于興軍，許明光，李東興，吳 杰

（1.北華大學(xué) 林學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林省樺甸市樺樹林場(chǎng)，吉林 吉林 132414；3.北京首誠(chéng)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，北京 102402；4.北京航天農(nóng)業(yè)生物科技有限公司，北京102447）

冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis） 隸屬于線中草科（Ophiocordicipitaceae）為冬蟲夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，始載于《本草從新》，謂其能保肺，益腎止血，化痰止勞嗽[2]?，F(xiàn)代藥理和臨床研究結(jié)果表明，冬蟲夏草具有強(qiáng)心、降血脂、降低膽固醇、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤等多種藥理活性，對(duì)高血壓、冠心病、慢性肝炎、慢性腎炎、支氣管炎以及食道癌、肝癌、自身免疫性疾病等均有較好療效[3]。野生冬蟲夏草因其獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境和近年來(lái)的過量采集，使得其產(chǎn)量降低、價(jià)格昂貴。據(jù)報(bào)道，蛹蟲草（Cordyceps militaris） 與冬蟲夏草的化學(xué)成分與藥理作用相似[4-5]，因而人工培育蛹蟲草在近年來(lái)被廣泛研究。目前人工培養(yǎng)的蛹蟲草主要有柞蠶蛹蟲草和蛹蟲草子實(shí)體2種類型。柞蠶蛹蟲草是人工將蛹蟲草菌接種到活的柞蠶蛹上培養(yǎng)而成，是蛹蟲草子座與菌核兩部分組成的復(fù)合體[6]；蛹蟲草子實(shí)體是將蛹蟲草菌接種到代料培養(yǎng)基上而培養(yǎng)出的真菌子實(shí)體[7]。

據(jù)報(bào)道，蟲草中的主要活性成分為核苷類物質(zhì)[8]，包括蟲草素（3’-脫氧腺苷）、腺苷、尿苷、鳥苷、胸苷等，具有廣泛的生理活性，是蟲草品質(zhì)的主要參考指標(biāo)[9-10]。但目前有關(guān)冬蟲夏草及人工蟲草品質(zhì)控制和監(jiān)管的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方法尚未建立，市場(chǎng)上的各類蟲草及其制品的品質(zhì)參差不齊，甚至有不良廠家在各類蟲草制品中以次充好、以假亂真。因此，通過對(duì)冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實(shí)體利用高效液相色譜對(duì)比分析其活性成分差異，結(jié)合判別分析法建立區(qū)分冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實(shí)體的方法，為蟲草的品質(zhì)控制及蟲草資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。文獻(xiàn)檢索顯示檢測(cè)蟲草中主要核苷類活性物質(zhì)的方法以高效液相色譜法最為普遍[11]，但未見有用該方法對(duì)比分析3種蟲草的蟲草素、腺苷、尿苷、鳥苷、胸苷的報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

12個(gè)柞蠶蛹蟲草樣品分別來(lái)自于10個(gè)蛹蟲草生產(chǎn)廠家，其中吉林2個(gè)（YC1～YC2）、遼寧3個(gè)（YC3～YC5）、山東 1個(gè) （YC6）、上海 1個(gè) （YC7）、杭州1個(gè)（YC8），北京2個(gè)廠家各提供2個(gè)批次共4個(gè)樣品 （YC9～YC12）。

8個(gè)蛹蟲草子實(shí)體樣品分別來(lái)自于8個(gè)蛹蟲草子實(shí)體生產(chǎn)廠家，其中遼寧2個(gè)（ZST1～ZST2）、內(nèi)蒙 2個(gè) （ZST3～ZST4）、河北 2個(gè) （ZST5～ZST6）、山東1個(gè)（ZST7）、廣東1個(gè)（ZST8）。

4個(gè)冬蟲夏草樣品來(lái)自于青海省玉樹市稱多縣和西藏的巴青縣、索縣的農(nóng)戶（DCXC1～DCXC4）。

1.1.2 試劑

蟲草素，純度≥99.0%，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；腺苷、胸苷、鳥苷、尿苷，純度≥99.0%，購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲醇，色譜純，購(gòu)自北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mliil-Q型超純水儀，美國(guó)MILLI-PORE公司；KQ-500DE超聲波清洗機(jī)，昆山市超聲儀器有限公司；TDL-5-A高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；高效液相色譜儀，配DAD檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

分別將經(jīng)過預(yù)冷凍的蟲草樣品放入冷凍干燥機(jī)內(nèi)處理12 h，取出后粉碎并過60目篩，然后精確稱取過篩后的樣品0.50 g，置于50 mL離心管中，加入20%甲醇25 mL，于30℃、80 kHz條件下超聲提取30 min，提取結(jié)束后將離心管置于20℃、5 000 r·min-1的離心機(jī)中離心10 min，吸取上清液2 mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后得到樣品溶液，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別準(zhǔn)確稱取蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷標(biāo)準(zhǔn)品各0.010 0 g，置于10 mL容量瓶中，用20%甲醇溶解后定容，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。吸取適量上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別用20%甲醇準(zhǔn)確稀釋成 2.00 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1、75.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液[12]。

1.3.3 色譜分析條件

色譜柱 （Agilent C18，250.0 mm × 4.6 mm，5.0 μm）；流速 1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng) 260 nm；進(jìn)樣體積20 μL；柱溫30℃。流動(dòng)相A為超純水，流動(dòng)相B為甲醇。梯度洗脫順序：0（5%B） →5 min（5%B） →15 min （20%B） →25 min （35%B） →30 min（35%B）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

定性分析：將蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷的混合標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行HPLC分析。通過將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜保留時(shí)間的比對(duì)，確定蟲草樣品中的主要活性成分。并選取3類蟲草HPLC圖譜的共有峰作為蟲草的特征指紋峰。

定量分析：依據(jù)外標(biāo)法計(jì)算3種蟲草中蟲草素、腺苷、胸苷、鳥苷和尿苷的含量。SPSS軟件DA判別分析計(jì)算，首先選取21個(gè)樣品（3個(gè)冬蟲夏草、11個(gè)柞蠶蛹蟲草和7個(gè)蛹蟲草子實(shí)體） 的13個(gè)共有特征指紋峰數(shù)據(jù)作為判別分析樣本集建立判別模型，然后依據(jù)該模型對(duì)隨機(jī)3個(gè)預(yù)留樣品（1個(gè)冬蟲夏草、1個(gè)柞蠶蛹蟲草和1個(gè)蛹蟲草子實(shí)體）進(jìn)行DA預(yù)測(cè)判斷試驗(yàn)，以驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性。混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相及梯度洗脫程序的優(yōu)化

冬蟲夏草及柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實(shí)體所含化學(xué)成分復(fù)雜，且各種類型的化合物的極性差別較大[13]。進(jìn)行等梯度甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)，以及不同梯度的甲醇-水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)洗脫，結(jié)果表明選擇水（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相，洗脫程序?yàn)?（5%B） → 5 min （5%B） → 15 min （20%B） → 25 min（35%B） →30 min（35%B） 時(shí)，在30 min可以使色譜峰全部洗出，且分離較好，故選擇該流動(dòng)相系統(tǒng)及洗脫方式作為色譜條件。

2.2 蟲草樣品的活性成分

冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實(shí)體中主要活性成分含量見表1。

表1 3種蟲草中主要活性成分含量Tab.1 Contents of main active components in three kinds of Cordyceps spp.

表1結(jié)果表明，柞蠶蛹蟲草中核苷類含量蟲草素＞腺苷＞鳥苷＞胸苷，尿苷含量低于其檢測(cè)限值；蛹蟲草子實(shí)體中核苷類含量蟲草素＞腺苷＞胸苷，尿苷和鳥苷含量均低于其檢測(cè)限值；冬蟲夏草只含有一定量的尿苷、鳥苷和腺苷，不含蟲草素?？梢钥闯?，柞蠶蛹蟲草中的核苷類成分組成及總含量均優(yōu)于冬蟲夏草和蛹蟲草子實(shí)體，并且其中腺苷和蟲草素是3種蟲草中含量較高的核苷類成分，而無(wú)論是按腺苷還是按蟲草素含量排序，順序均為柞蠶蛹蟲草＞蛹蟲草子實(shí)體＞冬蟲夏草。

2.3 蟲草指紋圖譜分析

選取各個(gè)蟲草樣品HPLC圖譜中的13個(gè)共有峰作為3種蟲草的特征指紋峰，詳見表2。

隨機(jī)選取 3個(gè)預(yù)留樣品 （DCXC1、YC5和ZST7），其余21個(gè)樣品作為DA分析樣本庫(kù)，進(jìn)行DA典型判別分析計(jì)算，得到3種蟲草的DA判別分析模型，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，不同類別的蟲草所含的活性物質(zhì)構(gòu)成和含量有所差異，因此根據(jù)這種差異，可以將相同類別的蟲草樣品顯著地聚在一起，而將不同類別的蟲草區(qū)分開。此外，冬蟲夏草與其他兩類蟲草區(qū)分明顯，這可能是因?yàn)槎x夏草的活性成分構(gòu)成及含量與柞蠶蛹蟲草、蛹蟲草子實(shí)體均有較大差異。

2.4 模型驗(yàn)證

用2.3建立的判別模型對(duì)預(yù)留的隨機(jī)選取的3個(gè)蟲草樣品（冬蟲夏草DCXC1、柞蠶蛹蟲草YC5和蛹蟲草子實(shí)體ZST7）進(jìn)行DA預(yù)測(cè)判斷，結(jié)果見圖3，其交叉驗(yàn)證結(jié)果見表3。

表2 3種蟲草24個(gè)樣品的特征峰值Tab.2 Characteristic peaks of 24 samples in three kinds of Cordyceps spp.

由圖3可以看出，預(yù)留的隨機(jī)選取的3個(gè)蟲草樣品判別分析結(jié)果分別都落在對(duì)應(yīng)的本類別的判定區(qū)域中。從表3交叉驗(yàn)證結(jié)果可以看出，該DA判別分析模型具有良好的分類性能和較高的預(yù)測(cè)精度，說(shuō)明該方法可以有效的進(jìn)行這三種蟲草的預(yù)測(cè)判別。

3 結(jié)論

通過高效液相色譜法分析冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草以及蛹蟲草子實(shí)體中的主要核苷類活性成分和13個(gè)共有特征峰，并依據(jù)特征峰值，利用SPSS軟件對(duì)其進(jìn)行DA判別分析。結(jié)果表明，該方法能有效地將這三類蟲草區(qū)分在不同區(qū)域，形成各自的聚集區(qū)，區(qū)分效果良好，并且對(duì)于預(yù)留的隨機(jī)抽取的冬蟲夏草、柞蠶蛹蟲草和蛹蟲草子實(shí)體樣品的預(yù)測(cè)判別準(zhǔn)確性較高，該方法可以作為3種蟲草及其制品的鑒別和質(zhì)量監(jiān)測(cè)的有效方法。

表3 3個(gè)蟲草樣品判別結(jié)果Tab.3 Discriminating results of three Cordyceps spp.samples