王 蕾 夏 紅 羅玉輝 陳體輝 李 雪 凡利敏

早期宮頸癌預(yù)后較好，5年生存率在92%左右，原位癌甚至可達(dá)100%[1]，因此盡早通過篩查宮頸病變，建立科學(xué)有效的宮頸癌防治體系至關(guān)重要。液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(TCT)在宮頸癌篩查方面應(yīng)用已有較長歷史，且通過涂片質(zhì)量優(yōu)化，其診斷靈敏度獲得較大提升[2]；隨著人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染與宮頸癌之間因果關(guān)系的確立，而聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實(shí)時(shí)熒光技術(shù)的出現(xiàn)也令病毒DNA鑒別的簡易性與精確性維持在較高水平[3]，故HPV分型檢查也成為宮頸癌篩查的重要環(huán)節(jié)，且與TCT聯(lián)用提高診斷準(zhǔn)確性已被臨床所廣泛認(rèn)同[4]。腫瘤異常蛋白(TAP)是近年來腫瘤領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，已證實(shí)與乳腺癌、肺癌、胃腸癌等病理進(jìn)展機(jī)制之間存在密切聯(lián)系[5-7]，對此，本研究旨在分析外周血TAP、HPV分型診斷、TCT分別及聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌篩查的可行性與診斷效能，現(xiàn)將取得成果作如下報(bào)告。

1 材料與方法

1.1 一般資料

對2019年1月至2019年3月期間，于我科確診的110例宮頸病變患者臨床資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：陰道鏡檢查發(fā)現(xiàn)宮頸病變；年齡20～80歲；有性生活史；1周內(nèi)完成宮頸組織活檢、外周血TAP、HPV分型檢查及TCT。排除標(biāo)準(zhǔn)：診斷出其他部位良惡性腫瘤或HPV感染；妊娠期女性；伴有盆腔嚴(yán)重感染；檢查前1周內(nèi)有陰道用藥、物理治療史或3 d內(nèi)有性生活、陰道沖洗史；既往存在婦科手術(shù)史?；颊呤軝z時(shí)年齡為24～75歲，平均(47.52±13.86)歲；初次性生活年齡16～23歲，平均(19.73±1.54)歲；孕次為1～7次，平均(3.28±0.74)次；產(chǎn)次為0～3次，平均(1.65±0.39)次。根據(jù)宮頸組織學(xué)活檢結(jié)果將7例宮頸癌患者、39例鱗狀上皮內(nèi)高度病變(HSIL)患者納入危險(xiǎn)組(n=46)，將37例鱗狀上皮內(nèi)低度病變(LSIL)患者與27例慢性宮頸炎癥患者納入對照組(n=64)。

1.2 外周血TAP水平測定方法

常規(guī)采集患者空腹?fàn)顟B(tài)下指尖血20 μl，均勻涂片≥2/3玻片長度，置于水平工作臺室溫18 ℃～25 ℃環(huán)境下自然風(fēng)干；采用TAP檢測試劑盒(聯(lián)科生物MultiSciences公司提供)，按照試劑盒說明書指示，向玻片垂直滴加凝聚助劑3滴，形成3個(gè)斑點(diǎn)，自然風(fēng)干；采用腫瘤異常蛋白監(jiān)測系統(tǒng)圖像分析儀(曼想科技公司提供)，通過顯微裝置觀察TAP凝聚形態(tài)，并定量計(jì)算其覆蓋面積。

1.3 HPV分型檢測方法

于患者月經(jīng)干凈后≥3 d進(jìn)行采樣，取截石位，以鴨嘴型窺器充分暴露宮頸，棉拭子輕輕擦去過多分泌物，置入一次性宮頸采樣刷，以宮頸外口為圓心，覆蓋宮頸外口轉(zhuǎn)化區(qū)及宮頸管內(nèi)，施加適當(dāng)壓力沿固定方向刷取5～10周，裝入細(xì)胞保存液徹底洗脫細(xì)胞，混勻后分裝至2個(gè)樣品管封存；其中1份樣品采用cobas 4800系統(tǒng)(羅氏Roche公司提供)自動(dòng)執(zhí)行細(xì)胞裂解與DNA提取、純化，采用LineGene 9660熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(博日BIOER公司提供)擴(kuò)增HPV與內(nèi)質(zhì)控β-goblin基因的目標(biāo)DNA序列，使其目標(biāo)DNA序列能夠與相應(yīng)的熒光探針結(jié)合，不同亞型HPV DNA探針以不同熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測樣本的熒光信號確定其含有的HPV種類與載量，以循環(huán)閾值<40.0判定為對應(yīng)亞型HPV陽性，高危型HPV涵蓋16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68共14種亞型，其余6、11、30、42、43、44等亞型則為低危型，≥2種HPV亞型陽性可提示混合感染。

1.4 TCT方法

以上述采樣獲得的另1份樣品管為標(biāo)本，置入HQTCT-Thin Plus膜式全自動(dòng)液基薄層細(xì)胞制片機(jī)(鴻琪HQ公司提供)，經(jīng)由過濾、細(xì)胞富集、排液、吸附轉(zhuǎn)移制備為液基薄層涂片并在95%乙醇中固定，多次沖洗后通過蘇木素核染色、堿化、橙黃胞質(zhì)染色后以中性樹膠封固，由科內(nèi)高年資醫(yī)師在高倍鏡下進(jìn)行判讀，參考Bethesda系統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)(TBS)[8]，診斷結(jié)果分為：未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性細(xì)胞(NILM)、不典型鱗狀上皮細(xì)胞(ASC)、LSIL、HSIL及鱗狀細(xì)胞癌(SCC)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者外周血TAP水平及HPV分型檢查結(jié)果比較

危險(xiǎn)組外周血TAP水平明顯高于對照組，而兩組HPV分型檢查各結(jié)果分布也存在明顯差異，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患者外周血TAP水平及HPV分型檢查結(jié)果比較

2.2 兩組患者TCT結(jié)果比較

危險(xiǎn)組TCT結(jié)果病變程度明顯較對照組更嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 兩組患者TCT結(jié)果比較(例，%)

2.3 診斷效能分析

外周血TAP篩查診斷宮頸癌ROC曲線截?cái)嘀禐?23.74 μm2，該指標(biāo)聯(lián)合以HPV分型檢查、TCT篩查診斷宮頸癌ROC曲線AUC為0.892(95%CI=0.831～0.952)，明顯大于各項(xiàng)單篩檢查方案，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，敏感性為86.96%，特異性為79.69%，見圖1、表3。

圖1 各檢查方案篩查診斷宮頸癌的ROC曲線

3 討論

目前臨床推薦的治療策略中，LSIL與慢性宮頸炎癥多以隨訪觀察、物理治療等保守措施為主，病情具有可逆性，而HSIL惡變趨勢幾乎不可逆轉(zhuǎn)，與宮頸癌類似，需及時(shí)采取手術(shù)治療[9]，因此盡早通過篩查作出分級診斷對改善預(yù)后尤為關(guān)鍵。

既往臨床宮頸細(xì)胞學(xué)檢查多通過宮頸刮片進(jìn)行采樣，一方面刮取細(xì)胞可能不具有檢測價(jià)值，部分細(xì)胞難以轉(zhuǎn)移至載玻片，另一方面制片過程中也可能由于操作原因令細(xì)胞發(fā)生變形，暴露在空氣中不易保存，處理不當(dāng)時(shí)炎癥細(xì)胞、血細(xì)胞及粘性分泌物也將干擾讀片，存在較高漏診率[10]。自TCT推廣應(yīng)用以來，采用宮頸細(xì)胞刷能采集面更廣且更均勻，通過保存液及程序化制片技術(shù)，極大提高細(xì)胞轉(zhuǎn)移效率與涂片質(zhì)量，可將宮頸上皮內(nèi)病變診斷靈敏度由38%提高至65%[11]。然而細(xì)胞學(xué)檢查歸根結(jié)底需在鏡下判讀，雖然診斷標(biāo)準(zhǔn)明確，但仍受到醫(yī)師主觀性的影響，可重復(fù)性欠佳，假陰性率仍較高。本研究中，危險(xiǎn)組TCT結(jié)果病變程度顯著較對照組更嚴(yán)重，其篩查診斷宮頸癌的敏感性與特異性分別為50.00%、93.75%，這表明部分宮頸病變患者無法通過細(xì)胞學(xué)特征進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，究其原因可能與HPV感染早期引起宮頸細(xì)胞形態(tài)變化不明顯有關(guān)。

高危型HPV感染宮頸移行帶基底層細(xì)胞是宮頸癌病理進(jìn)展的必須因素，病毒復(fù)制到一定數(shù)量可通過修飾遺傳物質(zhì)，上調(diào)表達(dá)E6、E7等蛋白，介導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞正常生命周期，破壞信號傳遞與免疫識別機(jī)制，從而誘發(fā)癌變[12]。HPV分型檢測是以其遺傳物質(zhì)DNA為目標(biāo)，通過PCR靶點(diǎn)優(yōu)選、靶點(diǎn)擴(kuò)增、自動(dòng)化實(shí)時(shí)檢測、選擇性擴(kuò)增的過程，識別相應(yīng)HPV復(fù)制情況，其精度較第二代雜交捕獲試驗(yàn)檢測更為理想[13]，可便于臨床醫(yī)師精確判斷HPV感染亞型，及時(shí)作出跟蹤隨診，有效提高診斷效能。本研究發(fā)現(xiàn)，危險(xiǎn)組HPV分型檢查各結(jié)果分部比率與對照組差異較大，其敏感性與特異性分別為78.26%、68.75%，提示HPV分型檢查盡管能有效識別感染，但由于特異性不足，可能導(dǎo)致部分患者因診斷高估病情而接受必要的陰道鏡活檢或過度治療，因此部分學(xué)者不建議30歲以下女性開展[14]。

表3 ROC曲線相關(guān)參數(shù)

注：AUC與聯(lián)合篩查比較，*為P<0.05。

腫瘤細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，其內(nèi)部諸如糖基轉(zhuǎn)移酶、糖苷酶等糖基化修飾酶類活性降低，細(xì)胞表面糖蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，N-聯(lián)聚糖分支增加，將TAP釋放進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)，細(xì)胞黏附性降低，因而更易發(fā)生浸潤或轉(zhuǎn)移[15]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，外周血TAP檢出陽性但其他檢查項(xiàng)目均未發(fā)現(xiàn)腫瘤的患者在隨訪18個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)有3.6%確診惡性腫瘤，因此尤其適宜于卵巢癌、宮頸癌等發(fā)病率高且起病隱匿的婦科腫瘤篩查，該指標(biāo)可起到良好的早期預(yù)警作用[16]。TAP不同于傳統(tǒng)的血清腫瘤標(biāo)志物，通常采集受檢對象少量末梢血于載玻片上開展檢測試驗(yàn)，觀察其凝聚顆粒覆蓋面積進(jìn)行診斷，早期定性研究發(fā)現(xiàn)其陰性結(jié)果多表現(xiàn)為雪花狀、樹枝狀或年輪狀的條帶聚集形態(tài)，顆粒之間存在網(wǎng)格狀花紋，而陽性結(jié)果則多以邊緣規(guī)整的類圓形、團(tuán)塊狀聚集形態(tài)，周圍附有少量黑色顆粒[17]，試驗(yàn)現(xiàn)象典型性強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，危險(xiǎn)組外周血TAP水平明顯高于對照組，單篩宮頸癌截?cái)嘀禐?23.74 μm2，與以往研究中的121 μm2較為接近，且聯(lián)合HPV分型檢查、TCT篩查診斷宮頸癌的敏感性與特異性分別為86.96%、79.69%，ROC曲線AUC顯著增大，這說明外周血TAP能從細(xì)胞學(xué)、病毒學(xué)而外的角度窺探宮頸上皮細(xì)胞癌變情況，因此有較好的補(bǔ)充效果，有助于提高診斷效能，且該指標(biāo)作為相較于血清腫瘤標(biāo)志物更便于檢測，能在基層醫(yī)院推廣普及。許剛等[18]在宮頸癌同步放化療前后檢測外周血TAP也獲得相似結(jié)論，發(fā)現(xiàn)其水平與患者療效及預(yù)后密切相關(guān)，治療后TAP陽性率下降，而TAP陽性患者生存時(shí)間也顯著較短。

綜上所述，外周血TAP可對HPV、TCT宮頸癌篩查項(xiàng)目診斷信息作出補(bǔ)充，聯(lián)合應(yīng)用具有較高診斷效能，可避免誤診與漏診，有較高臨床應(yīng)用價(jià)值。