周雪雁， 米瑪普尺， 馬咸瑩， 馬忠仁1,， 丁功濤1,*

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030)

屠宰場廢棄血污不經(jīng)過處理直接排放，會對環(huán)境中土壤和水源造成污染。傳統(tǒng)的處理方法有填埋法、消毒滅菌法和焚燒法。填埋法易造成地表環(huán)境、地下水資源污染。采用消毒液進行消毒滅菌，不能保證消毒滅菌的徹底性，容易對周圍環(huán)境造成二次污染。焚燒法處理也會造成大氣污染，且廢棄物中所含的蛋白資源不能得到有效利用。相比之下，利用微生物降解廢棄血液生產(chǎn)氨基酸液態(tài)肥料，可在保護環(huán)境的同時實現(xiàn)資源的可持續(xù)發(fā)展，提高廢棄蛋白附加值，被認為是畜禽血液綜合利用的一個方向[1]。氨基酸肥料作為一種新型生態(tài)肥料，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中扮演的角色和發(fā)揮的作用將越來越重要[2]，其市場前景看好[3]。本研究以日喀則地區(qū)屠宰場血污堆積土壤為分離基質(zhì)，篩選能夠降解廢棄血液血紅蛋白質(zhì)的細菌，并進行菌株鑒定和蛋白酶活力測定，旨在為屠宰場廢棄血污的處理和資源化利用做出可行性的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗樣品 采集于西藏日喀則地區(qū)屠宰場廢棄血污放置土壤，地理位置為西藏自治區(qū)日喀則市江孜縣英雄路6號(經(jīng)緯度：89°60′E， 28°92′N；海拔：4 000 m左右)。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取粉5 g/L，氯化鈉10 g/L；②牛肉膏蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂15 g/L，3%的血清；③哥倫比亞血平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)：酪蛋白胰酶消化物、玉米淀粉、瓊脂、新胰酶消化物、酵母浸出物、氯化鈉(分析純)、肉胃酶消化物、脫纖維羊血、蒸餾水；④液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米粉40,黃豆餅粉30,Na2HPO44,KH2PO40.3。

1.1.3 試劑 胰化蛋白胨(OXOID),酵母提取粉(OXOID),牛肉膏,蛋白胨,瓊脂粉(青島海博),氯化鈉,NaOH(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠),血清(蘭州民海生物工程有限公司),革蘭染色試劑(博精索拉博科技有限公司),細菌生化鑒定管(杭州微生物試劑有限公司),福林酚試劑(分析純，博精索拉博科技有限公司),三氯乙酸(分析純，博精索拉博科技有限公司),干酪素(阿拉丁工業(yè)公司)。

1.1.4 儀器與設(shè)備 立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS，上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9146A，上海精宏實驗設(shè)備有限公司)，MOST-T蒸汽滅菌器(MOST-T，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)，電子天平(AR224CN，奧豪斯儀器常州有限公司)，立式恒溫振蕩器(IS-ROV1，上海智城分析儀器制造有限公司)，BME顯微鏡(13395H2X，萊卡)，潔凈工作臺(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，高速離心機(Pico17，BioRad)，電泳儀(北京六一儀器設(shè)備)，微波爐(廣東格蘭仕)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集及菌株的分離純化 用無菌離心管收集屠宰場廢棄血液存放地土壤帶回實驗室，取出適量的樣品，用無菌水進行10-4～10-6梯度稀釋，吸取適量土壤懸液涂布于哥倫比亞血平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，挑取透明水解圈最大的菌落進一步劃線接種在血平板上進行純化， 37 ℃培養(yǎng)24 h，純化操作可進行2～3次，將分離純化好的菌株用甘油凍存。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將分離得到的菌株劃線接種于牛肉膏蛋白胨瓊脂或LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、邊緣、隆起、透明度等。挑取少量菌落革蘭染色后鏡檢，在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察菌體細胞的形狀、大小及染色結(jié)果[4]。

1.2.3 生化反應(yīng)試驗鑒定 用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)分離菌株24 h至對數(shù)生長期，將50 μL菌液分別接入糖酵解試驗、硝酸鹽還原、氨基酸水解、枸櫞酸鹽利用、甘露醇利用、衛(wèi)茅醇利用、蛋白胨水解、尿素利用、產(chǎn)硫化氫、淀粉、明膠等生化反應(yīng)管中培養(yǎng)。按生化管中說明情況分別培養(yǎng)至指定時間，取出培養(yǎng)的生化管進行觀察，記錄判定其反應(yīng)結(jié)果，反應(yīng)結(jié)果組成該菌的生化圖譜，用作菌種鑒定[5]。

1.2.4 16S rDNA序列鑒定 制備PCR反應(yīng)模板DNA，取1 mL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 g離心2 min，棄上清液，再加500 μL的 無菌去離子水制成菌懸液，將菌懸液99 ℃加熱10 min，-70 ℃下冷沖擊20 min，循環(huán)3次，循環(huán)結(jié)束的菌液12 000 g離心5 min，取其上清液作為PCR擴增的模板。16S rDNA通用引物為27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×TaqMix 12.5 μL，F(xiàn)引物2 μL，R引物2 μL，無菌去離子水 7 μL，模板1.5 μL，將各組分按以上順序依次加入到PCR反應(yīng)管中，瞬離10 s混勻后，用PCR擴增儀進行擴增反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，1 min，進行30個循環(huán)；最后延伸72 ℃，10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用電泳鑒定，配制1%瓊脂糖膠溶液50 mL，煮沸冷卻2～3 min后加入5 μL核酸染料，搖勻，倒入膠槽后冷卻20～30 min，待膠完全凝好后使用。膠塊制好后取3 μL PCR產(chǎn)物和DL2000 DNAMarker分別在膠孔內(nèi)點祥，120 V，電泳15～20 min。電泳結(jié)束后，取出膠塊在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物在膠塊中的位置，對電泳結(jié)果進行照相和分析，將正確擴增的PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進行測序。將測序結(jié)果序列輸入NCBI進行Nucleotide BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)[6]，并使用MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[7]。

1.2.5 蛋白酶活力測定 福林酚法(Folin試劑法QB747-80)測定分離菌株的產(chǎn)蛋白酶活力[8-9]，首先繪制酶活標準曲線，取不同質(zhì)量濃度(0～100 μg/mL)酪氨酸標準溶液1 mL，各加入5 mL的0.4 mol/L碳酸鈉溶液，1 mL福林(Folin)試劑，于40 ℃下恒溫水浴顯色30 min，分光光度計680 nm波長下比色測定吸光度值(OD值)，用空白管(酪氨酸為0 μg/mL)作對照，以酪氨酸濃度為縱坐標，以吸光度值為橫坐標，繪制標準曲線，求出光密度為1時相當(dāng)?shù)睦野彼豳|(zhì)量(μg)，即為K值。然后將分離菌株接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基37 ℃、200 r/min搖床擴大培養(yǎng)至48 h，過濾去除菌體，濾液中的蛋白酶用(NH4)2SO4沉淀后再經(jīng)透析袋透析獲得粗酶液[10]。將1 mL粗酶液和1 mL底物酪蛋白(20 g/L)在40 ℃條件下保溫精確反應(yīng)10 min，然后立即加入3 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)。靜置15 min，使蛋白質(zhì)沉淀完全，然后用濾紙過濾，濾液應(yīng)清亮，無絮狀物，取上清濾液1 mL加入5 mL 0.4 mol/L碳酸鈉，混勻加入1 mL福林(Folin)試劑，混勻后 40 ℃水浴保溫20 min。分光光度計測定樣品在680 nm波長處的OD值。同時做空白對照(酶液不進行40 ℃水浴保溫反應(yīng))。堿性蛋白酶活力單位U，以每毫升樣品在40 ℃，pH 11條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生的酪氨酸質(zhì)量(μg)來表示，按下式計算酶活力值[8]。

式中，X：樣品的酶活力；K：由標準曲線得出的光密度為1時相當(dāng)?shù)睦野彼豳|(zhì)量(μg)；A：樣品OD值與空白OD值之差；N：樣品的稀釋倍數(shù)；5：測定中吸取的濾液是全部濾液的1/5；10：酶反應(yīng)時間10 min，以1 min計。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

將篩選得到的菌種平板劃線接種至血平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分離純化后菌株的菌落形態(tài)為圓形、黏稠、濕潤、白色，直徑為2.8～3.5 mm，透明水解圈的大小約4.0 mm。在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的菌落表面粗糙皺褶，邊緣不整齊擴展，白色，不透明，粘著，24 h后菌落直徑約為3 mm。

2.2 革蘭染色

經(jīng)革蘭染色，分離菌株為桿狀菌，菌體細胞呈藍紫色，鑒定革蘭陽性菌(圖1)。

圖1 分離菌株革蘭染色結(jié)果Fig.1 Gram staining result of the isolate

2.3 生化反應(yīng)試驗

分離菌株生化反應(yīng)特性鑒定結(jié)果(表1)顯示，分離菌株不發(fā)酵乳糖、葡萄糖，V-P試驗陽性，枸櫞酸鹽利用，淀粉水解，明膠液化，可產(chǎn)生DNA酶，不產(chǎn)硫化氫，不還原硝酸鹽。根據(jù)芽胞桿菌生化譜進行分類，分離菌株為地衣芽胞桿菌。

表1 分離菌株生化反應(yīng)試驗結(jié)果

注：“+”：生化反應(yīng)結(jié)果為陽性；“-”：生化反應(yīng)結(jié)果為陰性

2.4 16S rDNA序列鑒定

2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳 電泳結(jié)果(圖2)表明分離菌株NwMCC01910042的16S rDNA序列PCR擴增產(chǎn)物條帶約為1 500 bp，最左邊為DNA Marker。

2.4.2 菌株的16S rDNA序列分析 將得到的16S rDNA序列(1 420 bp)與NCBI已提交的序列進行Nucleotide BLAST比對。結(jié)果顯示NwMCC0-1910042與BacilluslicheniformisATCC 14580株的序列相似性為99.79%，與BacilluslicheniformisMSL3076株的序列相似性為99.30%。將分離株菌的16S rDNA核酸序列和BLAST結(jié)果中的序列通過軟件MEGA7.0進行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。NwMCC01910042與地衣芽胞桿菌位于同一個分支上，同源性高達99%以上，具有較近的遺傳距離，鑒定為地衣芽胞桿菌。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product

圖3 基于16S rDNA基因序列建立的NwMCC01910042菌株系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of NwMCC01910042 strain based on 16S rDNA gene sequence

2.5 蛋白酶活力的測定

由酪氨酸標準曲線(圖4)得到的K值為101.23。獲得NwMCC01910042菌株粗酶液的蛋白酶活力為188.43 U/mL。

圖4 酪氨酸標準曲線Fig.4 Standard curve of tyrosine

3 討 論

利用微生物降解生產(chǎn)氨基酸有機肥的關(guān)鍵是篩選蛋白酶高產(chǎn)菌株。近年來，蛋白質(zhì)分解功能菌株的收集工作取得了一定的成果，但功能菌株的轉(zhuǎn)化利用研究不足。張濱等[11]從多年被廢棄畜禽血液浸染的土壤中分離到1株蠟狀芽胞桿菌(B.cereusLact5.Ⅲ)，其蛋白質(zhì)水解圈比值較大，其在血紅蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，所測定的蛋白酶活力達到483.81 U/mL。陶艷華等[12]從南京某屠宰場下水道中分離到1株短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)，其具有較強降解血紅蛋白的能力，在血紅蛋白發(fā)酵培養(yǎng)基中降解率達53.64%。李浩麗等[13]從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)附近菜市場新鮮豬血中分離到1株芽胞桿菌(BacilluspumilusCN8)，福林(Folin)法測定酶活為150.86 U/mL。Kong等[14]從腐敗蠶蛹中篩選得到1株產(chǎn)中性蛋白酶的細菌，在pH值8.0、溫度55 ℃處理0～30 min時的酶活較穩(wěn)定，獲得了1株能夠高效分解蠶蛹蛋白的菌株。程宇等[15]在特定土壤中分離得到1株能夠有效分解動物蹄角蛋白的菌株，該菌株對蹄角蛋白的分解率可以達到45.35%。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鑒定該菌為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)。陳興等[16]利用酪蛋白培養(yǎng)基，對醇化煙葉上分離到的細菌進行了定向篩選，得到了降解蛋白質(zhì)能力較強的菌株(PE1)，其蛋白酶活性達到156.25 U/mL。龐偉[17]研究了3株不同的枯草芽胞桿菌，選用H/C值(菌落透明圈和菌落直徑比值)較大和產(chǎn)酶能力較強的B3菌株作為優(yōu)良菌株，以豬血粉為原料進行發(fā)酵，發(fā)酵后豬血粉的蛋白質(zhì)含量下降了24.05%，氨基態(tài)氮含量增加了4.44倍，可溶蛋白含量增加了53.77%。為了將本研究的分離菌株有效地應(yīng)用于氨基酸液體肥生產(chǎn)實踐，項目后續(xù)將開展NwMCC01910042菌株對血污血紅蛋白降解特性及降解產(chǎn)物氨基酸分析以及降解工藝優(yōu)化實驗[18-20]。從生物安全性要求方面，分離菌株的抗菌藥物敏感試驗性及毒性試驗也需要進一步確定。

利用廢棄血污蛋白物制備氨基酸有機肥料，不僅可以提高蛋白廢棄物的經(jīng)濟價值，還可以減少環(huán)境污染，實現(xiàn)廢棄資源的再利用。同時，氨基酸肥料作為一種新型的生態(tài)肥料，其使用范圍也將會越來越廣[21]。近年來有一些報道是以廢棄蛋白為原料采用鹽酸、硫酸或者燒堿水解的工藝來制備氨基酸液體肥，這種方法生產(chǎn)成本低，工藝較簡單，但利用微生物降解工藝來生產(chǎn)氨基酸有機肥的工藝還不很成熟。劉娜等[22]以廢棄革屑為原料，采用氧化鈣水解革屑提取膠原蛋白，再用硫酸水解膠原蛋白制備微量元素型含氨基酸水溶肥料，最佳水解工藝為水解溫度110 ℃，硫酸用量為膠原蛋白的1.25倍，水解率達到91%，液體中游離氨基酸總量為231 g/L，高出行業(yè)指標131%，制備的微量元素型含氨基酸水溶肥料符合液體產(chǎn)品的技術(shù)指標和重金屬限量要求。但因為使用強酸強堿作為原料，容易對環(huán)境造成污染，國家已經(jīng)嚴格禁止使用。相比之下，微生物降解法具有降解速率快、不易造成污染、反應(yīng)條件溫和，成本低，容易應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中的優(yōu)勢。因此，以動物的血污、毛發(fā)及蹄腳等作為原料，采用微生物降解工藝生產(chǎn)氨基酸液體肥急待進一步研究和開發(fā)利用。