陸正清 王海平 歐盛生 張迪雅

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223005）

0 引言

果蔬農(nóng)藥殘留檢測方法有色譜法、光譜法、和快速檢測法。色譜法和光譜法能夠既定性又定量地對(duì)樣品中農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測，但所用設(shè)備昂貴，檢測時(shí)間長，經(jīng)常存在檢測結(jié)果未出，果蔬可能早已銷售甚至已被食用，即便再檢測出農(nóng)藥殘留超標(biāo)也無濟(jì)于事。因此，根據(jù)我國果蔬生產(chǎn)和銷售的特點(diǎn)，推廣一種在田間便可進(jìn)行快速的、準(zhǔn)確的檢測方法，對(duì)防止農(nóng)殘超標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)入交易市場具有重大意義。

酶抑制率法檢測農(nóng)殘具有快速、簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此，此方法已被列入國家標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)中所用酶試劑主要為膽堿酯酶，其來源主要為動(dòng)物及昆蟲體內(nèi)提取，提取步驟煩瑣，成本較高。有研究表明，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥也可抑制植物酯酶的活性，因此，也可作為快檢酶試劑。本試驗(yàn)采用從價(jià)格低廉的小麥中提取小麥酯酶，進(jìn)行農(nóng)殘快檢的檢測條件研究，以期得到一種能代替膽堿酯酶的農(nóng)殘快檢的酶試劑。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

小麥和青菜均為淮安市場購買。乙酰膽堿脂酶、固蘭B鹽、無水乙醇、а-乙酸萘酯、硫代乙酰膽堿、氨基甲酸類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，甲基對(duì)硫磷、樂果、敵敵畏等均為分析純。

1.2 主要儀器

農(nóng)藥殘留快檢儀（廈門斯坦道科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 酶抑制率法測農(nóng)殘

膽堿酯酶抑制率法根據(jù)GB/T5009.199-2003。小麥脂酶抑制率法測定方法如下：取1.0 ml小麥酯酶提取液于試管中，加入4.0 ml樣品測定液、0.1 mL顯色劑和4.0 mL pH為6.5的緩沖液，于30℃反應(yīng)15 min，然后加入底物а-乙酸萘酯0.5 mL，立即放入比色池，記錄吸光度變化值。

1.3.2 小麥酯酶的提取

經(jīng)過加工的小麥粉，加入5倍量的蒸餾水，以9000r/min的轉(zhuǎn)速冷凍離心5 min，取上清液備用。

1.3.3 重復(fù)性、通道一致性、穩(wěn)定性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)：以市售青菜為檢測對(duì)象，小麥酯酶為酶制劑，連續(xù)檢測10次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），檢測儀RSD應(yīng)小于等于1.0%。

通道一致性試驗(yàn)：以質(zhì)量濃度為1.0 mg/L的甲基對(duì)硫磷為標(biāo)準(zhǔn)溶液，連續(xù)試驗(yàn)3次，計(jì)算每個(gè)通道的抑制率，計(jì)算各通道平均值及全部通道最大值與最小值的差值。儀器參考值在10%范圍內(nèi)。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：以蒸餾水做對(duì)照，檢測液為試驗(yàn)對(duì)象，20 min內(nèi)，每隔5 min測量蒸餾水和檢測液的吸光度，取每通道變化量的最大值，以蒸餾水吸光度變化值在0.005范圍內(nèi)為宜。

1.3.4 乙酰膽堿酯酶和小麥酯酶對(duì)農(nóng)藥的抑制率測定試驗(yàn)

利用乙酰膽堿酯酶和小麥酯酶為酶試劑，在各自最適合酶活條件下，用農(nóng)殘快速檢測儀測定2種酶試劑對(duì)質(zhì)量濃度分別為0.2 mg/L樂果、0.2 mg/L敵敵畏、1.0 mg/L的甲基對(duì)硫磷、0.02 mg/L滅多威、0.04 mg/L克百威的抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥酯酶最適反應(yīng)pH的確定

考察pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5條件下，小麥脂酶水解а-乙酸萘酯的能力，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，pH與酶活力關(guān)系如圖1所示。

圖1 pH對(duì)小麥酯酶活性的影響

由圖1可知，小麥酯酶反應(yīng)的最適pH在6.5左右，當(dāng)pH低于5.5或高于7.5時(shí)，酶活力明顯降低，因此，使用酶抑制率法測定農(nóng)殘時(shí)，若采用小麥脂酶為酶制劑，應(yīng)配制緩沖液的pH為6.5。

2.2 小麥酯酶最適反應(yīng)溫度的確定

考察反應(yīng)溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃條件下，小麥脂酶水解а-乙酸萘酯的能力，以最高酶活力為100%計(jì)算相對(duì)酶活力，反應(yīng)溫度與酶活力關(guān)系如圖2所示。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)小麥酯酶活性的影響

由圖2可知，小麥酯酶反應(yīng)的最適溫度在30℃左右，當(dāng)溫度低于20℃或高于40℃時(shí)，酶活力明顯降低，因此，使用酶抑制率法測定農(nóng)殘時(shí)，若采用小麥酯酶為酶制劑，反應(yīng)溫度應(yīng)設(shè)置為30℃。

2.3 重復(fù)性、一致性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

在最適pH和最適反應(yīng)溫度條件下，以小麥酯酶為酶試劑，采用酶抑制率法測定農(nóng)殘時(shí)，測試結(jié)果如表1所示。

表1 農(nóng)殘快檢儀測試結(jié)果

由表1數(shù)據(jù)顯示，農(nóng)殘快檢儀測定10次青菜樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.16%，遠(yuǎn)低于儀器規(guī)定的參考值1.0%，說明以小麥酯酶為酶試劑時(shí)，快檢儀的重復(fù)性好。利用快檢儀對(duì)甲基對(duì)硫磷的各通道測定抑制率，結(jié)果顯示通道差為4.9%，在儀器要求的10%范圍內(nèi)，說明以小麥酯酶為酶試劑時(shí)對(duì)各通道的檢測結(jié)果無影響。20 min內(nèi)每隔5 min的吸光度變化最大值為0.002，在0.005范圍內(nèi)，說明以小麥酯酶為酶試劑時(shí)，快檢儀的穩(wěn)定性較好。

2.4 不同酶試劑對(duì)農(nóng)藥的抑制率的影響

由表2可知，以小麥酯酶為快速檢測農(nóng)殘的酶試劑時(shí)，在小麥酯酶的最適酶活條件時(shí)，其對(duì)農(nóng)藥殘留的抑制效果等同甚至優(yōu)于乙酰膽堿脂酶對(duì)農(nóng)藥的抑制效果，說明小麥酯酶可以作為農(nóng)殘快速測定時(shí)乙酰膽堿脂酶的替代物。

表2 乙酰膽堿酯酶和小麥酯酶對(duì)農(nóng)藥的抑制率結(jié)果

3 結(jié)語

采用酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留時(shí)，以小麥酯酶替代乙酰膽堿酯酶時(shí)，小麥酯酶活性最適條件為pH=6.5，溫度30℃，最適酶活條件下，小麥酯酶酶抑制率法測定的重復(fù)性、通道一致性和穩(wěn)定性都較好，并且抑制率測定結(jié)果與膽堿脂酶法的結(jié)果差異不大，說明小麥酯酶可以代替乙酰膽堿脂酶對(duì)果蔬中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行測定。