié)構(gòu)不完整，骨質(zhì)表面粗糙，并有空洞形成，見圖4 A～圖4E。

圖3 Minirin組和PBS組小鼠骨損傷指數(shù)和骨損傷頻率Fig.3 Bone injury index and frequency of bone injury in Minirin and PBS groups

注： (1)為PBS組小鼠無損傷骨影像學(xué)圖片，(2)為Minirin組損傷骨影像學(xué)圖片；A為前掌，B為肩關(guān)節(jié)，C為髖關(guān)節(jié)，D為膝關(guān)節(jié)，E為后腳掌；箭頭為骨損傷處。圖4 Minirin組和PBS組小鼠的關(guān)節(jié)影像學(xué)表現(xiàn)Fig.4 The joint imaging findings of mice in Minirin and PBS groups

2.2.4腎臟腫脹指數(shù)、雙腎細(xì)菌承載量及小鼠血清中IL-6、KC表達(dá)水平 在腎臟的膿腫程度和細(xì)菌承載量方面，Minirin組和PBS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.22，P=0.22)，見圖5A和圖5B。小鼠血清中IL-6、KC的表達(dá)水平進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.81，P=0.31)，見圖5C。

注： A為腎臟膿腫指數(shù)，B為腎臟細(xì)菌承載量，C為小鼠血清中IL-6、KC水平。圖5 Minirin組和PBS組小鼠腎臟腫脹指數(shù)、腎臟細(xì)菌承載量及小鼠血清中IL-6、KC水平Fig.5 The kidney swelling index, kidney bacterial load and the levels of serum IL-6 and KC in Minirin and PBS groups

3 討論

感染性關(guān)節(jié)炎主要由細(xì)菌感染引起，常累及一個(gè)或多個(gè)關(guān)節(jié)，以膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)最為常見[13]。因病情進(jìn)展迅速、死亡率高、愈后差，被認(rèn)為是最危險(xiǎn)的關(guān)節(jié)疾病之一[14]。其發(fā)病機(jī)制涉及到固有免疫、獲得免疫系統(tǒng)的啟動(dòng)和促炎癥因子的激活，最終因一系列復(fù)雜的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致受感染關(guān)節(jié)骨損傷及骨質(zhì)破壞[15]，如果不予及時(shí)治療，數(shù)日內(nèi)將會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)的不可逆損傷。

感染性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵是細(xì)菌侵入關(guān)節(jié)，而金黃色葡萄球菌作為最常見的病原菌[16]，通過血源性傳播到達(dá)關(guān)節(jié)滑膜是其主要的致病途徑[17]。金黃色葡萄球菌的致病力與其產(chǎn)生的凝固酶和毒力因子有關(guān)。vWbp一方面可激活凝血酶原，將纖維蛋白原裂解成纖維蛋白，將菌體包裹其中利于抵抗宿主免疫系統(tǒng)的清除[18]；另一方面，vWbp通過與VWF的結(jié)合，幫助金黃色葡萄球菌粘附于血管內(nèi)皮細(xì)胞[19]，從而有助于細(xì)菌侵入組織。之前有研究顯示敲除vWbp基因后將會(huì)降低金黃色葡萄球菌的致病力[20]，本實(shí)驗(yàn)室近期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明，對比野生型金黃色葡萄球菌，敲除vWbp的菌株對關(guān)節(jié)炎的致病能力有明顯下降，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)vWbp與VWF的結(jié)合更是導(dǎo)致感染性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵(此部分?jǐn)?shù)據(jù)暫未發(fā)表)。

因此本文通過DDAVP能夠增加體內(nèi)VWF的釋放，以改善機(jī)體凝血功能為切入點(diǎn)來研究機(jī)體VWF增高后金黃色葡萄球菌毒力因子對感染性關(guān)節(jié)炎的影響，對于臨床的治療和預(yù)后具有一定的指導(dǎo)價(jià)值。DDAVP是對天然精氨酸加壓素的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾后人工合成的類似物，它具有類似的生理功能，即能夠促進(jìn)機(jī)體血液中的VWF的釋放。VWF近年被發(fā)現(xiàn)是多種炎性疾病的新的炎癥標(biāo)志物，炎癥時(shí)由血管上皮細(xì)胞迅速釋放，它能夠直接與白細(xì)胞結(jié)合或通過募集血小板而使白細(xì)胞聚集，從而進(jìn)一步使炎癥反應(yīng)加重[21]。基于此，機(jī)體內(nèi)的VWF是否是影響感染性關(guān)節(jié)炎的主要關(guān)鍵因素，以及若在機(jī)體內(nèi)VWF相對較高的前提下，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率是否會(huì)相應(yīng)增高是本次研究的目的。在本研究中，相較于普通小鼠，VWF基因敲除小鼠體質(zhì)量減輕明顯較少，關(guān)節(jié)炎的發(fā)生頻率和嚴(yán)重程度都明顯降低。說明VWF參與了感染性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。那若通過給予小鼠DDAVP增加其體內(nèi)VWF含量，是否會(huì)使關(guān)節(jié)炎的發(fā)生率增加、骨質(zhì)破壞程度加重？在第二階段實(shí)驗(yàn)中，小鼠接受DDAVP預(yù)處理后，無論在關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展，還是骨質(zhì)損傷和體內(nèi)促炎癥因子的表達(dá)水平上均無明顯差異，但是可以看出Minirin組在體質(zhì)量下降率、死亡率及關(guān)節(jié)的損傷程度上比PBS組要高。說明在感染性關(guān)節(jié)炎時(shí)，病情的發(fā)生發(fā)展可能與當(dāng)時(shí)體內(nèi)VWF的濃度在一定的程度上有相關(guān)性，這可能與小鼠血漿中VWF與金黃色葡萄球菌分泌的vWbp結(jié)合受體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境所限制，亦或是體內(nèi)VWF的本底表達(dá)量已足夠有關(guān)。

綜上，VWF是影響感染性關(guān)節(jié)炎的因素之一，且在一定程度上VWF與vWbp的結(jié)合對感染性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展具有一定的影響，但關(guān)節(jié)炎的病情牽涉到復(fù)雜的病理發(fā)展過程，因此，要想尋找抗感染治療的新的可行方向，還需要對其致病的機(jī)制和治療方案進(jìn)行更深入的研究。