潘海龍 何興強(qiáng)2 成婭 李棟 齊元杰 姚來(lái)昱 沃金善

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山東 青島 266003； 2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科)

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種以動(dòng)脈血管內(nèi)壁脂質(zhì)堆積、慢性炎癥反應(yīng)、細(xì)胞死亡和纖維化等為病理特征的常見(jiàn)疾病，嚴(yán)重危害著人類(lèi)的健康[1-4]。大量研究證明，強(qiáng)化調(diào)脂可以顯著降低血管壁的炎癥反應(yīng)、延緩AS的病程，甚至能夠逆轉(zhuǎn)其進(jìn)展。但強(qiáng)化調(diào)脂治療患者依從性差，其帶來(lái)的嚴(yán)重的副作用如肌溶解、嚴(yán)重肝功能損害等亦不能忽視。目前已有研究表明一些中藥提取物能夠顯著降低血脂以及抑制血管壁炎癥反應(yīng)，在抗AS方面可能發(fā)揮著重要作用[5-7]。因此，以現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的方法探尋中醫(yī)藥抗AS的作用及機(jī)制有著廣闊的前景。姜黃素是姜科植物姜黃的主要成分，現(xiàn)有的研究表明，其毒副作用及不良反應(yīng)較小，且具有廣泛的抗纖維化、抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，目前已被應(yīng)用于多種疾病的臨床和基礎(chǔ)研究[8-10]。但目前姜黃素抗AS的具體作用及機(jī)制尚不明確。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要的細(xì)胞信號(hào)通路之一，在調(diào)控細(xì)胞增殖、發(fā)育、代謝等方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路激活能夠促進(jìn)多種炎癥因子的表達(dá)及AS的發(fā)生[11-13]。因此，本研究旨在探討姜黃素對(duì)AS模型大鼠AS的作用及對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，為AS的治療提供新的選擇及理論依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

健康雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量(200±20) g，購(gòu)于青島康大生物科技有限公司，合格證號(hào)：SCXK(魯)20160002。姜黃素購(gòu)自西安圣青生物科技有限公司，辛伐他汀片購(gòu)自美國(guó)默沙東制藥有限公司。

1.2 主要儀器與試劑

RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Realtime-PCR試劑盒購(gòu)自日本Takara公司。蛋白提取試劑盒、電泳液、轉(zhuǎn)膜液、PVDF膜、SDS-PAGE預(yù)制膠(10%)、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、抗體稀釋液、HE染色試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，GAPDH、PI3K、Akt一抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，二抗購(gòu)自日本Abcam公司。大鼠TG、LDL、TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。Realtime-PCR儀、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組及動(dòng)物模型制備SD大鼠隨機(jī)均分為空白對(duì)照組(K組)，AS模型對(duì)照組(M組)、辛伐他汀陽(yáng)性組(Y組)、姜黃素高劑量組(G組)、中劑量組(Z組)和低劑量組(D組)，每組12只大鼠。大鼠標(biāo)記并適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除K組(普通飼料喂養(yǎng))外，其余5組給予高脂飼料喂養(yǎng)12周制備AS模型。造模成功后，進(jìn)行4周藥物干預(yù)治療。K組和M組給予生理鹽水灌胃，Y組給予辛伐他汀(4 mg/kg)灌胃，G、Z、D組分別給予300、200、100 mg/kg姜黃素灌胃，每日1次，共4周。

1.3.2血清血脂及炎性因子的檢測(cè) 藥物干預(yù)完成后，取各組SD大鼠，麻醉后打開(kāi)腹腔，經(jīng)腹主動(dòng)脈抽取動(dòng)脈血5～10 mL，離心后收集上清液。采用ELISA法檢測(cè)各組血清中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)以及低密度脂蛋白(LDL)水平。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.3.3主動(dòng)脈組織的病理學(xué)檢測(cè) 取各組SD大鼠主動(dòng)脈組織，置于40 g/L的多聚甲醛溶液中固定，脫水、包埋，5 μm厚切片，行HE染色，觀察組織病理學(xué)的變化。

1.3.4免疫印跡法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈組織PI3K、Akt蛋白的表達(dá) 取各組SD大鼠主動(dòng)脈組織，提取總蛋白，測(cè)總蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品行凝膠電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜；室溫下，脫脂牛奶封閉1 h后，一抗(GAPDH、PI3K、Akt)孵育2 h，TBST洗滌后二抗孵育1 h，經(jīng)TBST漂洗后采用化學(xué)發(fā)光法顯影成像。采用Quantity One 4.4測(cè)量灰度值計(jì)算PI3K、Akt蛋白表達(dá)量。

1.3.5Realtime-PCR方法檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈組織中PI3K、AktmRNA的表達(dá) 提取各組SD大鼠主動(dòng)脈組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后按照試劑盒說(shuō)明步驟行Realtime-PCR檢測(cè)。采用Gapdh為內(nèi)參照，以2-△△CT法計(jì)算PI3K、AktmRNA的相對(duì)表達(dá)量。PI3K上游引物：5′-AGATCGCTCTGGCCTCATTG-3′,PI3K下游引物：5′-AGCCAGTTCAGAAG-GGCATC-3′；Akt上游引物:5′-TCAA AGAAGTCAAAGGGGCTGC-3′,Akt下游引物:5′-CTCCTTCACAATAGCCACGTC-3′；Gapdh上游引物：5′-TGAAGGTCGGAGTGAACGGATT-3′，Gapdh下游引物：5′-CGCCCTTTTTACCTTGGATAGT-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組血清中IL-6、TNF-α、TC、TG、LDL水平比較

單因素方差分析結(jié)果顯示，6組大鼠血清中 IL-6、TNF-α水平比較差異均具有顯著性(F=56.40、65.40，P<0.01)，兩兩比較結(jié)果顯示除M組與D組的IL-6差異無(wú)顯著性外，其他任意兩組間差異均有顯著性(P<0.05)； 6組血清中TC、TG、LDL水平比較差異有顯著性(F=39.66～54.60，P<0.01)，兩兩比較的結(jié)果顯示除M組與D組、Y組與G 組、G組與Z組TC；M組與D組、G組與Z組TG；K組與Y組、G組與Z組LDL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他任意兩組間差異均有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清中TC、TG、LDL、TNF-α、IL-6水平變化

2.2 大鼠主動(dòng)脈組織病理學(xué)變化

HE染色顯示，K組大鼠主動(dòng)脈組織光滑完整，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；M組大鼠主動(dòng)脈組織內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞、泡沫樣細(xì)胞浸潤(rùn)及明顯增殖的平滑肌細(xì)胞，并出現(xiàn)散在鈣化灶；Y組大鼠主動(dòng)脈組織中炎性細(xì)胞、泡沫樣細(xì)胞顯著減少；與K組相比，G、Z、D組大鼠主動(dòng)脈組織中仍可見(jiàn)炎性細(xì)胞、泡沫樣細(xì)胞浸潤(rùn)及增殖的平滑肌細(xì)胞，但同M組相比上述病理改變均得到了顯著緩解，G、Z組緩解效果較為明顯。

2.3 各組大鼠主動(dòng)脈組織中PI3K、Akt蛋白以及mRNA的表達(dá)

單因素方差分析結(jié)果顯示，6組大鼠主動(dòng)脈組織中PI3K、AktmRNA表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2 930.20、2 874.12，P<0.01)，兩組間比較差異均具有顯著性(P<0.05)；6組大鼠主動(dòng)脈組織中PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=878.68、297.83，P<0.01)，兩組間比較差異均具有顯著性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

組別Akt mRNAAkt蛋白PI3K mRNAPI3K蛋白K組1.28±0.070.97±0.010.98±0.040.76±0.01M組7.63±0.291.61±0.0510.88±0.131.75±0.04Y組2.49±0.080.83±0.011.68±0.111.20±0.01G組3.61±0.111.01±0.042.47±0.121.30±0.07Z組5.47±0.161.05±0.033.40±0.351.50±0.09D組7.30±0.181.35±0.044.92±0.401.57±0.12

3 討 論

研究表明，姜黃素能夠通過(guò)有效調(diào)節(jié)多種生物過(guò)程和通路而發(fā)揮對(duì)相關(guān)疾病的治療作用[14]。在動(dòng)物模型和臨床試驗(yàn)中進(jìn)行的研究表明，即使在高劑量下，姜黃素仍具有很好的安全性，其耐受性和無(wú)毒性也已得到公認(rèn)，并且不會(huì)對(duì)肝和腎功能造成任何不良影響[15-17]。姜黃素具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗增殖、促凋亡、抗損傷、抗寄生蟲(chóng)及抗瘧疾等。研究表明，姜黃素在癌癥、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療中也起到了良好作用[18-19]。

研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)作為AS的核心貫穿于AS的整個(gè)過(guò)程，炎癥細(xì)胞是AS的主要執(zhí)行者，炎癥遞質(zhì)是AS的關(guān)鍵分子。在AS早期，細(xì)胞炎癥因子、急性期反應(yīng)蛋白表達(dá)升高，進(jìn)而造成血管內(nèi)皮功能紊亂、平滑肌增殖及微血管重塑等，最終導(dǎo)致斑塊破裂及血栓形成[20-22]。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞功能異常時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子IL-6以及TNF-α的異常分泌[23-25]。IL-6可通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)及凝血功能，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞不斷增生，從而介導(dǎo)AS斑塊的形成，并進(jìn)一步促使不穩(wěn)定斑塊形成。TNF-α可在內(nèi)皮細(xì)胞作用下，直接參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致大量細(xì)胞受損脫落，加速AS形成和進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，同K組相比，M組血清IL-6及TNF-α表達(dá)水平顯著升高，M組和G、Z、D組血清中IL-6及TNF-α表達(dá)水平均顯著下降，且姜黃素組血清IL-6及TNF-α的表達(dá)水平與姜黃素劑量呈濃度依耐性下降。以上結(jié)果提示姜黃素能夠顯著降低AS組織IL-6和TNF-α的分泌，其過(guò)程可能與其使炎癥反應(yīng)受到抑制有關(guān)。有研究認(rèn)為脂質(zhì)代謝紊亂與AS發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，LDL等會(huì)導(dǎo)致脂蛋白在血管內(nèi)膜下聚集而形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)而引起血管壁的慢性炎癥反應(yīng)，而泡沫細(xì)胞的凋亡可進(jìn)一步使促炎因子釋放，最終加速AS的進(jìn)展[26]。本研究結(jié)果顯示，同K組相比，M組血清中TC、TG與LDL水平均顯著升高，而在Y組和G、Z、D組明顯下降，且在姜黃素組中以G組下降最明顯。結(jié)果說(shuō)明，姜黃素能夠明顯降低AS模型動(dòng)物血脂水平，提示其有可以作為降脂類(lèi)藥物的有效補(bǔ)充。主動(dòng)脈組織病理結(jié)果提示姜黃素能夠顯著降低AS血管內(nèi)炎性細(xì)胞、泡沫樣細(xì)胞浸潤(rùn)及平滑肌細(xì)胞增殖。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明姜黃素有著很好的控制炎癥及降低血脂作用，可能作為治療AS的有效潛在藥物。

PI3K/Akt信號(hào)通路是AS發(fā)生發(fā)展的重要生物學(xué)通路，并在許多心血管疾病中得到證實(shí)，其可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程。PI3K可被多種信號(hào)分子激活，而導(dǎo)致其下游靶分子Akt磷酸化。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可加速炎癥反應(yīng)和AS的發(fā)展，而抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可改善AS的進(jìn)展[27-29]。本研究結(jié)果顯示，同K組相比，M組主動(dòng)脈組織中的PI3K、Akt蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著升高，Y組表達(dá)顯著下降，G、Z、D組主動(dòng)脈組織中PI3K、Akt蛋白及mRNA水平的表達(dá)均受到明顯抑制，姜黃素組中以G組抑制最為明顯。以上結(jié)果表明，姜黃素能夠顯著抑制AS主動(dòng)脈血管中PI3K、Akt的表達(dá)，可能為姜黃素抗AS的作用機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，姜黃素能夠顯著抑制AS模型大鼠主動(dòng)脈組織中炎癥因子IL-6、TNF-α的生成及降低血清TC、TG及LDL水平，減少主動(dòng)脈炎性浸潤(rùn)及降低脂質(zhì)成分的堆積，顯示出良好的抗AS效果；并且能夠降低PI3K、Akt蛋白以及mRNA的表達(dá)。姜黃素可能是通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路而發(fā)揮抗AS作用，可能作為AS預(yù)防和治療的潛在藥物，但其完整的信號(hào)通路機(jī)制，仍需進(jìn)一步完善研究。