雷 聲 王 凱 段焰青 - 李源棟 - 劉秀明U -于莙禾 - 崔和平 - 張曉鳴 - 楊乾栩 -

(1. 云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650231；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

目前，熱反應(yīng)香精大多為完全美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(Maillard reaction products, MRPs)，其香氣濃郁誘人，具有較大的吸引力。而MRPs風(fēng)味主體為揮發(fā)性芳香物質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、香味不持久，且易受貯存環(huán)境的影響，造成香料的香型失真。美拉德反應(yīng)中間體形成于美拉德反應(yīng)的初級階段，即醛糖或酮糖重排產(chǎn)生的阿瑪多利重排產(chǎn)物(ARPs)1-氨基-1-脫氧-2-酮糖或海因斯重排產(chǎn)物(HRPs)2-氨基-2-脫氧醛糖[1]。ARPs或HRPs是美拉德反應(yīng)中關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，其本身無色無味，且在常溫下具有相對穩(wěn)定的物理、化學(xué)性質(zhì)[2]。因此這類中間產(chǎn)物可作為穩(wěn)定的風(fēng)味前體物質(zhì)，將其應(yīng)用于未加工或粗加工產(chǎn)品中，在后續(xù)熱處理過程中快速產(chǎn)生新鮮的風(fēng)味[3]。氨基酸和還原糖為反應(yīng)物制備的美拉德反應(yīng)中間體，經(jīng)熱處理后產(chǎn)品整體呈味單一、香韻不夠飽滿柔和。例如，2-脫氧-2-L-苯丙氨酸-D-葡萄糖只被用作花香味前體物[4]；1-脫氧-D-木酮糖基-1-L-半胱氨酸在熱處理時只產(chǎn)生肉類風(fēng)味[5]。若使用含有不同氨基酸殘基的肽和還原糖制備美拉德反應(yīng)中間體，熱反應(yīng)后增香效果相對于氨基酸具有顯著的不同。肽的不同氨基酸組成不僅可以改善食品風(fēng)味特性，豐富香氣類型，還可以提高食物的營養(yǎng)價值，為開發(fā)美拉德反應(yīng)中間體型風(fēng)味增強劑的優(yōu)質(zhì)原料，因此肽美拉德中間體具有良好的市場發(fā)展前景[6-7]。

美拉德中間體的制備通常采用有機相制備法，該法無法獲得食品級產(chǎn)品，中間體產(chǎn)率低且污染環(huán)境，還無法大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)[8]。此外，蛋白水解產(chǎn)物中游離氨基酸種類和肽的分子量分布不同，形成的ARPs或HRPs種類復(fù)雜，難以定性定量分析，因而無法通過對中間體含量的監(jiān)測實現(xiàn)其水相臨界條件的確定。試驗擬利用蛋白酶酶解技術(shù)實現(xiàn)小麥面筋蛋白肽的定向制備，并采用偏最小二乘回歸分析法(PLSR)對其酶解條件進行優(yōu)化?；诎腚装彼嶙饔糜陔拿览轮虚g體，抑制美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物褐變強度的機制[9-10]，采用變溫美拉德反應(yīng)方法，以半胱氨酸為示蹤劑，通過測定肽美拉德終產(chǎn)物的褐變指數(shù)，研究并優(yōu)化小麥面筋蛋白肽美拉德中間體在水相介質(zhì)中的制備條件。旨在為肽美拉德反應(yīng)中間體的工業(yè)化綠色生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

D-木糖、谷胱甘肽、半胱氨酸、乙氨酸、酪氨酸、精氨酸、甘氨酸、桿菌酶、細胞色素：上海源葉生物科技有限公司；

鹽酸、氫氧化鈉、醋酸鈉、甲醛、三氯乙酸、乙腈：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

小麥面筋蛋白、復(fù)合蛋白酶Ⅰ、復(fù)合蛋白酶Ⅱ、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、氨肽酶、味精、焦糖、檸檬酸、咖啡因：安徽強旺調(diào)味食品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：EL3002型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

pH計：FE-20型，梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；

紫外—可見分光光度計：UV-1800型，島津(中國)有限公司；

高效液相色譜：Waters 1525型，沃特世科技(上海)有限公司；

超級恒溫循環(huán)水?。篗P-501A型，上海一恒科技有限公司；

離心機：Allegra 64R型，貝克曼庫爾特有限公司；

手持式折光儀：PAL-1型，ATAGO(愛拓)中國分公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 小麥面筋蛋白肽的制備 取適量過80目篩的小麥蛋白粉，按料液質(zhì)量比1∶12添加去離子水并混合均勻，90 ℃加熱30 min以滅活樣品內(nèi)源酶，冷卻，酶添加量3 000 U/g底物，最適pH及溫度下酶解2.5 h，反應(yīng)結(jié)束后立即在沸水浴中攪拌加熱15 min，冷卻，4 300 r/min離心10 min，上清液即為小麥蛋白肽，于-20 ℃儲存待測。

1.3.2 酶解參數(shù)的確定

(1) 復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量：料液質(zhì)量比1∶10，復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量分別為1 000，1 500，2 000，2 500，3 000 U/g底物酶解3 h，然后按氨肽酶添加量320 U/g底物酶解2 h，考察復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量對酶解產(chǎn)物水解度及蛋白溶出率的影響。

(2) 復(fù)合蛋白酶Ⅰ酶解時間：料液質(zhì)量比1∶10，復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量2 000 U/g底物分別酶解1，2，3，4，5 h，然后按氨肽酶添加量320 U/g底物酶解2 h，考察復(fù)合蛋白酶Ⅰ酶解時間對酶解產(chǎn)物水解度及蛋白溶出率的影響。

(3) 氨肽酶添加量：料液質(zhì)量比1∶10，復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量2 000 U/g底物酶解3 h，然后按氨肽酶添加量分別為160，240，320，400，480 U/g底物酶解2 h，考察氨肽酶添加量對酶解產(chǎn)物水解度及蛋白溶出率的影響。

(4) 氨肽酶酶解時間：料液質(zhì)量比1∶10，復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量2 000 U/g底物酶解3 h，然后按氨肽酶添加量400 U/g底物分別酶解1，2，3，4，5 h，考察氨肽酶酶解時間對酶解產(chǎn)物水解度及蛋白溶出率的影響。

(5) 料液質(zhì)量比：料液質(zhì)量比分別為1∶8，1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量2 000 U/g底物酶解3 h，然后按氨肽酶添加量400 U/g底物酶解2 h，考察料液質(zhì)量比對酶解產(chǎn)物水解度及蛋白溶出率的影響。

1.3.3 水解度的測定 采用甲醛滴定法[11]，按式(1)計算水解度。

(1)

式中：

DH——水解度，%；

C——氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；

V1——樣品溶液在加入甲醛后滴定至終點所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

V2——空白溶液在加入甲醛后滴定至終點所消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

V——酶解上清液的體積，mL；

m——樣品質(zhì)量，g；

ω——原料中的蛋白質(zhì)含量，%；

8.38——每克蛋白質(zhì)所含的肽鍵毫摩爾數(shù)，mmol/g。

1.3.4 蛋白溶出率的測定 按GB/T 5009.5—2010執(zhí)行。

1.3.5 感官評定 感官評定小組由15名經(jīng)驗豐富且經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官評定成員組成(23～54歲，8女7男)。感官評定過程中樣品以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%加入到標(biāo)準(zhǔn)參照液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的鹽溶液)中，60 ℃水浴10 min，以谷物烘烤味、焦香味、醇厚味、鮮味、酸味、苦味和整體接受性為評定指標(biāo)進行評分(0～8分)，分值越高說明作用效果越強。標(biāo)準(zhǔn)參照液：焦香味(2.5 g焦糖溶于80 mL去離子水)、醇厚味(30 mmol/L谷胱甘肽溶液)、鮮味(0.5%味精溶液)、酸味(5 mmol/L檸檬酸溶液)、苦味(4 mmol/L咖啡因溶液)。

1.3.6 氨基酸的測定

(1) 游離氨基酸前處理：取液體樣品5 mL，用等量10 g/100 mL三氯乙酸稀釋后充分混勻，室溫下靜置1 h，過濾，取1 mL濾液，10 000 r/min離心10 min，取400 μL上清液于液相進樣瓶中進樣檢測。

(2) 總氨基酸前處理：取液體樣品1 mL，加入1 mL濃鹽酸，再加入6 mL 6 mol/L HCl溶液。充入氮氣3 min后封管，于120 ℃烘箱中水解22 h。冷卻后加入4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和鹽酸，定容，過濾，取1 mL濾液，10 000 r/min離心10 min，取400 μL上清液于液相進樣瓶中進樣檢測。

(3) 色譜條件：色譜柱ODS Hypersil(250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫40 ℃，流速1.0 mL/min，流動相A相為0.6 mmol/L的乙酸鈉，B相為0.15 mmol/L的醋酸鈉∶甲醇∶乙腈= 1∶2∶2(體積比)。

1.3.7 相對分子質(zhì)量分布測定 色譜柱TSKgel2000SWXL(300 mm×7.8 mm)；柱溫30 ℃，進樣體積10 μL，流速0.5 mL/min，流動相乙腈/水/三氟乙酸(40/60/0.1，體積比)；檢測器紫外檢測器，檢測波長220 nm。校正曲線標(biāo)準(zhǔn)品：乙氨酸—乙氨酸—乙氨酸(MW189)，乙氨酸—乙氨酸—酪氨酸—精氨酸(MW451)，桿菌酶(MW1422)，細胞色素(MW12384)。

1.3.8 小麥面筋蛋白肽美拉德中間體水相的制備 取適量小麥面筋蛋白肽，按一定的比例添加木糖，混合均勻，用6 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)初始pH。低溫階段：將溶液分裝在耐壓反應(yīng)瓶中，低溫下反應(yīng)一定時間，取出冷卻；高溫階段：添加1%半胱氨酸，并重新調(diào)節(jié)pH，將油浴溫度迅速升高至120℃，加熱100 min，立即將反應(yīng)液置于冰水中終止反應(yīng)，所得反應(yīng)液用于褐變指數(shù)測定。

1.3.9 褐變指數(shù)的測定 采用紫外—可見分光光度計測定A420 nm。

1.3.10 小麥面筋蛋白肽美拉德中間體水相制備條件優(yōu)化

(1) 反應(yīng)溫度：按糖肽比15%稱取適量小麥面筋蛋白肽和木糖，調(diào)節(jié)pH為7.5，低溫反應(yīng)溫度為70，80，90 ℃下反應(yīng)0～140 min，考察反應(yīng)溫度及時間對褐變指數(shù)的影響。

(2) 糖肽比：分別按糖肽比10%，15%，20%稱取適量小麥面筋蛋白肽和木糖，調(diào)節(jié)pH為7.5，最佳反應(yīng)溫度下反應(yīng)0～140 min，考察糖肽比對褐變指數(shù)的影響。

(3) pH：按最佳糖肽比稱取適量小麥面筋蛋白肽和木糖，調(diào)節(jié)pH分別為6.5，7.5，8.5，最佳反應(yīng)溫度下反應(yīng)0～140 min，考察pH對褐變指數(shù)的影響。

1.3.11 數(shù)據(jù)分析 采用Uncrambler 9.7軟件對小麥面筋蛋白的酶解指標(biāo)進行PLSR分析從而確定最佳的酶解參數(shù)。以酶解時間、酶添加量和料液質(zhì)量比等為X變量，水解度和蛋白回收率為Y變量，所有X變量在PLSR分析前需進行標(biāo)準(zhǔn)化(1/Sdev)。不確定性檢驗的回歸系數(shù)采用修正的Jack-Knife法進行估計，顯著性水平在P<0.05。所有回歸模型均使用完全交叉驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥面筋蛋白的酶解條件優(yōu)化

2.1.1 內(nèi)切蛋白酶的篩選 由表1、圖1可知，復(fù)合蛋白酶Ⅰ對小麥面筋中蛋白質(zhì)的酶解能力最強，其水解度為13.96%；其次為復(fù)合蛋白酶Ⅱ，其水解度為10.32%，而木瓜蛋白酶的酶解能力最弱。不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的整體接受性差異較大，復(fù)合蛋白酶Ⅰ的酶解產(chǎn)物的谷物烘烤味、焦香味和甜味較為柔和，香氣豐富；木瓜蛋白酶的酶解產(chǎn)物焦香味明顯，但酸味較為突出；而復(fù)合蛋白酶Ⅱ的酶解產(chǎn)物存在明顯的不愉悅氣味且苦味較重，整體接受性評分最低。綜上，選取復(fù)合蛋白酶Ⅰ作為內(nèi)切酶對小麥面筋進行酶解。

表1 蛋白酶的酶活力Table 1 Enzyme activity of several different proteases U/g

圖1 不同內(nèi)切蛋白酶對酶解液水解度及整體接受性的影響

Figure 1 Effect of different proteases on DH and sensory overall acceptance of WGP after Maillard reaction

2.1.2 酶解參數(shù)對小麥面筋蛋白水解度和蛋白溶出率的影響 由圖2可知，隨著復(fù)合蛋白酶Ⅰ添加量的增加，酶解產(chǎn)物水解度和蛋白溶出率均增大。當(dāng)酶添加量從1 000 U/g底物增加至2 000 U/g底物時，水解度呈線性增加，而繼續(xù)增加酶用量，酶解液水解度上升幅度不大。而蛋白溶出率增幅較為明顯的酶添加量為1 500～2 000 U/g底物。隨著酶解時間的延長，酶解液的水解度和蛋白溶出率均增大，當(dāng)酶解時間為2～3 h時，蛋白溶出率變化較大，由68.8%增加至70.95%，可能是酶解初期復(fù)合蛋白酶Ⅰ的活性較高，且與底物結(jié)合充分，作用效率高。當(dāng)酶解時間>3 h時，水解度和蛋白溶出率變化不大，可能由于此時酶不斷被消耗，活性降低，與酶作用的肽鍵逐漸減少。隨著氨肽酶添加量的增加，酶解液的水解度和蛋白溶出率增大。當(dāng)氨肽酶添加量由320 U/g底物增加至400 U/g底物時，蛋白溶出率由68.63%增加71.91%，而后則增加較為緩慢。隨著氨肽酶作用時間的延長，水解度增大。當(dāng)氨肽酶作用時間為1～2 h時，蛋白溶出率變化較明顯，由67.66%增大至71.07%，提高了5.04%，之后趨于緩和。這可能是酶解初期，在較高的酶和底物濃度下，酶解速率較快。隨著酶解時間的延長，酶解液pH不斷降低，底物濃度降低，從而導(dǎo)致后期酶解速率下降。隨著料液比的增大，水解度和蛋白溶出率均增大。當(dāng)料液質(zhì)量比為1∶8～1∶10時，水解度上升幅度最明顯，而蛋白溶出率在料液質(zhì)量比為1∶8～1∶14間增加效果顯著，而后趨于穩(wěn)定。以復(fù)合蛋白酶I添加量、復(fù)合蛋白酶I酶解時間、氨肽酶添加量、氨肽酶酶解時間及料液質(zhì)量比為X變量，水解度和蛋白回收率為Y變量進行PLSR分析。由圖3可知，5個主成分的交叉驗證方差為84%，PC1-PC3、PC1-PC4、PC1-PC5只提高了對X變量的解釋率，而PC1-PC2對Y變量的解釋率最大，因此只討論PC1-PC2。

由圖3(a)可知，蛋白溶出率和水解度都位于右側(cè)，氨肽酶添加量和氨肽酶酶解時間與其距離較近，說明這兩個參數(shù)同時與水解度和蛋白溶出率相關(guān)。此外，水解度和蛋白溶出率都位于內(nèi)外橢圓之間，表明其能很好地被該模型所解釋。

由圖4可知，氨肽酶添加量和氨肽酶酶解時間與小麥面筋蛋白的水解度和蛋白溶出率顯著正相關(guān)；復(fù)合蛋白酶I酶解時間與小麥面筋蛋白的蛋白溶出率顯著正相關(guān)；料液質(zhì)量比與小麥面筋蛋白的水解度和蛋白溶出率顯著負(fù)相關(guān)，可能是料液質(zhì)量比低即底物濃度低，小麥面筋蛋白更容易分散，與酶接觸更為充分，從而使水解度和蛋白溶出率增大，但由于底物濃度低，需進行濃縮才能進行后續(xù)的美拉德反應(yīng)，增加了生產(chǎn)成本，不利于大規(guī)模生產(chǎn)；當(dāng)料液質(zhì)量比過高時，因小麥面筋蛋白的水溶性較低，濃度過大使酶解液過于黏稠，底物與酶不能充分接觸，反而降低酶解效率。綜上，酶解的最佳條件為復(fù)合蛋白酶I添加量2 000 U/g、復(fù)合蛋白酶I酶解時間3 h、氨肽酶添加量400 U/g、氨肽酶酶解時間2 h、料液質(zhì)量比1∶12。

圖2 酶解參數(shù)對水解度及蛋白溶出率的影響Figure 2 Effects of enzymolysis conditions on the DH and protein dissolution rate of gluten hydrolysate

小圓圈表示有顯著性的變量，大橢圓分別表示50%和100%的解釋方差圖3 酶解條件與水解度和蛋白溶出率間的PLSR相關(guān)性分析Figure 3 The correlation between the enzymolysis conditions and the DH, protein dissolution rateof gluten hydrolysate analyzed by PLSR

灰色代表顯著，白色代表不顯著，正負(fù)象限代表正負(fù)相關(guān)性圖4 酶解條件對水解度和蛋白溶出率的貢獻分析Figure 4 Contribution of enzymolysis conditions on the DH and protein dissolution rate of gluten hydrolysate

2.2 小麥面筋蛋白酶解液的氨基酸組成

由表2可知，酶解液中游離氨基酸占總氨基酸的5.59%，而肽結(jié)合氨基酸占總氨基酸的94.41%，酶解液中肽結(jié)合氨基酸含量遠大于游離氨基酸含量，說明酶解液中的氨基酸主要以結(jié)合態(tài)的肽類氨基酸形式存在。小麥面筋蛋白酶解液中的氨基酸組成比較齊全，共檢測到17種氨基酸物質(zhì)。其中酶解液中呈現(xiàn)鮮甜味的氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸和丙氨酸)含量較高，達37.82 mg/mL，占酶解液總氨基酸含量的69.15%，占鮮甜味總氨基酸的98.22%。因此，酶解液中的鮮甜味主要是小麥面筋酶解過程形成的含鮮甜味氨基酸的小分子肽造成的。

2.3 小麥面筋蛋白酶解液的相對分子質(zhì)量分布

由圖5可知，小麥面筋蛋白在雙酶酶解作用下水解程度較好，大分子的小麥面筋蛋白逐漸水解成小分子肽類，相對分子質(zhì)量<1 000的組分占92.83%。相對分子質(zhì)量<500的小肽具有更強的反應(yīng)活性，更傾向于參與到美拉德反應(yīng)中[12]。綜合表3、圖4，小麥面筋蛋白在雙酶酶解后產(chǎn)生的游離氨基酸含量較低，主要生成小分子肽。

2.4 小麥面筋蛋白肽美拉德中間體的水相制備

2.4.1 反應(yīng)溫度對褐變指數(shù)的影響 由圖6可知，小麥面筋蛋白肽—木糖體系在70，80，90 ℃分別反應(yīng)120，80，60 min后，終產(chǎn)物的褐變程度最低，即小麥面筋蛋白肽—木糖美拉德反應(yīng)中間體大量生成的臨界條件。低溫反應(yīng)溫度為70 ℃時終產(chǎn)物的褐變指數(shù)明顯低于80，90 ℃的，說明小麥面筋蛋白肽—木糖中間體在此溫度下形成和積累的量明顯高于高溫反應(yīng)，中間體的次級反應(yīng)速率相對較慢。綜上，選擇70 ℃反應(yīng)120 min作為小麥面筋蛋白肽—木糖美拉德反應(yīng)中間體的最佳制備溫度和時間。

表2 小麥面筋蛋白酶解液氨基酸組分?Table 2 The composition of amino acid in gluten hydrolysate

? *表示鮮甜味氨基酸。

圖5 小麥面筋蛋白酶解液的相對分子質(zhì)量分布

Figure 5 Relative molecular weight distribution of gluten hydrolysate

圖6 反應(yīng)溫度對小麥面筋蛋白肽—木糖變溫美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變指數(shù)的影響

Figure 6 Effect of temperature on the color of final products under a variable temperature rising process

2.4.2 木糖添加量對褐變指數(shù)的影響 由圖7可知，變溫美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變指數(shù)隨半胱氨酸的添加時間變化幅度較大，呈先降低后升高的趨勢。當(dāng)糖肽比為10%，反應(yīng)時間為120 min添加半胱氨酸時，終產(chǎn)物褐變程度最小，此時小麥面筋蛋白肽—木糖美拉德反應(yīng)中間體的生成量最大。研究[13]表明，還原糖濃度的增加能加快美拉德反應(yīng)的速率，而反應(yīng)速率是通過反應(yīng)物的損失和色澤形成的速率來反映；當(dāng)木糖添加量過多時，雖會促進美拉德反應(yīng)進程，但過多的木糖會與外加的半胱氨酸反應(yīng)，改變反應(yīng)歷程，最終生成淺色美拉德反應(yīng)產(chǎn)物。因此選擇木糖的最適添加量為糖肽比10%。

圖7 木糖添加量對小麥面筋蛋白肽—木糖變溫美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變指數(shù)的影響

Figure 7 Effect of xylose addition on the color of final products under a variable temperature rising process

2.4.3 pH對褐變指數(shù)的影響 由圖8可知，不同初始pH下變溫美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變指數(shù)存在較大差異，但同一pH下不同反應(yīng)時間添加半胱氨酸后，反應(yīng)終產(chǎn)物的褐變指數(shù)均先降低后升高。由于反應(yīng)體系不同，當(dāng)初始pH為6.5，7.5，8.5時，小麥面筋蛋白肽—木糖美拉德反應(yīng)中間體形成量最多的時間分別為180，120，60 min。隨著初始pH的增大，美拉德反應(yīng)速率加快，小麥面筋蛋白肽—木糖美拉德反應(yīng)中間體形成的時間縮短；同時較高的pH有利于類黑精的形成，所以在pH 8.5條件下獲得的變溫美拉德反應(yīng)終產(chǎn)物的褐變指數(shù)最高。此外，初始pH 6.5的褐變指數(shù)較低，但中間體形成的時間較長，且反應(yīng)180 min時的褐變指數(shù)降低不顯著。因此選擇pH 7.5作為制備小麥面筋蛋白肽—木糖美拉德反應(yīng)中間體的最優(yōu)pH。

圖8 初始pH對小麥面筋蛋白肽—木糖變溫美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變指數(shù)的影響

Figure 8 Effect of initial pH on the color of final products under a variable temperature rising process

3 結(jié)論

研究篩選并確定了復(fù)合蛋白酶Ⅰ作為蛋白內(nèi)切酶，采用了雙酶分步水解法，通過PLSR法考察了復(fù)合蛋白酶Ⅰ和氨肽酶的添加量、作用時間及料液質(zhì)量比對水解度和蛋白溶出率的影響，確定了小麥面筋蛋白肽的制備條件為料液質(zhì)量比1∶12，復(fù)合蛋白酶Ⅰ以2 000 U/g底物的添加量酶解3 h后，再加入400 U/g底物的氨肽酶繼續(xù)酶解2 h。此條件下得到的酶解液中游離氨基酸占總氨基酸的5.59%，肽結(jié)合氨基酸占總氨基酸的94.41%，相對分子質(zhì)量<1 000的組分占92.83%，該酶解條件所制備的小麥面筋蛋白酶解液主要組成為小分子肽。通過變溫美拉德反應(yīng)，以半胱氨酸為示蹤劑確定了小麥面筋蛋白肽—木糖美拉德反應(yīng)中間體的水相制備條件為糖肽比10%，初始pH 7.5，反應(yīng)溫度70 ℃，反應(yīng)時間120 min。試驗未對肽美拉德中間體的結(jié)構(gòu)特征及風(fēng)味形成機制進行深入研究。后續(xù)將采用氣質(zhì)聯(lián)用、高效液相、核磁共振、飛行質(zhì)譜等分析手段，從分子水平上闡明肽美拉德中間體增強食品風(fēng)味的作用規(guī)律及機制，為其在食品體系中的加工適應(yīng)性研究提供更深入的理論依據(jù)。