何東寧 周浩東 劉暢 譚琦 谷澤慧 王亞帝

(錦州醫(yī)科大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，遼寧 錦州 121001；2附屬第三醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心)

乳腺癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率已經(jīng)高居女性惡性腫瘤之首，死亡率位列第二位〔1〕，在我國(guó)其致死率位于第五位〔2〕。在過去的20年中，乳腺癌“三早”策略及保乳手術(shù)、乳腺癌的放化療治療方案、靶向藥物等各種治療方案的臨床應(yīng)用，使乳腺癌的致死率相較1990年已降低了1/3〔3〕。然而，對(duì)于晚期或轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者(如三陰性乳腺癌)，常規(guī)治療方案的療效依舊較差，依舊有較高致死率。目前，惡性腫瘤治療已經(jīng)進(jìn)入免疫治療時(shí)代，但乳腺癌的免疫治療仍然舉步維艱。乳腺癌是一種弱或中等免疫原性的腫瘤〔4〕，未對(duì)其進(jìn)行廣泛的免疫相關(guān)的研究。目前在乳腺癌的各級(jí)診療指南中，無(wú)明確關(guān)于免疫治療方案的推薦；雖然腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)〔5〕、程序性死亡受體(PD)-1〔6〕和腫瘤突變負(fù)荷(TMB)〔7〕、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、錯(cuò)配修復(fù)(MMR)蛋白等免疫標(biāo)志物已逐步應(yīng)用于臨床預(yù)測(cè)乳腺癌免疫治療的療效或預(yù)后，因其檢測(cè)流程復(fù)雜、無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)費(fèi)用昂貴，很難在臨床廣泛應(yīng)用。如何合理選擇生物標(biāo)志物，讓更多的乳腺癌患者從免疫治療及綜合治療中獲益，是目前該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。本研究分析免疫應(yīng)答相關(guān)基因JCHAIN與乳腺癌中差異表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1人類蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜(HPA)數(shù)據(jù)庫(kù) HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.Proteinatlas.org/)是基于RNA測(cè)序分析和免疫組化分析的大型轉(zhuǎn)錄組和蛋白組數(shù)據(jù)庫(kù)〔8〕，可用于正常組織與腫瘤組織蛋白的差異表達(dá)分析。

1.2Ualcan 數(shù)據(jù)庫(kù) Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)〔9〕(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)使用來自31種癌癥類型的癌癥基因組圖譜(TCGA)3級(jí)RNA-seq和臨床數(shù)據(jù)，Ualcan可提供對(duì)公開的癌癥組學(xué)數(shù)據(jù)(TCGA和MET500)的方便訪問；允許識(shí)別生物標(biāo)記物或?qū)撛诘母信d趣基因進(jìn)行電子驗(yàn)證；提供基于基因表達(dá)的描述基因表達(dá)和患者生存信息的圖表；評(píng)估乳腺癌和前列腺癌分子亞型中的基因表達(dá)，通過啟動(dòng)子甲基化評(píng)估基因表達(dá)的表觀遺傳調(diào)控并與基因表達(dá)相關(guān)，進(jìn)行泛癌基因表達(dá)分析及連接HPRD、GeneCards、Pubmed、TargetScan、DRUGBANK、Open Targets和GTEx，可利用這些資源使研究者收集有關(guān)感興趣基因和靶點(diǎn)的有價(jià)值的信息和數(shù)據(jù)。

1.3基因表達(dá)譜動(dòng)態(tài)分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫(kù) GEPIA 數(shù)據(jù)庫(kù)〔10〕(http://gepia.cancer-pku.cn/ index.html)是由北京大學(xué)張澤民教授團(tuán)隊(duì)新開發(fā)的交互式網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，用于分析來自 TCGA 和 GTEx項(xiàng)目的9 736 個(gè)腫瘤和8 587個(gè)正常樣本的 RNA 測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)。將TCGA 和GTEx數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，進(jìn)行非常全面的表達(dá)分析。GEPIA提供網(wǎng)頁(yè)式交互展示和快速定制功能，包括腫瘤和正常差異表達(dá)譜分析、剖面繪制、根據(jù)腫瘤類型或病理分期進(jìn)行分析、患者生存分析、相似基因檢測(cè)、相關(guān)性分析和降維分析等分析模塊。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Ualcan、GEPIA軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)和Kaplan-Meier 模型生存分析。

2 結(jié) 果

2.1乳腺癌預(yù)后相關(guān)基因 結(jié)合乳腺癌TCGA轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)和HPA病理學(xué)圖集中抗體為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，運(yùn)用HPA病理學(xué)圖集中癌癥模塊進(jìn)行分析。1 075例患者(包括1 063例女性和12例男性)的轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)顯示210個(gè)基因與預(yù)后不良有關(guān)，367個(gè)基因與預(yù)后良好有關(guān)(圖1)。篩選與乳腺癌預(yù)后良好相關(guān)的目的基因進(jìn)行后續(xù)研究。

以乳腺癌作為目的研究圖1 HPA 中與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的基因表達(dá)

2.2JCHAIN為研究目標(biāo) 利用TCGA轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)和基于抗體的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)來探索乳腺癌蛋白質(zhì)組。根據(jù)1 075例患者的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，367個(gè)基因與乳腺癌預(yù)后良好相關(guān)，將乳腺癌組織中mRNA 表達(dá)量前20個(gè)基因列出，選擇mRNA表達(dá)量最高的JCHAIN作為進(jìn)一步研究目的基因，見表1。

2.3JCHAIN蛋白表達(dá) 通過芯片分析JCHAIN蛋白在乳腺癌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中表達(dá)，HPA蛋白表達(dá)橫塊中顯示JCHAIN高表達(dá)和低表達(dá)(圖2)。

2.4JCHAIN mRNA表達(dá) Ualcan分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中JCHAIN在114例正常組織和1 097例乳腺癌組織中表達(dá)差異：與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中JCHAIN表達(dá)降低(670.07 vs 76.92,P=0.000)。不同分期的乳腺癌之間 JCHAIN 表達(dá)無(wú)差別(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期分別為n=183，104.15、n=615，64.15、n=247，84.57、n=20，17.95；Ⅰ期vsⅡ期，P=0.520；Ⅰ期vs Ⅲ期，P=0.850；Ⅰ期vs Ⅳ期，P=0.597；Ⅱ期vs Ⅲ期，P=0.664；Ⅱ期vs Ⅳ期，P=0.412；Ⅲ期vs Ⅳ期，P=0.596)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的乳腺癌之間JCHAIN表達(dá)無(wú)顯著差異(NO、N1、N2、N3分別為n=516,63.36、n=362，86.05、n=120，80.19、n=77，90.03；N0 vs N1，P=0.027；N0 vs N2，P=0.601；N0 vs N3，P=0.441；N1 vs N2，P=0.295；N1 vs N3，P=0.434；N2 vs N3，P=0.860)。JCHAIN表達(dá)與乳腺癌分子分型不相關(guān)(Luminal型、HER2過表達(dá)型、三陰性乳腺癌分別為n=566，80.22、n=37，97.84、n=116，97.76；Luminal型乳腺癌vs HER2過表達(dá)型乳腺癌，P=0.398；Luminal型乳腺癌vs三陰性乳腺癌，P=0.959；HER2過表達(dá)型乳腺癌vs三陰性乳腺癌，P=0.424)。不同病理類型乳腺癌之間JCHAIN表達(dá)差異明顯〔浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(n=784,67.5)vs 浸潤(rùn)性小葉癌(n=203,142.69),P=0.000；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 vs 黏液癌(n=71,2.16)，P=0.000；浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌 vs 化生癌(n=9,4.36)，P=0.000；浸潤(rùn)性小葉癌 vs 其他類型癌(n=45,23.15)，P=0.001；浸潤(rùn)性小葉癌vs 黏液癌，P=0.000；浸潤(rùn)性小葉癌 vs 化生癌，P=0.000；浸潤(rùn)性小葉癌 vs 髓樣癌(n=6,207.16)，P=0.000；混合組織癌(n=29,89.74)vs 黏液癌，P=0.011；混合組織癌 vs 化生癌，P=0.013；其他類型癌 vs 黏液癌，P=0.048；黏液癌vs 髓樣癌，P=0.016；化生癌 vs 髓樣癌，P=0.012〕。絕經(jīng)前較絕經(jīng)后乳腺癌組織中 JCHAIN 表達(dá)增加〔670.07(n=230) vs 61.01(n=700)，P=0.044〕。JCHAIN表達(dá)與性別相關(guān)，女性較男性乳腺癌患者JCHAIN 表達(dá)增高，但較正常人明顯降低〔正常人(670.07)vs男性乳腺癌患者(n=12，4.64)，P<0. 000；正常人vs女性乳腺癌患者(n=1 075，80.19)，P=0.000；男性乳腺癌患者 vs女性乳腺癌患者，P<0.000〕。不同種族乳腺癌中JCHAIN表達(dá)與正常人群均有顯著差異，高加索人群較非裔美國(guó)人乳腺癌中JCHAIN表達(dá)水平顯著高〔正常人(670.07)vs高加索人(n=748,82.10)，P=0.000；正常人vs非裔美國(guó)人(n=748,66.04)，P=0.000；正常人vs亞洲人(n=61,118.20),P=0.000；高加索人vs 非裔美國(guó)人，P=0.014〕。

2.5JCHAIN mRNA差異表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的相關(guān)性 運(yùn)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)生存分析模塊針對(duì)JCHAIN 的差異表達(dá)情況進(jìn)行分析，JCHAIN低、高表達(dá)各535例，與JCHAIN 低表達(dá)組相比，JCHAIN高表達(dá)組總生存顯著延長(zhǎng)(P=0.002)，JCHAIN差異表達(dá)對(duì)無(wú)疾病進(jìn)展生存期無(wú)明顯影響(P=0.067)。見圖3。

表1 與乳腺癌預(yù)后良好相關(guān)的20個(gè)基因

圖2 JCHAIN在乳腺癌組織中的蛋白表達(dá)(×200)

TPM：每百萬(wàn)條基因轉(zhuǎn)錄本圖3 運(yùn)用 GEPIA 進(jìn)一步驗(yàn)證 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中乳腺癌組織中JCHAIN表達(dá)差異和生存分析

3 討 論

免疫治療為乳腺癌治療帶來新的希望，但目前免疫治療無(wú)確切的預(yù)測(cè)免疫療效的生物標(biāo)志物。JCHAIN基因是多層IgA與IgM的連接鏈，定位于2q21，別名：IGCJ、IGJ、JCH，其mRNA大小為1 413 bp。JCHAIN主要功能是經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯產(chǎn)生J鏈免疫球蛋白。J鏈?zhǔn)且环N進(jìn)化保守的15 kD蛋白，可將IgA和IgM單體分別連接成五聚體和二聚體。J鏈蛋白在B淋巴細(xì)胞分化和胸腺細(xì)胞發(fā)育的各個(gè)階段都有表達(dá)，其唯一已知的功能是促進(jìn)分泌型IgA(SIgA)構(gòu)成具有重要意義〔11〕。目前有關(guān)JCHAIN基因的研究多圍繞著SIgA進(jìn)行，研究認(rèn)為腫瘤復(fù)發(fā)與SIgA水平升高有關(guān)，這表明腫瘤可能存在特定的分泌反應(yīng)，認(rèn)為SIgA可用來區(qū)分有復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤患者〔12～15〕。

新近的研究多從JCHAIN基因角度出發(fā)，認(rèn)為該基因是許多實(shí)體和血液惡性腫瘤的標(biāo)志性或預(yù)后因子。早期大腸癌和轉(zhuǎn)移性大腸癌之間存在128個(gè)重復(fù)差異基因表達(dá)，富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要生物功能集中在免疫應(yīng)答(IGJ、IGKC、IIGLJ3等)、細(xì)胞外基質(zhì)相互作用和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等方面，表明免疫反應(yīng)在結(jié)直腸癌預(yù)后中有重要的調(diào)節(jié)作用〔16〕。在被B/P的標(biāo)記的乳腺癌和皮膚癌研究中觀察到一種或多種病理亞型，特別是血漿B細(xì)胞中含有高度富集的免疫球蛋白基因(IGKC、IGLJ3、IGJ)，且均與患者的預(yù)后相關(guān)〔17〕。而Cruz等〔19〕研究結(jié)果提示ID1、D3和IGJ基因的高表達(dá)與成人急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)的誘導(dǎo)治療完全緩解率低、總生存及無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間縮短有關(guān)。該研究的結(jié)果與以上研究不一致，可能是選擇的瘤種、治療方案及臨床病理特征等不同導(dǎo)致，需進(jìn)一步臨床研究驗(yàn)證。以上研究提示JCHAIN是乳腺癌患者預(yù)后的標(biāo)志之一，將來可用于臨床的相關(guān)評(píng)估。

本研究結(jié)果提示乳腺癌發(fā)生、發(fā)展與免疫反應(yīng)間存在關(guān)聯(lián)。研究通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)到IGKC和IGJ在早期肺癌、癌旁組織及晚期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織中表達(dá)水平逐漸升高，IGKC和IGJ是NSCLC發(fā)生發(fā)展中特征性轉(zhuǎn)錄生物標(biāo)記物，表明體液免疫反應(yīng)在NSCLC起重要作用〔20〕。馮建剛〔21〕研究0～5 Gy的60Co α射線劑量照射范圍內(nèi)，人淋巴細(xì)胞株中JCHAIN基因表達(dá)量隨照射劑量的增加而增加。出現(xiàn)上述結(jié)果可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程抑制了漿細(xì)胞產(chǎn)生SIgA，或抑制了唾液腺細(xì)胞的免疫球蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制〔15〕，JCHAIN基因轉(zhuǎn)錄水平上的差異表達(dá)可作為疾病動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)標(biāo)志物，具有進(jìn)一步研究的必要性。這也是選擇JCHAIN作為評(píng)價(jià)乳腺癌患者免疫能力的候選生物標(biāo)志物的原因。

本研究存在一定的局限性，由于這項(xiàng)研究的病例資料僅來自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的人群，因此除基因表達(dá)特征及其相關(guān)表型標(biāo)記表達(dá)水平差異以外，研究結(jié)果還可能受其他因素影響，如患者的種族、治療和預(yù)后等。此外，還需要進(jìn)行更多的臨床研究，包括納入更多患者，進(jìn)而確證JCHAIN可能作為乳腺癌預(yù)后指標(biāo)。盡管有上述限制，JCHAIN基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中仍具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。