程泳春 ，李佳歡 ，蘇財自 ，張紫華 ，胡開輝 **

（1.福建福泉鑫生物科技有限公司，福建 寧德 352200；2.福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；3.福建農林大學（古田） 菌業(yè)研究院，福建 寧德 352200）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreous） 又名真姬菇、海鮮菇、白玉菇等，是福建省食用菌工廠化生產的重要品種之一。目前國內外對斑玉蕈的栽培研究主要集中在栽培技術優(yōu)化[1]、栽培特性[2]、出菇管理[3]、子實體營養(yǎng)物質等方面[4-5]，缺乏對栽培菌包的培養(yǎng)關鍵因子——溫度的精準研究。在栽培過程僅憑生產經(jīng)驗來設置培養(yǎng)溫度，致使一年四季菌包成熟度差異大，菌包培養(yǎng)精準化程度低，造成產品產量、品質不穩(wěn)定。

斑玉蕈是一種喜低溫食用菌，菌絲滿袋時間一般為50 d左右，滿袋后還需要后熟階段60 d～70 d的培養(yǎng)。已有研究指出，在斑玉蕈栽培技術中，溫度是影響菌絲生長與菌包酶活力的重要因素，溫度對菌絲生長速度、子實體產量等均有影響[6]。斑玉蕈菌絲生長最適溫度為23℃，但對栽培基質的降解主要依靠菌絲分泌的如纖維素降解酶等酶系。魏巍等[7]在靈芝出芝溫度對其基質物酶活影響的研究中指出，隨著溫度升高，木質素酶系和纖維素酶系酶活力增加，且較高的溫度更利于纖維素酶的分泌，但溫度超過35℃時，靈芝將無法出芝。在一定范圍內，培養(yǎng)溫度越高，酶活力越高，酶解速度快，菌包易積累營養(yǎng)物質，有效促進生理成熟，但過高的溫度會影響食用菌子實體的形成。因此，如何確定后熟階段斑玉蕈菌包培養(yǎng)的最適溫度，在保證菌絲生長的同時提高胞外酶活力，縮短斑玉蕈后熟時間，成為了目前斑玉蕈生產過程中亟待解決的問題之一。

對此，通過開展不同溫度對斑玉蕈后熟階段理化性質、酶活變化以及出菇產量的影響研究，以期揭示溫度影響斑玉蕈后熟階段的原因，為工廠化生產過程中后熟階段溫度的設置提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試斑玉蕈菌株，由福建福泉鑫生物科技有限公司提供。

棉籽殼48%、麩皮20%、木屑10%、甘蔗10%、豆粕5%、玉米粉5%、石灰2%，栽培料含水量63%。機械自動打包，打包重量（1 250±20） g（濕重），121℃滅菌120 min，冷卻后接種，置于25℃發(fā)菌房中黑暗培養(yǎng)。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 菌包外觀及重量

接種后60 d，菌絲長滿袋標志著菌包進入后熟階段；選取相同重量的斑玉蕈菌包分別放入23℃、26℃、29℃、32℃、35℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔10 d取樣1次，稱量菌包重量，觀察菌絲顏色變化，設置3個重復，至120 d結束取樣。

1.2.2 生理生化指標測定

1） 樣品處理

將每個菌包培養(yǎng)基質充分攪碎混勻，稱取20 g于250 mL燒杯中，加蒸餾水80 mL，25℃、150 r·min-1振蕩，過濾后取濾液于50 mL離心管，9 000 r·min-1離心15 min，上清液即為提取液。

2） 菌包 pH

采用pH計測定菌包提取液的pH。

3） 還原糖含量

采用3，5-二硝基水楊酸（DNS） 比色法測定還原糖含量。

4）可溶性蛋白含量

采用考馬斯亮藍法[8]測定可溶性蛋白含量。

5）關鍵基質降解酶活性

纖維素酶參考姜性堅等[9]方法測定，酶活力單位定義為在50℃、pH 4.6條件下，每分鐘水解底物生成1 μg葡萄糖，定義為1個酶活力單位“U”。

木聚糖酶參考王孟蘭[10]等方法測定，酶活力單位定義為在50℃、pH 5.2條件下，每分鐘水解底物生成1 μg的D-木糖，定義為1個酶活力單位“U”。

中性蛋白酶采用福林-酚試劑法測定，酶活力單位定義為在40℃、pH 7.2條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1 μg的L-酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位“U”。

1.2.3 出菇試驗

取樣結束后（菌包培養(yǎng)120 d時），取5個溫度下菌包各24包，同時放入相同的環(huán)境中進行出菇實驗；記錄原基形成時間、采收時間、出菇產量及品質，進行比較分析，觀察溫度對菌包出菇的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理

取樣結束后，將不同溫度培養(yǎng)菌包試驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，并用EXCEL軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 后熟階段不同培養(yǎng)溫度菌包外觀及重量變化

菌包60 d至出菇之前，斑玉蕈菌包轉色情況，見圖 1，A、B、C、D、E分別代表 23℃、26℃、29℃、32℃、35℃條件下培養(yǎng)的菌包。

從圖1中可以看出，菌袋顏色隨著時間延長逐漸轉變。對比不同溫度對菌包外觀的影響可以發(fā)現(xiàn)，23℃～29℃菌袋顏色逐漸由淺白色變成淺黃色，顏色之間的差異較??；32℃菌包顏色較23℃～29℃時明顯加深，且菌絲濃密度較低；35℃、70 d菌包顏色相對其他溫度顏色較深，且在80 d時明顯觀察到綠霉感染，隨后綠霉蔓延。溫度對菌包重量的影響見圖2。

由圖2可以看出，菌包重量隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低。23℃～32℃時菌包重量隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低，32℃高溫使得菌包水分蒸發(fā)增多，菌包重量略低于23℃～29℃時菌包重量；35℃在整個培養(yǎng)階段重量均低于其他溫度，在100 d時菌包重量顯著下降。

2.2 后熟階段不同培養(yǎng)溫度菌包生理生化指標變化

2.2.1 pH 變化

斑玉蕈在生長過程中，利用大量的碳水化合物來維持菌體的生長和新陳代謝，同時會產生有機酸，使菌包pH下降[11]。菌包pH變化可一定程度反應菌絲消耗碳水化合物的情況。后熟階段不同培養(yǎng)溫度菌包pH變化見圖3。

從圖3可以看出，23℃～32℃時不同溫度菌包的pH隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸下降，23℃、26℃、29℃時pH降低的速率相差不大，120 d時菌包pH均維持在5.7左右；32℃培養(yǎng)時，pH下降速度較為緩慢，120 d時菌包pH維持在6.26；35℃時pH先上升后在100 d時下降，120 d時pH為7.30，可能是由于霉菌感染導致斑玉蕈菌絲自溶，菌包pH上升，后期綠霉大量繁殖導致菌包pH下降。

2.2.2 還原糖含量變化

菌包中還原糖含量可以反應斑玉蕈菌絲對基質的營養(yǎng)利用情況，后熟階段不同培養(yǎng)溫度菌包還原糖含量變化見圖4。

從圖4中可以看出，23℃～29℃時菌包中還原糖含量逐漸上升后有所下降，且后熟期培養(yǎng)溫度越高，菌包內積累還原糖含量越高，其中29℃時，120 d菌包的包內還原糖含量達到了 1 770.56 mg·L-1；32℃時菌包還原糖含量隨培養(yǎng)時間延長逐漸積累，特別需注意的是100 d時還原糖含量顯著提升，在120 d達 2 070.56 mg·L-1；35℃時菌包還原糖含量在120 d時僅為395.00 mg·L-1，顯著低于其他試驗組。

2.2.3 可溶性蛋白含量變化

菌絲對培養(yǎng)基質的利用是通過分泌胞外酶來降解培養(yǎng)基質中的大分子物質，這些酶是菌包中可溶性蛋白的重要組成部分[12]。后熟階段不同培養(yǎng)溫度菌包可溶性蛋白含量變化見圖5。

由圖5可以看出，23℃～29℃時菌包培養(yǎng)溫度越高，可溶性蛋白含量越高，29℃時菌包可溶性蛋白含量 70 d 時達最高值 226.89 mg·mL-1；32℃培養(yǎng)時，可溶性蛋白含量先上升后下降，在100 d可溶性蛋白含量達到最大值 247.68 mg·mL-1；35℃時菌包可溶性蛋白含量隨培養(yǎng)時間延長逐漸升高，在110 d時達到 362.60 mg·mL-1。

2.2.4 關鍵基質降解酶活性變化情況

1）纖維素酶活力變化

羧甲基纖維素酶是一種誘導酶，分布于細胞外，通過降解培養(yǎng)基質中的纖維素，為菌絲生長提供能源[13]。不同溫度菌包的羧甲基纖維素酶隨著培養(yǎng)時間變化情況見圖6。

如圖6所示，23℃～29℃培養(yǎng)條件下羧甲基纖維素酶活力變化情況基本一致，隨培養(yǎng)時間的延長，各個溫度酶活力在一定范圍內上下波動，且培養(yǎng)溫度越高，羧甲基纖維素酶活力越強；培養(yǎng)溫度為32℃時，羧甲基纖維素酶活力明顯高于23℃～29℃的試驗組；35℃培養(yǎng)時，菌包中羧甲基纖維素酶持續(xù)升高且較其他培養(yǎng)溫度差異顯著。

2）木聚糖酶活力變化

木聚糖是木糖殘基以β-1，4木糖苷鍵連接構成，是植物細胞壁中半纖維素的主要成分，木聚糖酶通過分泌到胞外降解木聚糖，不同溫度對木聚糖酶活力影響見圖7。

如圖7所示，23℃～29℃培養(yǎng)條件下，木聚糖酶活力變化趨勢基本一致，隨培養(yǎng)時間的延長，木聚糖酶活力逐步增強；且隨培養(yǎng)溫度升高木聚糖酶活力同時也在增強；但與羧甲基纖維素酶不同的是，菌包培養(yǎng)溫度為32℃時，木聚糖酶活力明顯低于23℃～29℃試驗組；35℃培養(yǎng)時，菌包中木聚糖酶持續(xù)升高且較其他培養(yǎng)溫度差異顯著。

3）中性蛋白酶活力變化

中性蛋白酶是將蛋白質分解成小分子的短肽或氨基酸一類的代謝酶，其可以幫助菌絲有效利用氮源，在菌絲生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用[14]。不同溫度對中性蛋白酶活力影響見圖8。

由圖8可知，23℃～29℃時中性蛋白酶活變化趨勢基本相同，隨培養(yǎng)時間延長酶活力逐漸降低，說明隨著培養(yǎng)時間的延長菌絲逐漸成熟，所需的氮源降低。培養(yǎng)溫度為32℃時，菌包中性蛋白酶呈逐漸下降趨勢，中性蛋白酶活力明顯低于23℃～29℃的試驗組。培養(yǎng)溫度35℃時，菌包中性蛋白酶活力于60 d～70 d時明顯下降，可能是由于高溫環(huán)境下，斑玉蕈菌絲迅速失活，蛋白酶活力下降；70 d～80 d時由于霉菌大量繁殖，分泌大量蛋白酶利用氮源，菌包蛋白酶上升，隨后菌包中氮源被大量消耗，中性蛋白酶活力下降。

2.3 后熟階段不同培養(yǎng)溫度對出菇及農藝性狀影響

斑玉蕈菌包培養(yǎng)過程中，不同培養(yǎng)溫度對出菇的影響見表1。

表1 不同培養(yǎng)溫度對斑玉蕈出菇的影響Tab.1 Effect of different culture temperature on fruiting of Hypsizygus marmoreous

從表1可看出，隨培養(yǎng)溫度提高，原基形成和采摘時間不斷延長。可能是由于斑玉蕈是一種低溫型變溫結實性食用菌，后熟階段培養(yǎng)溫度低，菌絲活力強，菌絲恢復速度快，出菇周期較短，故23℃～26℃時，出菇原基形成時間只需9 d，23℃時，采摘時間較對照可提前3 d，26℃時提前1 d。值得一提的是，產量與溫度在23℃～29℃時也呈現(xiàn)了極顯著的相關性（R=0.978），隨培養(yǎng)溫度升高，出菇產量和生物學效率也不斷提高。29℃時菌包單袋產量可達527.76 g，這是因為在一定范圍內，溫度越高，菌絲活力雖然較弱，出菇周期延長，但是菌絲分泌胞外酶活力較高，菌絲對營養(yǎng)成分的利用程度高，出菇產量高。但當溫度過高，達到32℃時，斑玉蕈菌絲生長緩慢甚至失活，出菇周期長，產量低，而35℃時因菌包中菌絲死亡，霉菌大量污染而無法進行出菇。

不同菌包培養(yǎng)溫度對斑玉蕈出菇外觀的影響見圖9，不同菌包培養(yǎng)溫度對斑玉蕈子實體農藝性狀的影響見表2。A、B、C、D分別表示23℃、26℃、29℃、32℃時菇體外觀情況。

表2 不同菌包培養(yǎng)溫度對斑玉蕈子實體農藝性狀的影響Tab.2 Effect of different culture temperature on quality of Hypsizygus marmoreous

由圖9、表2可以直觀地看出，菌包后熟溫度對斑玉蕈出菇外觀及農藝性狀有影響，23℃～29℃培養(yǎng)條件下，斑玉蕈子實體朵型適中，菌蓋厚度、大小、菌柄長度差異不顯著，出菇較為整齊；后熟溫度為32℃時，斑玉蕈子實體朵型明顯變小而且長度短，大部分菇小于成品菇（最小8 cm） 的長度要求，子實體菌蓋偏小、菌柄長度偏短，出菇子實體整齊度差。

3 結論與討論

目前，斑玉蕈生產過程中后熟階段的溫度主要憑經(jīng)驗設置，如何科學合理的設置菌包后熟溫度是促進菌包生理成熟的關鍵。通過探究不同溫度條件下，斑玉蕈菌包后熟階段外觀、生理生化指標以及生物學效率的的變化情況，探索溫度影響斑玉蕈后熟階段的原因，可為工廠及時調整后熟階段培養(yǎng)溫度提供理論依據(jù)。

從不同溫度對斑玉蕈后熟階段菌包外觀和重量影響可以看出，隨培養(yǎng)溫度升高，菌包顏色加深，且重量逐漸減輕。其中，32℃時菌袋顏色較23℃～29℃時明顯加深，且菌包重量較輕，可能是由于斑玉蕈菌包在后熟的過程中，菌絲老化并分泌了一些次級代謝產物導致菌包顏色變黃[15]，且溫度過高導致菌包失水量大，菌包重量降低；當后熟溫度為35℃時，菌包在80 d時被綠霉感染，隨后蔓延。

不同溫度對斑玉蕈后熟階段pH、還原糖及可溶性蛋白含量的影響表明，23℃～29℃范圍內，pH隨培養(yǎng)時間增加不斷降低，還原糖、可溶性蛋白含量先上升后下降；且隨溫度升高，菌包內積累的還原糖、可溶性蛋白含量越高。當后熟溫度達32℃時，菌包pH下降速度緩慢，說明高溫會降低食用菌對營養(yǎng)成分的利用速率，這與王慶武[16]的研究一致；還原糖含量在100 d時顯著提高，可能是由于斑玉蕈菌絲老化，對基質利用情況減弱，導致還原糖生成速率大于吸收速率，菌包中還原糖積累；可溶性蛋白隨培養(yǎng)時間出現(xiàn)先增加后下降趨勢，表明溫度會抑制斑玉蕈菌絲生長，可通過可溶性蛋白含量提升來增加生物體抗性[17]；35℃培養(yǎng)時，由于菌包中霉菌滋生繁殖，由于斑玉蕈菌絲大量裂解，胞內酶溶出，霉菌滋生菌包使其營養(yǎng)被大量消耗，故pH及可溶性蛋白上升、還原糖含量下降。

不同溫度對斑玉蕈后熟階段關鍵酶活力的影響表明，培養(yǎng)溫度在23℃～29℃時，菌包中木聚糖酶、漆酶、錳過氧化物酶隨溫度的升高酶活力增強；32℃培養(yǎng)條件下，菌包纖維素酶活力較高，而中性蛋白酶力下降?？赡苁怯捎谶^高的溫度導致斑玉蕈菌絲對營養(yǎng)吸收能力下降，降低了對氮源的吸收利用，該現(xiàn)象在莫氏馬尾藻中也有出現(xiàn)[18]；當培養(yǎng)溫度達35℃時，菌包中纖維素酶與木聚糖酶活力上升，這可能是溫度過高，綠色木霉大量滋生導致[19]。

出菇研究結果表明，后熟時期培養(yǎng)溫度在23℃～32℃時可以正常出菇；培養(yǎng)溫度35℃時菌包中霉菌大量滋生無法正常出菇。29℃時出菇時間較23℃、26℃時長，但產量高。而32℃時由于菌絲體老化速度過快，出菇時間較長且生物學效率低，使子實體朵型小、成品菇少，且子實體整齊度差，該結果與菌包外觀、理化性質及酶活特性保持一致。

綜上所述，培養(yǎng)溫度在23℃～29℃時，菌包生物學參數(shù)一致，出菇周期與對照相同，且當溫度達到29℃時，出菇產量顯著提高。當溫度設置32℃時，菌包各參數(shù)與低溫相比存在較大差異，且產量顯著降低，說明適當?shù)奶岣吲囵B(yǎng)溫度有利于菌包后熟期營養(yǎng)成分積累，提高出菇產量。斑玉蕈菌包后熟期培養(yǎng)的極限溫度介于29℃～32℃。該結果有利于斑玉蕈生產企業(yè)的控制后熟階段溫度，為工廠化生產過程中后熟階段溫度的設置提供理論依據(jù)。