(1 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胸外科，山東 濟(jì)南 250012； 2 山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科；3 珠海圣美生物診斷技術(shù)有限公司、粵港澳液態(tài)活檢聯(lián)合研究中心； 4 青島大學(xué)附屬醫(yī)院小兒外科，山東省數(shù)字醫(yī)學(xué)與計(jì)算機(jī)輔助手術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 5 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科)

白春學(xué)教授，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院主任醫(yī)師、博士生和博士后導(dǎo)師，上海市領(lǐng)軍人才，上海市呼吸內(nèi)科臨床質(zhì)控中心主任，上海市“重中之重”臨床重點(diǎn)學(xué)科呼吸內(nèi)科負(fù)責(zé)人，上海市青浦云加端物聯(lián)網(wǎng)醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室主任，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)臨床重點(diǎn)?？坪粑鼉?nèi)科負(fù)責(zé)人，上海市呼吸病研究所所長(zhǎng)，復(fù)旦大學(xué)呼吸病研究所所長(zhǎng)，復(fù)旦大學(xué)新農(nóng)村研究院智慧醫(yī)療研究所所長(zhǎng)，中國(guó)肺癌防治聯(lián)盟主席，智惠大健康聯(lián)盟創(chuàng)立主席，上海市控?zé)焻f(xié)會(huì)會(huì)長(zhǎng)，中國(guó)非公醫(yī)協(xié)會(huì)物聯(lián)網(wǎng)醫(yī)療分會(huì)會(huì)長(zhǎng)，亞太呼吸學(xué)會(huì)Treasuer主要領(lǐng)導(dǎo)人，ATS胸部腫瘤學(xué)委員和科委會(huì)委員，《Clinical e-Health》雜志主編。先后獲國(guó)家自然科學(xué)基金重大、重點(diǎn)等48項(xiàng)科研課題。主編《現(xiàn)代呼吸病學(xué)》、《早期肺癌》和《物聯(lián)網(wǎng)醫(yī)學(xué)》等專著10部，獲專利46項(xiàng)，牽頭制定國(guó)內(nèi)外呼吸病指南和共識(shí)22項(xiàng)，發(fā)表論著700余篇。

最新發(fā)布《全球疾病負(fù)擔(dān)研究報(bào)告(The Global Burden of Disease study, GBD)》顯示，2017年全球新發(fā)腫瘤患者約2 450萬(wàn)，其中發(fā)生于氣管、支氣管和肺(TBL)的腫瘤患者約220萬(wàn)，排在第2位[1-2]，2017年TBL腫瘤造成全球190萬(wàn)人死亡，占腫瘤死亡病例的23%[3]。需要注意的是，TBL在中國(guó)為癌癥最高發(fā)器官，中國(guó)每年大約有78萬(wàn)肺癌新發(fā)患者，每5個(gè)惡性腫瘤死亡患者中大約有1個(gè)是肺癌患者[2]。

在肺癌早期階段，患者一般無(wú)明顯癥狀，目前由于缺乏早期診斷肺癌的有效方法，肺癌患者的早期確診率只有約10%～15%[4]。若肺癌能在早期得到確診，及時(shí)通過(guò)外科手術(shù)或非外科手段(如立體定向體部放射治療)等進(jìn)行干預(yù)，不僅增加了患者的長(zhǎng)期生存機(jī)率，甚至有希望得到治愈。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅰ期肺癌患者在發(fā)現(xiàn)惡性結(jié)節(jié)后1個(gè)月內(nèi)接受手術(shù)切除或其他治療，其10年生存率可高達(dá)92%[4-5]。因此，早期診斷、早期治療是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵。

美國(guó)國(guó)家肺癌篩查試驗(yàn)(NLST)的隨機(jī)對(duì)照研究結(jié)果顯示，與X線胸片相比，低劑量螺旋電子計(jì)算機(jī)斷層掃描(LDCT)檢查約可降低20%的肺癌死亡率，基于此項(xiàng)研究結(jié)果，LDCT被推薦可以用于高危人群的肺癌篩查[5]。但該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)LDCT檢查的假陽(yáng)性率可以高達(dá)96.4%[5]，為明確大量被LDCT篩查出患者的肺結(jié)節(jié)性質(zhì)，臨床上纖維支氣管鏡檢、穿刺活檢等侵入性、有創(chuàng)性臨床診療操作明顯增加，而在穿刺活檢的肺結(jié)節(jié)中，約有1/3為良性[3]。同時(shí)，穿刺活檢等可能對(duì)患者造成心理負(fù)擔(dān)，并可能導(dǎo)致氣胸、出血、肺功能受損等并發(fā)癥[1-3，6]，使得臨床亟需一種簡(jiǎn)便、安全、有效、無(wú)創(chuàng)的輔助診斷工具，并與影像學(xué)檢查等協(xié)同評(píng)估肺結(jié)節(jié)的良惡性，從而優(yōu)化與完善肺結(jié)節(jié)診療策略。隨著液體活檢技術(shù)的不斷迭代發(fā)展，及其在臨床上的不斷應(yīng)用，越來(lái)越顯示出循環(huán)染色體異常細(xì)胞(CAC)、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)技術(shù)在肺癌早期診斷中的重要性。本文擬對(duì)CAC、CTC在臨床應(yīng)用中的進(jìn)展與挑戰(zhàn)展開(kāi)述評(píng)。

1 液體活檢技術(shù)與CTC

組織活檢作為腫瘤診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在臨床實(shí)踐中存在一定局限性，如體現(xiàn)在組織活檢具有滯后性、部分患者因自身?xiàng)l件不適合組織活檢、有創(chuàng)組織活檢可加速腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)、已發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤患者組織取樣可能無(wú)法反映患者整體的情況等多個(gè)方面[7]。且肺癌是一種高度異質(zhì)性的腫瘤，同一瘤體的不同位置，腫瘤細(xì)胞分化及其基因型均存在著差異[8]。當(dāng)發(fā)生疾病進(jìn)展、藥物耐藥或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移時(shí)，腫瘤細(xì)胞的亞克隆不斷變化，異質(zhì)性情況更加多元化，組織活檢難以完全覆蓋臨床需求[9]。而液體活檢技術(shù)是一種通過(guò)血液、尿液、痰液、胸腹水、腦脊液等體液對(duì)疾病進(jìn)行分析診斷的體外檢測(cè)技術(shù)，與傳統(tǒng)組織活檢相比,液體活檢具備無(wú)創(chuàng)性、可實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)性、可克服腫瘤異質(zhì)性、可提供全面的檢測(cè)信息等的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),能在一定程度上避免組織異質(zhì)性對(duì)腫瘤分子分型的影響，被認(rèn)為是未來(lái)極具潛力的腫瘤早期診斷技術(shù)之一，可以作為組織活檢的有效補(bǔ)充手段。近十年來(lái)，液體活檢技術(shù)發(fā)展迅速，已應(yīng)用在臨床腫瘤診斷以及治療的各個(gè)階段[10-12]。因此在肺癌疾病診斷領(lǐng)域，液體活檢技術(shù)也是一種重要的診斷技術(shù)，主要包括自身抗體[13]、補(bǔ)體片段[14]、循環(huán)RNA[15]、循環(huán)腫瘤DNA[16-17]、CTC[18-19]、CAC[4]及外泌體[20]等各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。各指標(biāo)對(duì)肺癌的診斷效能見(jiàn)表1。

表1 不同指標(biāo)對(duì)肺癌的診斷效能

其中，CTC的研究及其臨床應(yīng)用發(fā)展最為迅猛，CTC是指在實(shí)體腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，有少量細(xì)胞從原生腫瘤脫離進(jìn)入血液，隨血液循環(huán)到達(dá)新的定植器官，是腫瘤組織在外周血中最具有同源性的檢測(cè)指標(biāo)[23]。腫瘤原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的腫瘤細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)遷移、侵襲或受外部因素影響導(dǎo)致脫落而進(jìn)入循環(huán)血液中，這個(gè)轉(zhuǎn)移過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的存活需要適應(yīng)微環(huán)境，伺機(jī)完成遠(yuǎn)端種植轉(zhuǎn)移，而組織微環(huán)境對(duì)于CTC轉(zhuǎn)移及生長(zhǎng)至關(guān)重要，已經(jīng)證實(shí)腫瘤早期階段就可在患者淋巴結(jié)、外周血、骨髓等區(qū)域檢測(cè)到CTC[24-27]。

脫落的腫瘤細(xì)胞，為能夠進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)并發(fā)生轉(zhuǎn)移，會(huì)發(fā)生一些細(xì)胞生物特性的轉(zhuǎn)變?；啄さ仁亲柚鼓[瘤細(xì)胞滲透和轉(zhuǎn)移的物理屏障，因此腫瘤細(xì)胞必須克服這種障礙，通過(guò)上皮間質(zhì)化(EMT)或非EMT介導(dǎo)的活性機(jī)制，調(diào)低上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)表達(dá)等，獲得穿透基底膜的能力進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在到達(dá)轉(zhuǎn)移器官毛細(xì)血管后，CTC會(huì)通過(guò)間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)等方式穿過(guò)血管上皮細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端器官的轉(zhuǎn)移[25-26，28]。

目前，CTC可以通過(guò)CELLSEARCH[29-31]以及ISET[32]等平臺(tái)進(jìn)行捕獲和檢測(cè)，其中陽(yáng)性富集技術(shù)主要采用EpCAM與免疫磁珠相結(jié)合的方式來(lái)富集和分離CTC[11]。然而，這類技術(shù)同時(shí)受到CTC上EpCAM表達(dá)異質(zhì)性的限制，因?yàn)榇蟛糠諧TC從原發(fā)灶脫落或轉(zhuǎn)移過(guò)程中都會(huì)發(fā)生EMT，失去了EpCAM表達(dá)，導(dǎo)致這類CTC無(wú)法被識(shí)別或者被捕獲[32]。另一種陰性富集技術(shù)也稱為白細(xì)胞去除法,用特異性抗體CD45、CD14等與白細(xì)胞結(jié)合，可在磁場(chǎng)作用下去除白細(xì)胞，從而使得CTC被沉淀和富集[11]。CHEN等[18]采用陰性富集技術(shù)在肺癌、肺部良性結(jié)節(jié)患者和健康受試者中進(jìn)行CTC檢測(cè)，其中肺癌或肺部良性結(jié)節(jié)患者中CTC陽(yáng)性率大約為84.0%，而健康人中僅4.2%。同時(shí)多項(xiàng)研究也證實(shí)CTC與腫瘤原發(fā)灶之間的基因組具有一定的相似性[32-33]，提示可以在基因組層面對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和檢測(cè)。

2 CTC與肺癌早期診斷

雖然LDCT在肺癌早期篩查中發(fā)揮了重要作用，但受限于高假陽(yáng)性率和肺結(jié)節(jié)鑒別診斷等問(wèn)題，未能完全滿足臨床需求，而自身抗體、循環(huán)RNA等檢測(cè)手段，也還未能對(duì)肺癌和肺結(jié)節(jié)良惡性進(jìn)行獨(dú)立與有效地診斷。研究發(fā)現(xiàn)CTC在腫瘤形成早期就存在于血液中，預(yù)示CTC在肺癌早期診斷方面可能是一個(gè)重要指標(biāo)與突破口[34]。LLIE等[35]以肺癌高危人群為研究對(duì)象，納入168例COPD患者為研究組，42例吸煙者和35例非吸煙者為對(duì)照組，所有入組者均經(jīng)CT檢查未發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)，外周血CTC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，研究組中5例患者CTC陽(yáng)性，而對(duì)照組中均未檢出CTC；隨后對(duì)研究組中CTC陽(yáng)性與陰性的COPD患者每年進(jìn)行LDCT隨訪，發(fā)現(xiàn)在4年隨訪過(guò)程中，CTC陽(yáng)性的5例COPD患者CT檢查陸續(xù)檢出肺部結(jié)節(jié)，手術(shù)切除標(biāo)本病理診斷為ⅠA期肺癌，在手術(shù)切除肺部腫瘤病灶隨訪1年后發(fā)現(xiàn)，CTC檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性，而CTC陰性的COPD患者均未發(fā)現(xiàn)肺部結(jié)節(jié)。這項(xiàng)研究很大程度上證實(shí)了CTC與肺結(jié)節(jié)、肺癌的相關(guān)性，CTC發(fā)現(xiàn)肺部病變可能會(huì)更早于影像學(xué)檢查1～4年，具有肺癌早期診斷的臨床價(jià)值。

在另一項(xiàng)早期肺癌的CTC研究中，18例Ⅰ期肺腺癌患者CTC檢測(cè)診斷的靈敏度為94%，而在健康對(duì)照組中未檢出CTC[36]，提示CTC對(duì)早期腫瘤有很高的診斷價(jià)值。CTC與其他診斷技術(shù)的相互補(bǔ)充，也有助于CTC檢測(cè)對(duì)肺癌的早期診斷。在對(duì)80例Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者和25例肺部良性病變患者進(jìn)行CTC與PET-CT聯(lián)合檢測(cè)的研究中發(fā)現(xiàn)，與單純依靠臨床信息或PET-CT比較，CTC、臨床信息及PET-CT三者相結(jié)合能顯著提高肺癌的診斷效能，曲線下面積(AUC)由0.77提高至0.87，說(shuō)明CTC聯(lián)合臨床信息或影像學(xué)技術(shù)，有助于肺癌的早期準(zhǔn)確診斷[37]。

但是不同的CTC研究結(jié)果也顯示出較大的差異，并且CTC數(shù)量與肺癌分期的關(guān)聯(lián)性在不同研究中也存在爭(zhēng)議，有研究認(rèn)為CTC數(shù)量隨臨床分期進(jìn)展而增多[38]，也有研究認(rèn)為CTC在不同分期沒(méi)有數(shù)量差異[39]，可能與研究樣本量較小、平臺(tái)不同或檢測(cè)方法不同等有關(guān)，而目前還沒(méi)有針對(duì)肺癌CTC的分離富集標(biāo)準(zhǔn)，所以尋找一種更加靈敏和準(zhǔn)確的CTC檢測(cè)方法，對(duì)其在肺癌早期診斷方面的臨床應(yīng)用十分重要。

3 CAC與肺癌早期診斷

通過(guò)CTC技術(shù)進(jìn)行肺癌的早期診斷，必須要突破其對(duì)上皮細(xì)胞標(biāo)記物(EpCAM等)的依賴，同時(shí)將CTC與血液中的白細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)[40]。2010年美國(guó)安德森癌癥中心病理學(xué)教授KATZ等[41]在肺鱗狀細(xì)胞癌和腺癌的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中發(fā)現(xiàn)多個(gè)共同缺失或擴(kuò)增基因，開(kāi)發(fā)出一種基于四色熒光原位雜交(FISH)技術(shù)來(lái)識(shí)別細(xì)胞基因組中3號(hào)染色體(3p22.1和3q29)與10號(hào)染色體(10q22.3和CEP10)的遺傳學(xué)變化，并將這類具有相同染色體位點(diǎn)突變的PBMC命名為CAC，該研究結(jié)果還顯示CAC可與LDCT聯(lián)合輔助鑒別診斷良惡性肺結(jié)節(jié)，以提高診斷準(zhǔn)確率，減少不必要的有創(chuàng)性病理組織檢查。

2020年4月，KATZ等[4]又進(jìn)一步公布了基于FISH的CAC檢測(cè)技術(shù)的肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別的臨床研究成果，評(píng)估了CAC在肺結(jié)節(jié)患者外周血中的分布特征和輔助診斷價(jià)值。研究組納入的107例肺癌受試者均來(lái)自美國(guó)安德森癌癥中心，入組者滿足以下條件:①近期無(wú)其他臟器腫瘤史；②經(jīng)過(guò)針芯穿刺活檢、細(xì)針抽吸活檢、手術(shù)切除等確診為肺癌患者。對(duì)照組納入了100例基于年齡、吸煙史而定義為肺癌高危人群和自述無(wú)肺癌者，由以下3部分組成：①來(lái)自Kelsey-Seybold Clinics肺癌分子流行病學(xué)研究的受試者26例；②根據(jù)年齡、吸煙、腫瘤家族史劃分為肺癌高危人群，并擔(dān)心自己罹患肺癌(無(wú)腫瘤史)的受試者54例；③LDCT檢查顯示肺結(jié)節(jié)大于6 mm而穿刺活檢病理學(xué)結(jié)果為良性的受試者20例。將2007年11月-2016年3月收集的118例患者定義為開(kāi)發(fā)集，隨后收集的89例患者定義為測(cè)試集。研究利用Ficoll-hypaque密度梯度離心法富集受試者外周血液樣本中PBM，并使用4種不同顏色的FISH探針(3p22.1、3q29、10q22.3、CEP10)雜交PBMC(濃度調(diào)整為100μL中含40 000個(gè)PBMC)，對(duì)細(xì)胞染色體異常情況進(jìn)行分析。研究結(jié)果顯示，研究組肺癌患者的CAC中位數(shù)顯著高于對(duì)照組。CAC計(jì)數(shù)≥3設(shè)定為cut off值，以確定陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)與組織病理結(jié)果進(jìn)行對(duì)照，開(kāi)發(fā)集、測(cè)試集以及受試者整體的CAC診斷靈敏度分別為95.1%、80.0%和88.8%，特異度均為100%，開(kāi)發(fā)集、測(cè)試集和受試者整體的CAC診斷準(zhǔn)確率分別為97.5%、89.9%和94.2%，AUC分別為0.993 5、0.997 0和0.986 5，分析受試者隨訪數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CAC數(shù)量與腫瘤復(fù)發(fā)和總體生存時(shí)間縮短之間存在正相關(guān)的關(guān)系。此外，在107例肺癌受試者中早期肺癌占61%，包括Ⅰ期55例、Ⅱ期10例，病理類型包括腺癌65例，鱗狀細(xì)胞癌20例，其他癌種22例，驗(yàn)證了CAC檢測(cè)技術(shù)能有效鑒別包括不同病理類型的早期肺癌與良性肺部結(jié)節(jié)性病變。

相關(guān)研究結(jié)果顯示，基于FISH檢測(cè)技術(shù)檢出的CAC數(shù)量顯著高于其他相似研究中報(bào)告的CTC的數(shù)量[4、12、30、42-46]，對(duì)血液中腫瘤特異稀有細(xì)胞檢測(cè)具有較高的靈敏度。這種針對(duì)細(xì)胞染色體檢測(cè)的技術(shù)是細(xì)胞病理學(xué)在臨床運(yùn)用中的一個(gè)重大突破，不僅可以作為傳統(tǒng)組織病理檢測(cè)的補(bǔ)充，還能用于其他非血液類樣本的分析，如痰液、肺泡灌洗液等。在無(wú)創(chuàng)技術(shù)和取樣簡(jiǎn)單背景下，CAC作為新的精準(zhǔn)診斷指標(biāo)，是細(xì)胞病理學(xué)領(lǐng)域又一充滿希望的研究方向。同時(shí)，在中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心(http://www.chictr.org.cn/)檢索到一項(xiàng)正在進(jìn)行中的，由復(fù)旦大學(xué)附屬上海中山醫(yī)院牽頭發(fā)起的“BAI-DX & MDA TEST肺結(jié)節(jié)良惡性輔助診斷中國(guó)多中心臨床研究”(ChiCTR1900026233)，計(jì)劃入組1 400余例肺結(jié)節(jié)受試者，利用CAC檢測(cè)技術(shù)與影像學(xué)人工智能(AI)分析技術(shù)相結(jié)合對(duì)肺結(jié)節(jié)良惡性進(jìn)行診斷，這一前瞻性研究與其他研究不同，該研究入組人群限定在肺部結(jié)節(jié)<30 mm，排除了中晚期肺癌人群，符合輔助診斷技術(shù)在肺結(jié)節(jié)診療的臨床應(yīng)用場(chǎng)景。我們期待由CAC、影像學(xué)、腫瘤標(biāo)記物、AI分析多種技術(shù)相結(jié)合建立的更精準(zhǔn)的肺癌早期診斷工具與模型，以真正實(shí)現(xiàn)肺癌的早期診斷、早期治療，從而處長(zhǎng)病人生存期。

綜上所述，由于腫瘤組織的難獲取性，且往往不能多次獲取，操作難度大和有創(chuàng)傷性等原因，液體活檢有望成為腫瘤精準(zhǔn)診療的重要組成部分，而CAC作為液體活檢創(chuàng)新技術(shù)中一項(xiàng)新的指標(biāo)，已在肺結(jié)節(jié)良惡性輔助診斷和肺癌早期診斷方面得到初步驗(yàn)證與應(yīng)用。腫瘤早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是臨床與科研人員重要的研究課題，隨著CAC、物聯(lián)網(wǎng)、影像AI分析、基因組學(xué)等技術(shù)的運(yùn)用與整合，必將進(jìn)一步推進(jìn)臨床真正實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷、早期治療。