(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院特種醫(yī)學(xué)系，山東 青島 266071； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院放射科；3 青島大學(xué)外科實驗中心； 4 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部； 5 即墨市人民醫(yī)院骨科)

骨肉瘤是一種惡性程度非常高的骨腫瘤[1]，多發(fā)于13～19歲的青少年，男性多于女性。臨床主要以手術(shù)切除和放化療等治療為主[2-3]，放化療副作用大，患者依從性差，影響患者預(yù)后。因此，尋找毒副作用小又有效的骨肉瘤治療方法顯得尤為重要。中藥穿心蓮具有清熱燥濕、涼血解毒的功效[4-6]，臨床廣泛應(yīng)用于治療呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及濕疹癰瘡等病癥[7-8]。穿心蓮的主要成分穿心蓮內(nèi)酯(AG)具有抗腫瘤的活性[9-11]，對多種腫瘤均有療效，研究發(fā)現(xiàn)AG能夠通過抑制MMP-7活性從而降低人肺癌A549細胞的侵襲能力[12]；AG可以通過抑制PI3K/Akt信號通路引起人膠質(zhì)瘤U251和U87細胞G2/M期阻滯，從而抑制人膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖能力[13]；AG還可以通過降低CXCL11、CXCR3和CXCR7的表達水平從而降低前列腺癌細胞的增殖和遷移能力[14]。然而，到目前為止關(guān)于AG對骨肉瘤細胞相關(guān)影響的研究報道較少。本研究通過探討AG對人骨肉瘤細胞的殺傷作用及其分子機制,旨在為臨床治療骨肉瘤提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨肉瘤HOS和U2OS細胞系均由青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院特種醫(yī)學(xué)系提供。

1.2 儀器和試劑

RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、McCoy 5A基礎(chǔ)培養(yǎng)基及細胞周期檢測試劑盒均購自美國HyClone公司；AG購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell試劑盒購自美國Corning公司；BCA試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；山羊抗兔二抗購自安徽Biosharp公司；β-actin內(nèi)參一抗購自上海雅酶生物科技有限公司；鞘氨醇激酶1(SphK1)兔單克隆一抗、黏著斑激酶(FAK)兔單克隆一抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。孵箱、流式細胞儀(美國Thermo公司)；酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器廠)。

1.3 研究方法

1.3.1細胞培養(yǎng)及分組 人骨肉瘤HOS和U2OS細胞分別培養(yǎng)于含體積分數(shù)0.10胎牛血清的RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基和McCoy 5A基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含有體積分數(shù)0.05 CO2以及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長達到培養(yǎng)瓶底的80%～90%后，進行傳代培養(yǎng)及其他實驗操作。分別以含有AG為0、5、10、20、50、100 μmol/L(A、B、C、D、E、F組)的培養(yǎng)基培養(yǎng)人骨肉瘤細胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48和72 h后分別于倒置顯微鏡下以細胞計數(shù)板計數(shù)各組細胞數(shù)量，并計算各組的細胞密度以及細胞生存率。細胞生存率=實驗組細胞密度/A組細胞密度×100%；A組細胞生存率設(shè)置為100%。

1.3.2平板克隆實驗觀察細胞增殖能力 選取生長狀態(tài)良好的人骨肉瘤HOS和U2OS細胞，以1.5×104個/孔的密度接種于24孔板中。過夜后，每孔分別加入1 mL含有0、5、10、20、50、100 μmol/L濃度AG(A、B、C、D、E、F組)的培養(yǎng)基。每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)1～2周后，棄培養(yǎng)基，甲醇固定后用體積分數(shù)為0.01的結(jié)晶紫染色液染色15 min。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗去浮色，風(fēng)干后倒置顯微鏡下選取合適視野拍照，計數(shù)各組細胞集落數(shù)。

1.3.3Transwell小室實驗觀察細胞的侵襲和遷移能力 取生長狀態(tài)良好的人骨肉瘤HOS和U2OS細胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板中，貼壁生長過夜后。以2 mL含有0 μmol/L(對照組)和合適濃度(實驗組)的AG培養(yǎng)基對細胞進行預(yù)處理，依據(jù)細胞生存率和細胞集落數(shù)的實驗結(jié)果選擇合適的AG濃度，24 h后收集細胞，于Transwell小室加入500 μL含體積分數(shù)0.20胎牛血清的培養(yǎng)基，上室接種5×104個預(yù)處理后的細胞，鋪基質(zhì)膠(基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基為1∶9)100 μL檢測人骨肉瘤細胞的侵襲能力，不鋪基質(zhì)膠檢測人骨肉瘤細胞的遷移能力。每組設(shè)3個復(fù)孔。24 h后取出上室，棄培養(yǎng)基，棉簽擦凈上室未穿膜細胞，甲醇固定。以體積分數(shù)0.01結(jié)晶紫染色后，PBS洗去浮色，棉簽再次擦凈未穿膜細胞，風(fēng)干，倒置顯微鏡下選取合適視野拍照，計數(shù)各組穿膜細胞數(shù)。對照組細胞的相對侵襲率及相對遷移率設(shè)為1.00，實驗組的相對侵襲率及相對遷移率為實驗組穿膜細胞數(shù)/對照組穿膜細胞數(shù)。

1.3.4流式細胞術(shù)觀察細胞周期分布 取生長狀態(tài)良好人骨肉瘤HOS和U2OS細胞，以1×106個/孔的密度接種于6孔板中，貼壁生長過夜以后，采用無血清培養(yǎng)基同步化以后再次過夜。每孔分別加入2 mL含有0、5、10、20、50、100 μmol/L濃度AG(A、B、C、D、E、F組)的培養(yǎng)基作用24 h。每組設(shè)3個復(fù)孔。收集細胞，冰預(yù)冷PBS清洗1次。離心去上清液，加1 mL PBS重懸。再次離心去上清液后，按細胞周期檢測試劑盒說明書處理沉淀。流式細胞儀檢測細胞周期分布。

1.3.5Western Blot實驗檢測SphK1以及FAK的表達水平 將人骨肉瘤HOS和U2OS細胞用含0 μmol/L(對照組)和合適濃度AG(實驗組)的培養(yǎng)基作用24 h，依據(jù)細胞生存率和細胞集落數(shù)的實驗結(jié)果選擇合適的AG濃度。RIPA裂解液分別提取各組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。配好的蛋白膠凝固后加入等量樣品，將電壓調(diào)至80 V。待樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)到120 V，直至溴酚藍移動至分離膠底部。將目的蛋白膠轉(zhuǎn)至PVDF膜后，加入含體積分數(shù)0.05脫脂奶粉的吐溫20三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜。吸凈一抗，以TBST洗3次后，二抗室溫孵育2 h，吸凈二抗，TBST再次洗3次后，超敏發(fā)光液進行顯影。實驗重復(fù)3次，記錄各組細胞SphK1以及FAK的表達水平。對照組的蛋白相對表達率設(shè)為1.00，實驗組的蛋白相對表達率為實驗組蛋白表達量/對照組蛋白表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 AG對人骨肉瘤細胞生存率的影響

組別、時間以及組別與時間交互作用均對人骨肉瘤HOS以及U2OS細胞的生存率具有明顯的影響(F組別=9 608.52、5 409.49，F(xiàn)時間=8 312.14、352.91，F(xiàn)時間*組別=18.06、3.55，P<0.05)。B～F組組內(nèi)不同時間人骨肉瘤HOS和U2OS細胞的生存率比較，差異具有顯著性(F=47.06～5 098.89，P<0.05)；組間不同時間人骨肉瘤HOS和U2OS細胞的生存率比較，差異均具有顯著意義(F=815.81～5 624.93，P<0.05)。見表1、2。

組別24 h48 h72 hA組100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 B組87.35±1.2980.57±1.3074.15±1.14C組76.81±1.4268.62±1.5844.65±0.86D組67.43±0.6553.59±0.7629.47±0.81E組34.23±0.8827.06±0.4716.44±0.87F組33.65±0.4124.29±0.6314.40±0.55

組別24 h48 h72 hA組100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 B組95.81±1.2290.81±1.2588.75±1.32C組85.01±1.6481.14±2.0476.57±0.71D組77.96±2.3671.37±2.1169.33±1.27E組45.09±1.6841.00±1.6435.33±0.65F組45.29±0.6339.22±1.2133.89±0.61

2.2 AG對人骨肉瘤細胞增殖能力的影響

平板克隆實驗的結(jié)果顯示，A～F組人骨肉瘤HOS細胞的集落數(shù)分別為33.33±2.52、25.00±2.00、21.67±2.08、14.67±2.08、5.67±1.53、6.00±1.00，A～F組人骨肉瘤U2OS細胞的集落數(shù)分別為53.33±1.53、33.67±1.53、26.33±1.53、23.67±1.53、14.67±2.52、13.00±2.65。隨著AG濃度的增高，人骨肉瘤HOS以及U2OS細胞的細胞集落數(shù)逐漸減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(FHOS=97.41，ts=4.44～17.56；FU2OS=174.13，ts=4.62～25.42，P<0.05)。見圖1、2。

2.3 AG對人骨肉瘤細胞侵襲能力的影響

依據(jù)細胞生存率和細胞集落數(shù)的實驗結(jié)果選擇50 μmol/L為合適的AG濃度。Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組和實驗組HOS細胞的相對侵襲率分別為1.00±0.00和0.40±0.03，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=39.06，P<0.05)；對照組以及實驗組U2OS細胞的相對侵襲率則分別為1.00±0.00和0.24±0.02，差異有顯著性(t=78.15，P<0.05)。見圖3。

2.4 AG對人骨肉瘤細胞遷移能力的影響

依據(jù)細胞生存率和細胞集落數(shù)的實驗結(jié)果選擇50 μmol/L為合適的AG濃度。Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組和實驗組HOS細胞的相對遷移率分別為1.00±0.00和0.22±0.02，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=83.74，P<0.05)；對照組和實驗組U2OS細胞的相對遷移率分別為1.00±0.00和0.14±0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=135.96，P<0.05)。見圖4。

2.5 AG對人骨肉瘤細胞細胞周期分布的影響

組別、周期及組別與周期交互作用均對人骨肉瘤HOS以及U2OS細胞的細胞周期分布具有明顯影響(F組別=35.05、8.24，F(xiàn)周期=3 211.19、192.49，F(xiàn)周期*組別=75.96、140.97，P<0.05)。A～F組組內(nèi)人骨肉瘤HOS和U2OS細胞的周期分布比較，差異有顯著性(F=22.07～1 472.60，P<0.05)；組間人骨肉瘤HOS和U2OS細胞的周期分布比較，差異有顯著性(F=16.55～261.67，P<0.05)。見表3、4。

2.6 AG對SphK1和FAK表達水平的影響

依據(jù)細胞生存率和細胞集落數(shù)的實驗結(jié)果選擇50 μmol/L作為合適的AG濃度。Western Blot實驗結(jié)果顯示，對照組和試驗組人骨肉瘤HOS細胞SphK1的相對表達水平分別為1.00±0.00和0.81±0.02，F(xiàn)AK的相對表達水平分別為1.00±0.00以及0.14±0.02，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.94、75.22，P<0.05)；對照組和試驗組人骨肉瘤U2OS細胞SphK1的相對表達水平分別為1.00±0.00和0.83±0.02，F(xiàn)AK的相對表達水平分別為1.00±0.00和0.21±0.01，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.39、95.79，P<0.05)。見圖5。

A～F分別為A～F組，4倍

A～F分別為A～F組，4倍

A～B分別為對照組和實驗組人骨肉瘤HOS細胞的遷移能力；C～D分別為對照組和實驗組人骨肉瘤U2OS細胞的遷移能力，10倍

組別G1期S期G2期A組35.90±0.3131.00±0.6725.93±0.56B組42.54±1.1730.21±0.6520.50±0.49C組40.96±0.5835.99±0.3917.63±0.70D組49.53±0.6725.81±0.9719.74±0.37E組47.62±0.7228.33±1.0018.18±0.77F組55.35±1.6929.82±1.1111.40±1.12

組別G1期S期G2期A組18.56±1.1647.17±1.1830.81±1.11B組34.53±0.8438.47±0.8926.69±1.62C組30.53±0.7338.65±0.9027.31±0.39D組39.14±1.2932.15±1.3927.09±1.00E組44.09±0.8928.38±0.3426.21±1.08F組36.32±0.5130.59±0.7232.52±1.05

圖5 AG對人骨肉瘤細胞中SphK1和FAK表達水平的影響

3 討 論

骨肉瘤是一種惡性程度很高的原發(fā)性骨腫瘤，具有惡性程度高、轉(zhuǎn)移早、發(fā)展快、預(yù)后差的特點，臨床主要的治療方法有手術(shù)、化療、放療、基因療法及免疫療法等[15-17]。然而現(xiàn)階段骨肉瘤臨床治療中仍然存在很多亟待解決的問題，如化療后不良反應(yīng)嚴重[18]、骨肉瘤對放療的敏感性差、復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性骨腫瘤缺乏有效靶向治療藥物等[19]。因此尋找新的安全有效的骨肉瘤治療方法尤為必要。

中藥在臨床中應(yīng)用廣泛而且效用獨特[20-21]，很多中藥具有良好的抗腫瘤活性，因而越來越受到人們的關(guān)注。穿心蓮作為一種臨床常用藥物，除了具有傳統(tǒng)的清熱解毒、涼血、消腫、燥濕功效外，其主要成分AG還具有良好的抗腫瘤活性，對多種腫瘤治療有效[22-23]。然而AG對骨肉瘤影響的研究較少，僅發(fā)現(xiàn)AG能通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路和增強JNK信號通路來誘導(dǎo)人骨肉瘤細胞自噬，但對人骨肉瘤細胞的凋亡無明顯影響[24]。

本研究首先以不同濃度AG分別處理人骨肉瘤HOS和U2OS細胞24、48、72 h，結(jié)果顯示，與A組相比，各實驗組人骨肉瘤細胞的生存率降低，并呈濃度和時間依賴性，提示AG對人骨肉瘤細胞具有殺傷作用；再進一步從AG對人骨肉瘤細胞增殖、侵襲、遷移以及細胞周期分布的影響幾個方面，探討AG對人骨肉瘤細胞的作用機制。平板克隆實驗結(jié)果顯示，AG能夠抑制人骨肉瘤細胞的增殖；Transwell實驗結(jié)果表明，AG能夠降低人骨肉瘤細胞的侵襲和遷移能力；流式細胞術(shù)結(jié)果表明，AG能夠增加人骨肉瘤細胞G1期的構(gòu)成比。

鞘脂代謝作為人體中一種重要的脂類代謝途徑，在腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用[25-28]，已成為近年來研究的新熱點。SphK1是鞘脂代謝的重要調(diào)節(jié)酶。鞘脂在SphK1的作用下生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)，S1P作用于不同的S1P受體引起多種生物學(xué)效應(yīng)。國內(nèi)外大量研究表明，鞘脂代謝能夠影響腫瘤的多種生物學(xué)性狀，比如增殖、侵襲、遷移等，且在腫瘤細胞中SphK1過表達[25]，也有研究表明鞘脂代謝和骨肉瘤之間存在一定的關(guān)系[29-30]。但尚無AG對鞘脂代謝影響的相關(guān)報道。此外，近年來有研究表明SphK1能夠通過影響FAK來影響腫瘤的侵襲和遷移能力[31]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，實驗組SphK1以及FAK的表達水平下調(diào)，提示AG影響了鞘脂代謝，可能通過影響SphK1信號通路，影響人骨肉瘤細胞的生物學(xué)性狀。

本研究較為全面地探究了AG對人骨肉瘤細胞的影響，結(jié)果表明其可能是骨肉瘤治療潛在的藥物，并且首次探討了AG與鞘脂代謝的關(guān)系，初步表明AG可以影響SphK1信號通路，進而可能會由此影響到人骨肉瘤細胞的生物學(xué)性狀，包括增殖、侵襲和遷移等，從而為骨肉瘤的治療提供了新的理論依據(jù)。但AG對骨肉瘤的具體療效還需要進一步研究確認，而且其對SphK1信號通路的具體影響機制也是下一步研究的重點。