王亞惠，謝純良，周映君，龔文兵，朱作華，彭源德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長沙410205）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱“瑞芝”、“仙草”，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina），非褶菌目（Aphyllophorales），多孔菌科（Polyporaceae），靈芝屬（Ganoderma），是一種珍稀食藥用真菌，在中國已有2000多年的藥用歷史[1]。靈芝的藥理活性成分很多，包括多糖、三萜和生物堿等十余種活性成分[2，3]，應(yīng)用范圍廣泛，不但具有醫(yī)療效果[4]，而且具有美容和保健功能[5-7]。傳統(tǒng)的靈芝栽培多以木屑、棉籽殼為原料，但近年來由于資源日趨貧乏、運輸成本高、農(nóng)藥殘留高等問題，亟需尋找生產(chǎn)成本低廉的栽培原料替代品。麻類副產(chǎn)品具有質(zhì)地疏松、吸水性極強(qiáng)、不板結(jié)、透氣性較好等物理特性，因此成為靈芝栽培的一種理想原料。同時，本實驗室前期研究結(jié)果表明，麻類副產(chǎn)品栽培靈芝較常規(guī)栽培靈芝，蛋白質(zhì)、三萜、多糖等物質(zhì)的含量更豐富。

靈芝作為一種傳統(tǒng)名貴中藥，長期以來便被認(rèn)定具有特殊的美白、延緩衰老等功效[8]。因此，在現(xiàn)代化妝品中，以靈芝為功能性原料開發(fā)的化妝品種類甚多。據(jù)統(tǒng)計，目前市面上主打靈芝概念的化妝品系列多達(dá)十余種，但其中的靈芝成分主要為靈芝子實體提取物。靈芝中活性成分提取方法各異，水提取和醇提取法以低成本、安全、無污染的優(yōu)勢應(yīng)用最為廣泛。但其同樣存在雜質(zhì)含量高、操作麻煩、對提取物活性損耗較大等缺點[9]。隨著人們對化妝品天然性需求的增高，操作條件溫和、無污染、能耗小的生物提取技術(shù)越來越多被用于高端化妝品中。例如，利用益生菌發(fā)酵可以有效提取人參、五倍子等多種中草藥的活性成分，用于護(hù)膚品的開發(fā)。同時，研究表明Kefir粒發(fā)酵的靈芝提取液具有良好的保濕作用，且效果顯著優(yōu)于釀酒酵母菌和納豆芽胞桿菌[10]。但目前為止，生物發(fā)酵對靈芝提取液的抗氧化和美白功效的研究還鮮有報道。本研究比較了釀酒酵母、保加利亞乳桿菌及其復(fù)合菌種發(fā)酵對紅麻副產(chǎn)品栽培中華紅芝多糖、三萜的提取效率影響，及其發(fā)酵液的抗氧化和美白功效差異，從而揭示了靈芝功效性成分多糖、三萜對其發(fā)酵液美白功效的重要作用，為靈芝生物發(fā)酵技術(shù)在化妝品領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供試菌株中華紅芝A-1916，由江蘇高郵市科學(xué)食用菌研究所提供。紅麻副產(chǎn)品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所紅麻育種研究室提供，曬干打碎后，以58%的添加量配制靈芝栽培基質(zhì)并進(jìn)行中華紅芝栽培，所得中華紅芝子實體用于本研究實驗分析。供試發(fā)酵菌種釀酒酵母（簡稱Sc）和保加利亞乳桿菌（簡稱Lb）均來源于實驗室保存菌種。

1.1.2 主要試劑

L-酪氨酸，購自北京索萊寶生物科技有限公司；酵母提取物，購自漢尼生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、香草醛，購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、冰醋酸、高氯酸、氯仿，購自湖南匯虹試劑有限公司；酪氨酸酶，購自博美生物科技有限公司；1，1-二苯基-2苦肼基自由基（DPPH）、齊墩果酸，購自上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；大豆蛋白胨，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蒸餾水，實驗室自制；SIGMA 3K15臺式高速冷凍離心機(jī)，購自北京思博晟達(dá)科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（g／L）：馬鈴薯 200 g（去皮），葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，蒸餾水 1000 mL，121℃滅菌20 min。MRS肉湯培養(yǎng)基（g／L）：MRS肉湯49.25 g，蒸餾水1000mL，115℃滅菌30min。YPD培養(yǎng)基（g／L）：酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，大豆蛋白胨20 g，酵母膏 1 g，蒸餾水1000 mL，115℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)

釀酒酵母的培養(yǎng)：于4℃冰箱中取出保藏的菌種，于無菌條件下取一環(huán)菌種接種至10 mL YPD培養(yǎng)基中，25℃避光培養(yǎng)2 d，活化。再以2%的接種量接種至200 L新鮮YPD培養(yǎng)基中，25℃避光培養(yǎng)24 h，測定其菌濃度并調(diào)節(jié)至108CFU／mL備用。

保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)：于4℃冰箱中取出保藏的菌種，于無菌條件下取一環(huán)菌種接種至10 L MRS培養(yǎng)基中，35℃避光培養(yǎng)24 h，活化。再以2%的接種量接種至200 L新鮮MRS肉湯培養(yǎng)基中，35℃避光培養(yǎng)24 h，測定其OD 600并稀釋至1.0備用。

1.2.2 中華紅芝子實體發(fā)酵液的制備

取中華紅芝子實體，與無菌水按1：20（g：mL）混合均勻后打漿，即得靈芝漿液。向靈芝漿液中添加5%（W／V）葡萄糖，隨后進(jìn)行如下處理：a）接種6.5%釀酒酵母于靈芝漿液中，并于25℃下避光靜置發(fā)酵72 h；b）接種6.5%保加利亞乳桿菌于靈芝漿液中，并于35℃下避光靜置發(fā)酵48 h；c）接種6.5%釀酒酵母于靈芝漿液中，并于25℃下避光靜置發(fā)酵72 h；隨后向靈芝發(fā)酵液中添加3%（W／V）葡萄糖，并接種6.5%保加利亞乳桿菌于靈芝漿液中，于35℃下避光靜置發(fā)酵48 h。將發(fā)酵產(chǎn)物在5000 g條件下離心25 min，棄沉淀，收集上清液，通過0.22μm濾膜過濾，即為中華紅芝子實體發(fā)酵液。

1.2.3 多糖含量測定

測定方法參照何云慶[11]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及測定方法：分別用超純水配制濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg／mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 1 mL，向試管中加入等體積5%苯酚溶液，隨后快速加入濃硫酸5 mL，振蕩后靜置反應(yīng)30 min，490 nm測吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

分別取三種處理發(fā)酵液1mL于50mL離心管中，加入3倍體積的95%乙醇醇析24 h，5000 g，離心20 min，棄上清，將沉淀于超低溫冷凍干燥機(jī)中干燥2～3 h，再加20 mL超純水將沉淀物溶解稀釋到合適的濃度，充分溶解后，吸取1 mL該待測液，按照上述苯酚-硫酸法測得吸光值，再通過葡萄糖標(biāo)曲計算待測液得多糖含量，并以初始靈芝漿液為對照進(jìn)行比較分析。

1.2.4 三萜含量測定

測定方法參照石鳳敏[12]。精確移取濃度為 100μg／mL的齊墩果酸溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于試管中，進(jìn)行水浴加熱直至溶劑揮干，再加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液以及1 mL的高氯酸，迅速混合均勻后進(jìn)行65℃15 min的水浴加熱；用自來水充分冷卻后用冰醋酸定容至5 mL，于550 nm處測吸光度值；以齊墩果酸的質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取樣液0.1 mL于試管中，加入0.9 mL無水乙醇室溫下放置1 h左右，沸水浴加熱使液體揮發(fā)，加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液以及1 mL的高氯酸，迅速混合均勻后進(jìn)行65℃15 min的水浴加熱；用自來水充分冷卻后用冰醋酸定容至5 mL，于550 nm處測吸光度值，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算三萜含量，并以初始靈芝漿液為對照進(jìn)行比較分析。

1.2.5 清除DPPH自由基能力測定

取1 mL待測液加1mL濃度為0.2mmol／L的DPPH，室溫下靜置30min后，在517 nm波長處測吸光度值，根據(jù)吸光度代入如下公式中，計算DPPH清除率。

DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）／A0]×100%；

式中：Ai為1mL的DPPH+1 mL樣品的吸光度；Aj為1 mL溶劑+1 mL樣品的吸光度；A0為1 mL DPPH+1 mL溶劑的吸光度。

1.2.6 超氧陰離子自由基清除能力測定

取5.7 mL的50 mmol／L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液于10 mL EP管中，向其中加入0.2 mL樣液，混勻后于25℃保溫10min，然后加入于25℃條件下預(yù)熱的10mmol／L的鄰苯三酚溶液0.1mL，總體積為6 mL，迅速搖勻后用紫外-可見分光光度計記錄其在320 nm波長處1 min內(nèi)吸光度的增加值（As）。計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值。另取試劑同上，將樣液用等體積水替代，同樣測定其在320 nm波長下，1 min內(nèi)吸光度的增加值（A0）。根據(jù)下述公式計算超氧陰離子自由基清除率：超氧陰離子自由基清除率 （%）=（A0-As）／A0×100%。

1.2.7 酪氨酸酶抑制率測定方法

參照張智萍等[12-14]的方法。用微量移液器分別按下表1的體積準(zhǔn)確吸取 T1、T2、T3、T4中的酪氨酸酶、PBS及樣品的反應(yīng)液分別置于4個PE管中，混勻，37℃恒溫水浴10 min，然后在T2、T4中分別加入1 mL的L-酪氨酸，37℃反應(yīng)10 min，快速置于冰水中冷卻。用酶標(biāo)儀在475 nm處測定其吸光度AT1、AT2、AT3、AT4。按以下公式計算樣品抑制酪氨酸酶的活性：

其中，AT1：未加樣品且未加酪氨酸酶的反應(yīng)液在475 nm處測得的吸光度

AT2：未加樣品加酪氨酸酶的反應(yīng)液在475 nm處測得的吸光度

AT3：加樣品而未加酪氨酸酶的反應(yīng)液在475 nm處測得的吸光度

AT4：加樣品和加酪氨酸酶的反應(yīng)液在475 nm處測得的吸光度

表1 反應(yīng)體系Table1 Reaction system

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、方差分析、相關(guān)性分析；采用SPSS對不同處理條件下多糖、三萜、DPPH清除率、超氧陰離子清除率、酪氨酸酶抑制率差異顯著性進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母和保加利亞乳桿菌發(fā)酵對中華紅芝子實體總糖和三萜溶出量的影響

中華紅芝子實體中含有多種生物活性成分，但需要適宜的方式進(jìn)行提取才能進(jìn)行有效利用。本研究分別利用釀酒酵母和保加利亞乳酸菌對中華紅芝子實體進(jìn)行了單一發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵處理，分別檢測了各處理發(fā)酵液中兩種主要活性物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，與對照相比，經(jīng)釀酒酵母和保加利亞乳桿菌發(fā)酵處理后的靈芝發(fā)酵液中總糖和三萜均有所增加。由圖1可知，釀酒酵母與保加利亞乳桿菌復(fù)合發(fā)酵處理效果最佳，其靈芝漿液總糖與三萜含量顯著高于未發(fā)酵靈芝漿液與兩種菌單獨發(fā)酵處理的靈芝漿液（P＜0.01），分別可達(dá)369.6μg／mL與249.3μg／mL。此外，在未發(fā)酵靈芝漿液中靈芝三萜的溶出量極低，但經(jīng)三種生物發(fā)酵處理后，其溶出含量分別達(dá)167.4μg／mL、133.1μg／mL、249.3μg／mL。由此可見，釀酒酵母和保加利亞乳桿菌發(fā)酵可以顯著提高中華紅芝子實體的總糖和三萜溶出量。

圖1 釀酒酵母和保加利亞乳桿菌發(fā)酵對中華紅芝子實體總糖和三萜溶出量的影響Fig.1 Effects of fermentation with Saccharomyces cerevisiae and／or Lactobacillus bulgaricus of saccharides and triterpenoids contents of G.lucidum.

2.2 中華紅芝子實體發(fā)酵液抗氧化性和美白功效分析

為探究中華紅芝子實體發(fā)酵液的抗氧化性和美白功效，分別對其清除DPPH自由基能力、超氧陰離子清除能力、酪氨酸酶抑制能力進(jìn)行了評估。結(jié)果如圖2所示，發(fā)酵后靈芝漿液的DPPH自由基清除率、超氧陰離子清除率較未發(fā)酵靈芝漿液有顯著提升。其中釀酒酵母發(fā)酵72 h的靈芝發(fā)酵液的DPPH清除率高達(dá)40.5%，顯著高于其他兩個發(fā)酵處理。而不同發(fā)酵方式靈芝發(fā)酵液的超氧陰離子清除能力卻較為一致，差異不顯著。此外，以酪氨酸酶抑制率為指標(biāo)測定不同處理條件下靈芝漿液的美白功效，結(jié)果表明不同發(fā)酵方式處理的靈芝發(fā)酵液美白功效均有顯著提高（P＜0.01），其中釀酒酵母與保加利亞乳桿菌復(fù)合發(fā)酵處理靈芝發(fā)酵液美白功效最佳，其靈芝漿液酪氨酸酶抑制率顯著高于未發(fā)酵靈芝漿液與兩種菌單獨發(fā)酵處理的靈芝漿液（P＜0.01），可達(dá)42.4%。由此可見，發(fā)酵處理可以有效提高中華紅芝漿液的抗氧化能力和美白功效。

圖2 不同發(fā)酵方式對中華紅芝漿液抗氧化和酪氨酸酶抑制功效的影響Fig.2 Effects of different fermentation methods on antioxidant activity and tyrosinase inhibition of G.lucidum.

2.3 中華紅芝子實體發(fā)酵液與水／醇提取液抗氧化性和美白功效的比較分析

為評估中華紅芝子實體發(fā)酵液在化妝品中的應(yīng)用潛力，本研究利用中華紅芝子實體水／醇提取液與發(fā)酵液進(jìn)行了比較分析，結(jié)果如圖3所示。與中華紅芝水／醇提取液相比，釀酒酵母與保加利亞乳桿菌復(fù)合發(fā)酵所得發(fā)酵液的DPPH自由基清除率與水提取液差異不明顯，但顯著低于醇提取液。但其超氧陰離子清除率和酪氨酸酶抑制率則顯著高于中華紅芝水／醇提取液，分別高達(dá)20.96%和42.4%（P＜0.01）。由此可見，中華紅芝復(fù)合發(fā)酵液具有良好的抗氧化和美白功效，在化妝品領(lǐng)域有良好的應(yīng)用潛力。

圖3 中華紅芝子實體發(fā)酵液與其水／醇提取液抗氧化和酪氨酸酶抑制功效比較Fig.3 Comparison of antioxidant and tyrosinase inhibitory effects between fermentation broth and water／alcohol extract of G.lucidum

2.4 中華紅芝子實體多糖和三萜的美白功效分析

為探究中華紅芝子實體發(fā)酵液多糖和三萜含量的增加與其酪氨酸酶抑制率提高的相關(guān)性，本研究將發(fā)酵液多糖和三萜進(jìn)行了提取，并對其酪氨酸酶抑制率進(jìn)行測定，結(jié)果表明，1 mg中華紅芝子實體發(fā)酵液多糖的酪氨酸酶抑制率為27.32%，而0.5 mg中華紅芝子實體發(fā)酵液三萜的酪氨酸酶抑制率則為69.68%（圖4）。由此可見，多糖和三萜均具有酪氨酸酶抑制作用，但三萜的抑制作用更為顯著。

圖4 中華紅芝子實體發(fā)酵液多糖和三萜酪氨酸酶抑制活性比較Fig.4 Comparison of inhibitory activity of polysaccharides and triterpene tyrosinase in fermentation broth of G.lucidum.

3 討論

靈芝在我國擁有悠久的使用歷史，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)將其視為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、固本扶正的名貴中藥?！侗静菥V目》有記載“靈芝補(bǔ)中益氣，增智慧，好顏色，久食輕身不老，延年神仙”。由此可見其美容功效卓著。在系統(tǒng)的傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論背景基礎(chǔ)上，加之目前市場上自然、綠色概念化妝品的盛行，使得靈芝成分在化妝品領(lǐng)域的運用愈發(fā)廣泛[14]。靈芝功能性活性成分復(fù)雜，其中以子實體的活性成分最為豐富。靈芝子實體是一種致密的傘狀結(jié)構(gòu)，為獲得其中的有效成分，通常會采用不同的處理方式，一般以乙醇提法、水提法使用最廣泛。但其提取物雜質(zhì)含量高、處理過程中物質(zhì)活性損失是水／醇提法不可避免的缺陷。同時，在追求化妝品綠色、天然的大趨勢下，物理提純方式則不再是最優(yōu)選擇。

近年來，利用微生物發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行生物活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化與提取成為了化妝品界的研究熱點，也取得了諸多新進(jìn)展[15]。例如，蘇寧（2017）等利用一株黃酒酵母對紅景天根進(jìn)行發(fā)酵，得到的紅景天發(fā)酵原漿具有較好的美白和抗氧化功效，其10%發(fā)酵原漿的DPPH清除率和酪氨酸酶抑制率均可達(dá)到80%。同時，發(fā)酵液含有小分子量活性肽，易被皮膚吸收，對人體有較好的安全性[16]。李瑜（2018）發(fā)現(xiàn)酵母和乳酸菌混合發(fā)酵包含紅景天、五倍子、綠茶葉、丁香的復(fù)合中藥后其酪氨酸酶抑制率提高37.34%，總還原力達(dá)到27.85 mmol／L，總酚含量提高至147.8 mg／g。此外，葡萄籽乳酸菌發(fā)酵液、蘆薈乳酸菌發(fā)酵液、核桃青皮果蔬發(fā)酵液、龍舌蘭乳酸菌酵母復(fù)合發(fā)酵液、人參無患子乳酸菌發(fā)酵提取液等均被證實具有抗衰老等多種美容功效，可有效應(yīng)用于化妝品中[17-22]。總體而言，微生物轉(zhuǎn)化對生物活性物質(zhì)的提取作用更溫和，能夠最大程度的保留被提取物中的天然活性成分，降低毒副作用，同時微生物在代謝過程中產(chǎn)生的多種活性酶達(dá)到增效的作用，具有極大的應(yīng)用前景。目前為止，尚未有人對靈芝進(jìn)行微生物發(fā)酵處理評價其化妝品功效。因此，本研究中利用釀酒酵母和保加利亞乳桿菌對紅麻副產(chǎn)品栽培中華紅芝進(jìn)行了發(fā)酵試驗，同時研究結(jié)果也證實中華紅芝發(fā)酵液具有良好的抗氧化和酪氨酸酶抑制活性，其DPPH清除率、超氧陰離子清除率和酪氨酸酶抑制率較發(fā)酵前分別提高32.5%、2.66倍和1.15倍，并顯著高于中華紅芝的水提和醇提液。由此可見，酵母和乳酸菌發(fā)酵可用作靈芝功效成分提取的有效方式，可有效應(yīng)用于靈芝類化妝品的研發(fā)。

此外，研究中發(fā)現(xiàn)中華紅芝子實體發(fā)酵液酪氨酸酶抑制能力增強(qiáng)與其發(fā)酵液中多糖和三萜含量增加有關(guān)。將發(fā)酵液中的多糖和三萜進(jìn)行提純后，分別測定其酪氨酸酶抑制率，結(jié)果證實靈芝三萜和多糖均具有酪氨酸酶抑制活性作用，但靈芝三萜的抑制能力更強(qiáng)，該結(jié)果與前人研究結(jié)果類似。陸易[23]通過對乙酸乙酯提取后的靈芝三萜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)靈芝萜烯酮醇和過氧化麥角甾醇能通過影響黑色素B16細(xì)胞的合成，進(jìn)而有效地抑制黑色素的分泌和釋放。此外，Ji-Woog[24]的研究結(jié)果也表明靈芝萜酮二醇亦可抑制黑色素的合成。從靈芝菌絲體、孢子粉、子實體和發(fā)酵液中分離得到的三萜類化合物有上百種[25]，且不同靈芝品種的三萜種類及含量存在較大差異。目前為止，中華紅芝中的美白功能性成分尚無具體文獻(xiàn)報道。而本研究證實三萜類物質(zhì)為中華紅芝子實體的主要美白成分，其具體的美白因子種類尚有待進(jìn)一步研究。