劉巖巖，李 紅，劉國(guó)麗，王 紅，劉俊杰，呂立濤

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧省食用菌優(yōu)質(zhì)栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

黑木耳 （Auricularia auricula） 屬擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota） 銀耳目 （Auriculariales） 木耳科（Auriculariaceae）。黑木耳屬于一種中溫型菌類(lèi)，適合在潮濕溫暖的氣候條件下生長(zhǎng)。在自然條件下，多樹(shù)發(fā)生在雨后，在枯死的樹(shù)枝干或是樹(shù)樁上生長(zhǎng)。其子實(shí)體常覆瓦狀疊生、叢生、形同人耳。剛生長(zhǎng)時(shí)為柔軟的膠質(zhì)，富彈性，生長(zhǎng)一段時(shí)間后稍帶軟骨質(zhì)，半透明狀[1]。晾曬后耳片縮小，變成黑色且硬、脆，近革質(zhì)[2]。我國(guó)可人工繁育的黑木耳優(yōu)良品種較少，大多數(shù)為野生菌種馴化得來(lái)，穩(wěn)定性和豐產(chǎn)性都較差。篩選出品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高、商品性狀好、市場(chǎng)前景佳的優(yōu)良菌株對(duì)遼寧省黑木耳產(chǎn)業(yè)發(fā)展至關(guān)重要[3-4]。通過(guò)生物學(xué)特性和蛋白標(biāo)記的方法，對(duì)遼寧省所在地區(qū)主栽的14個(gè)黑木耳栽培菌株進(jìn)行研究分析[5]，為初步篩出適合遼寧省地區(qū)栽培，且產(chǎn)量高、品質(zhì)好、抗病性強(qiáng)的黑木耳品種。為進(jìn)一步研究栽培關(guān)鍵技術(shù)鑒定了前期基礎(chǔ)，更為遼寧省黑木耳遺傳育種提供的理論和實(shí)踐參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試黑木耳菌株共14個(gè)，名稱(chēng)及來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 14個(gè)供試黑木耳菌株來(lái)源Tab.1 14 tested Auricularia auricula strains from different sources

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮土豆200 g、磷酸二氫鉀2.0 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、硫酸鎂1.5 g、蛋白胨3 g、水1 000 mL；液體同工酶試驗(yàn)培養(yǎng)基：去皮土豆200 g、磷酸二氫鉀3.0 g、葡萄糖20 g、硫酸鎂 1.5 g、維生素B12 g、蛋白胨3 g、水1 000 mL；栽培配方：硬雜木屑86%、麥麩10%、豆粉2%、石膏1%、石灰1%。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲的特性試驗(yàn)

1）固體菌落特征：將活化后的黑木耳菌種接種到平板培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)品種5個(gè)重復(fù)，24℃避光培養(yǎng)5 d～8 d；每天定時(shí)查看菌絲的生長(zhǎng)情況，當(dāng)菌種已經(jīng)長(zhǎng)滿整個(gè)平板時(shí)，比較各菌種菌絲生長(zhǎng)勢(shì)和測(cè)量菌落直徑，計(jì)算出菌絲的生長(zhǎng)速度。

2）液體發(fā)酵特征：將活化后的黑木耳菌種接種到液體PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每個(gè)品種5個(gè)重復(fù)，23℃搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r·min-1；觀察菌絲萌發(fā)時(shí)間、生長(zhǎng)情況、平均滿瓶時(shí)間及菌絲生長(zhǎng)均一性等，同時(shí)測(cè)定菌球大小、菌球密度、菌絲體干重等指標(biāo)[6-8]。

菌球大?。弘S機(jī)取培養(yǎng)基中菌球30個(gè)～50個(gè)，置于培養(yǎng)皿中緊密排成1排，測(cè)量總直徑，求出菌球平均直徑，重復(fù)3次。

菌球密度：取10 mL培養(yǎng)液，按一定比例準(zhǔn)確稀釋?zhuān)瑩u勻后取一定量在直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中攤勻，培養(yǎng)皿下墊方格紙，進(jìn)行計(jì)數(shù)，求出每毫克培養(yǎng)液中菌球個(gè)數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3次。

菌絲體干重：將培養(yǎng)好的菌液，在離心機(jī)上3 000 r·min-1離心15 min，用蒸餾水洗滌菌球，再離心，然后將菌球置于60℃恒溫干燥箱內(nèi)烘干至恒重，稱(chēng)量。

1.3.2 拮抗試驗(yàn)

每個(gè)平皿接種3個(gè)品種菌絲塊，按“品”字形排列，重復(fù)3次后，將14個(gè)品種接種到培養(yǎng)基平板上，做好標(biāo)識(shí)，25℃恒溫避光培養(yǎng)10 d～15 d；當(dāng)培養(yǎng)基平板上的菌絲相互生長(zhǎng)到彼此接觸時(shí)觀察菌絲接觸區(qū)并繼續(xù)培養(yǎng)，觀察不同品種之間是否出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。

1.3.3 同工酶試驗(yàn)

1） 同工酶鑒定

將黑木耳品種14個(gè)分別接入液體培養(yǎng)基，25℃下黑暗培養(yǎng)15 d后，4℃離心，洗滌，過(guò)濾收集搖瓶中的菌絲體，并用無(wú)菌水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱(chēng)取0.5 g菌絲體放入研缽中，加入適量液氮充分研磨后，裝入離心管中，加入等量研磨液，于4℃、10 000 r·min-1離心15 min。棄去沉淀取上清，置于2 mL離心管中，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

在4℃條件采用垂直平板聚丙烯酰胺電泳，將上清液加等體積40%蔗糖溶液，點(diǎn)樣量為30 uL[6]。以溴酚蘭為指示劑，初始電壓為100 V，進(jìn)入分離膠后加大電壓為150 V，電泳結(jié)束蒸餾水沖洗膠板，25℃染色 30 min，出褐色的清晰酶帶后漂洗數(shù)次，10%醋酸脫色固定，4℃條件下避光保存[9]。

2） 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算電泳所得全部酶帶的相對(duì)遷移率，出現(xiàn)的酶帶記為1，不出現(xiàn)的為0，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。利用數(shù)據(jù)軟件DPS 7.05進(jìn)行處理，利用數(shù)據(jù)系統(tǒng)聚類(lèi)對(duì)其進(jìn)行分析并繪制出聚類(lèi)樹(shù)狀圖。

1.3.4 栽培試驗(yàn)

1） 袋料制作

采用17 cm×33 cm×0.005 mm常壓高密度聚乙烯塑料袋栽培，每袋裝干料約為600 g[10-11]。按配方準(zhǔn)確稱(chēng)取主料、輔料，并將玉米芯等原料混合均勻，再將石膏充分溶于水中，噴灑在料堆上，攪拌均勻。拌勻時(shí)要求拌2遍后用噴灑適量的水，一邊加水一邊攪拌確保培養(yǎng)料均勻混合，濕度一致。培養(yǎng)料含水量要求達(dá)到60%左右為佳，衡量的標(biāo)準(zhǔn)要手抓料握緊后，手指縫中能看見(jiàn)有水但不滴落為宜，此時(shí)手松開(kāi)后料不散結(jié)成團(tuán)，自然放下觸地即散[12]。

2）滅菌

采用常壓蒸汽滅菌鍋滅菌，需迅速升溫以避免時(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)料變酸；100℃條件下滅菌12 h～14 h，當(dāng)溫度降至到60℃以下時(shí)再取出，確保培養(yǎng)料熟化更加徹底。整個(gè)滅菌過(guò)程中確保搬運(yùn)中輕拿輕放，避免菌袋破損造成污染[13]。

3） 接種培養(yǎng)

菌袋冷卻到30℃以下開(kāi)始接種，采用液體菌種接種法。接種前對(duì)接種室進(jìn)行徹底消毒殺菌處理，控制溫度低于30℃。首先將接種管和接種槍連接好，用10層的紗布包緊，高壓蒸汽滅菌，在0.12 Mpa條件下滅菌40 min[14]。菌種要求接到料袋的中口內(nèi)，這樣接的菌種能夠縮短養(yǎng)菌時(shí)間，每袋接種量都定量為15 mL。接種后菌袋要及時(shí)移入養(yǎng)菌室，養(yǎng)菌室內(nèi)要保持清潔干燥、保溫、通風(fēng)良好。發(fā)菌前要對(duì)養(yǎng)菌室進(jìn)行充分消毒再投入使用。將接種好的菌袋擺放到事先處理好的架子上，要注意輕拿輕放，擺放的層數(shù)不宜過(guò)高一般不要超過(guò)5層，用報(bào)紙蓋好。養(yǎng)菌期間要嚴(yán)格控制好養(yǎng)菌室溫度，堅(jiān)持做到低溫養(yǎng)菌，暗光培養(yǎng)。原則上應(yīng)做到“寧干勿濕”，溫度高時(shí)要用換氣扇來(lái)進(jìn)行通風(fēng)換氣[15]。一般情況下，液體菌種在25℃培養(yǎng)，6 h后菌種萌發(fā)，35 d左右可長(zhǎng)滿菌袋。養(yǎng)菌期間，如果發(fā)現(xiàn)菌袋內(nèi)有污染應(yīng)及時(shí)挑出進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)。菌袋內(nèi)溫度較高時(shí)，要及時(shí)把中間菌袋放到邊上，把上面菌袋放到下面，進(jìn)行倒垛降溫。

每個(gè)品種的菌株栽培袋數(shù)量為200袋，按露地全光照標(biāo)準(zhǔn)栽培模式進(jìn)行管理，定時(shí)扎眼、催芽，通過(guò)對(duì)菌絲長(zhǎng)勢(shì)、污染代數(shù)、滿袋時(shí)間、從耳芽到耳片分化的時(shí)間、子實(shí)體形狀、產(chǎn)量和生育期（從接種次日到第一次采收的天數(shù)）等數(shù)據(jù)進(jìn)行觀察和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲培養(yǎng)特性結(jié)果

黑木耳菌株在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況見(jiàn)表2。

表2 黑木耳菌株在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況Tab.2 The growth of Auricularia auricula strains on the cultivation medium

由表2可以看出，在固體平板培養(yǎng)基上M1、M2、M3、M8、M9、M12菌落長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲潔白、粗壯、濃密，且無(wú)色素分泌，菌絲長(zhǎng)速比其他菌株較快，都達(dá)到0.300 cm·d-1以上，其中M2菌絲長(zhǎng)速差異顯著，其他5個(gè)菌株菌絲長(zhǎng)速無(wú)明顯差異。黑木耳菌株在液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

由表3可看出，在液體培養(yǎng)基中各菌株菌絲體干重差異顯著，M1、M2、M3、M8、M9、M12菌絲體干重較大，都達(dá)到了2.00 mg·mL-1以上，同時(shí)這6個(gè)菌株的菌球較小，密度較大，且萌發(fā)時(shí)間早、培養(yǎng)時(shí)間較短，生長(zhǎng)速度較快。綜合固體培養(yǎng)結(jié)果，初步確定M1、M2、M3、M8、M9、M12為優(yōu)良品種。

表3 黑木耳菌株在液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況Tab.3 The mycelial growth of Auricularia auricula strains in the liquid cultivation medium

2.2 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

不同黑木耳菌株見(jiàn)到拮抗反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表4、圖1。

表4 不同黑木耳菌株間的拮抗反應(yīng)Tab.4 The antagonistic reaction among the different Auricularia auricula strains

由表4可以看出，供試的14個(gè)黑木耳菌株中，M1、M5、M7、M8、M9之間無(wú)拮抗反應(yīng)，M4與M11之間無(wú)拮抗，M12與M7、M9之間無(wú)拮抗，表明這幾個(gè)菌株間親緣關(guān)系較近，可能是同種異名。M2、M3、M6、M13、M14與其他菌株都沒(méi)出現(xiàn)拮抗反應(yīng)，說(shuō)明M2、M3、M6、M13、M14與其他9個(gè)品種之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)可能為獨(dú)自的品種。

2.3 同工酶試驗(yàn)結(jié)果

14個(gè)黑木耳菌絲體酯酶同工酶電泳（圖譜）和14個(gè)黑木耳菌絲體酯酶同工酶譜帶（Rf值）分別見(jiàn)圖2、表5。

由圖2可知，14個(gè)黑木耳菌株共檢測(cè)出酶帶數(shù)目達(dá)到14條，酶譜帶數(shù)多為3條～10條，其中多數(shù)的有4條。由表5可知，Rf（相對(duì)遷移率） 0.605為14個(gè)菌株所共有，可以認(rèn)為是黑木耳的基礎(chǔ)酶譜帶，這表明14個(gè)黑木耳品種間存在著一定的親緣關(guān)系。個(gè)別菌株存在各自特征的酶帶，如Rf=0.346，就是M3菌株的特征帶；Rf=0.292則為M14菌株的特征帶。M7和M9菌株的酶帶大體相同，只是寬窄、顏色略有不同，說(shuō)明它們的酶活力有所區(qū)別，但菌株間具有著相同的遺傳基礎(chǔ)。

表5 14黑木耳菌株酯酶同工酶的Rf值Tab.5 The Rf values of esterase isozymes about 14 tested Auricularia auricula strains

利用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件計(jì)算14個(gè)黑木耳菌株酶譜之間的聯(lián)合系數(shù)，并對(duì)所得的酶帶進(jìn)行聚類(lèi)系統(tǒng)分析，聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖見(jiàn)圖3。

由圖3可知，在相異水平70%左右時(shí)，可以把這14個(gè)菌株分成4類(lèi)：第一類(lèi)包括M1、M2、M5、M7、M8、M9、M12、M13這8個(gè)菌株；第二類(lèi)包括M4、M6、M10、M11這4個(gè)菌株；第三類(lèi)為M14菌株；第四類(lèi)為M3菌株，M14和M3這兩個(gè)菌株與其它菌株親緣關(guān)系遠(yuǎn)，自成一類(lèi)。M7、M9和M12菌株；M4和M11菌株幾乎沒(méi)有差異，可斷定為同種異名。聚類(lèi)分析結(jié)果與形態(tài)特征基本趨同。

2.3.1 栽培試驗(yàn)

1） 發(fā)菌期調(diào)查

發(fā)菌期菌絲生長(zhǎng)速度見(jiàn)圖4。

由圖4可以看出，M2、M3兩個(gè)菌株的菌絲生長(zhǎng)速度最快，滿袋時(shí)間最短，并且菌絲濃白，生長(zhǎng)旺盛，長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)；其他菌株生長(zhǎng)速度較慢，長(zhǎng)勢(shì)稍差。

2） 出耳期調(diào)查

發(fā)菌期性狀調(diào)查詳見(jiàn)表6。

由表6可看出， M2、M9、M12原基形成早，生育期短，屬于早熟品種，污染率低，抗性好，產(chǎn)量高，差異不顯著，都達(dá)到45 g/袋左右，耳片厚且干濕比較大，但是耳片呈菊花狀、多筋，商品性較差；M3、M8原基形成較早，生育期較短，屬于中早熟品種，污染率低，抗性好，產(chǎn)量較M2、M9、M12低些，但是耳片呈碗狀或耳狀，少筋或半筋，耳片厚且干濕比較大，顏色深黑，商品性好，所以選擇這兩個(gè)品種作為適合遼寧地區(qū)栽培的優(yōu)良品種。

表6 各黑木耳菌株農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量的比較Tab.6 Comparison of Auricularia auricula varieties strains in some of agronomic characters

3 討論與結(jié)論

3.1 菌株同種異名現(xiàn)象較為嚴(yán)重

鑒別不同菌株的傳統(tǒng)方法是利用拮抗試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，不同品種菌絲間的拮抗反應(yīng)是菌株之間不同遺傳特性的表現(xiàn)[16]。通過(guò)14個(gè)不同黑木耳菌株之間的拮抗試驗(yàn)，來(lái)證明各菌株間可能存在著同種異名的現(xiàn)象?？偨Y(jié)原因有以下幾點(diǎn)：一是可能同一品種在不同地區(qū)的命名不同，又相互進(jìn)行引種造成的；二是因?yàn)椴煌貐^(qū)的相同菌株，通過(guò)其生長(zhǎng)環(huán)境變化而造成生長(zhǎng)性狀上的差異；三是菌種監(jiān)管不規(guī)范，個(gè)別單位引種后經(jīng)過(guò)純種分離后隨意命名，導(dǎo)致同種異名現(xiàn)象十分嚴(yán)重。這種情況給菇農(nóng)選擇菌種和科研單位進(jìn)行育種研究工作帶來(lái)許多不便，影響食用菌菌種市場(chǎng)的正常秩序。

3.2 黑木耳菌株菌絲生長(zhǎng)特性和生物學(xué)效率存在明顯差異

通過(guò)拮抗試驗(yàn)證明不是同一品種的菌株，并不能確定就是優(yōu)良菌株，要進(jìn)一步進(jìn)行行菌絲生長(zhǎng)測(cè)定、栽培試驗(yàn)綜合評(píng)價(jià)后才能確定。從菌絲的培養(yǎng)特性，生物學(xué)效率兩個(gè)方面來(lái)觀察測(cè)定。如果出現(xiàn)差異，也有可能是由于同一品種菌株的來(lái)源不明或者是轉(zhuǎn)代次數(shù)過(guò)多而導(dǎo)致的。

從菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)觀察分析，兩者并不一定是嚴(yán)格對(duì)應(yīng)的。同工酶就是利用具有相同或者相似的某種催化功能，但酶分子的結(jié)構(gòu)有所不相同的一組酶。同工酶酶譜主要是指有編碼的各條酶帶基因直接決定的，其所表達(dá)出來(lái)的是分子水平的信息[17]。同工酶分析作為一種分子遺傳標(biāo)記的技術(shù)手段，目前已經(jīng)逐漸成為真菌這一領(lǐng)域常用且重要的研究工具，特別是在屬內(nèi)菌種之間并且在品種間的分類(lèi)鑒定中起到了十分有效的作用。

食用菌同一品種的菌絲體酯酶同工酶帶的位置、寬窄、數(shù)目都是完全相同的。可能酶帶的顏色深淺略有不同；而不同品種之間的酯酶同工酶圖譜是不同的[18]。本研究中的14個(gè)黑木耳菌株的酯酶同工酶酶譜有著相同點(diǎn)的，即為基礎(chǔ)酶譜帶；又各自具有自身獨(dú)特的酶帶特征，即為特征酶譜帶，可反映出不同菌株間的相互聯(lián)系和差異。同工酶帶越多品系越進(jìn)化的觀點(diǎn)，多一條酶帶，就多一個(gè)特性或是成分中就多一種適應(yīng)能力，所以特征酶帶是一種進(jìn)化的表現(xiàn)，這為黑木耳品種優(yōu)劣的鑒定提供了重要依據(jù)[19-21]。

酯酶作為一個(gè)生化指標(biāo)，能夠反映出供試的菌株在遺傳特性上的某種、某些差異。但要是培養(yǎng)條件各不相同，也同樣會(huì)導(dǎo)致酯酶同工酶的差異性明顯。因此在利用酯酶同工酶電泳技術(shù)對(duì)食用菌食品種進(jìn)行分類(lèi)或是鑒定時(shí)，試驗(yàn)的菌種必須是在環(huán)境條件相同的條件下培養(yǎng)得到的。

通過(guò)拮抗試驗(yàn)、菌絲培養(yǎng)特性觀察和同工酶試驗(yàn)3種不同的試驗(yàn)方法，結(jié)合14個(gè)黑木耳菌株全光照露地栽培模式下從發(fā)菌期、出耳期及其產(chǎn)量的各種指標(biāo)中篩選出綜合性狀良好、商品質(zhì)量佳的菌株M3（黑3） 和M8（黑狀元），比較適合遼寧本地區(qū)進(jìn)一步栽培推廣應(yīng)用。在14個(gè)品種中，M4和M11雖然生育期長(zhǎng)，產(chǎn)量不高，但是具有良好的商品性狀，可作為商品性狀好的育種材料，為下一步優(yōu)良種質(zhì)保護(hù)和遺傳育種工作提供參考依據(jù)。