任 婧， 徐愛玲, 宋志文

(青島理工大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東 青島 266033)

當(dāng)前，水體氮素污染日益嚴(yán)重，極大地影響到環(huán)境和人體健康，采用常規(guī)硝化和異養(yǎng)反硝化脫氮工藝通常需要曝氣和外加有機(jī)碳源，并且產(chǎn)泥量多。厭氧氨氧化(Anaerobic Ammonium Oxidation, ANAMMOX)是新興的高效生物脫氮技術(shù)，對(duì)于填埋廠滲濾液、污泥消化池上清液及其他含高氨氮、低碳氮比廢水有較高的處理能力，是一種有效的處理方式[1]。1995年，van de Graaf等[2]在荷蘭某酵母生產(chǎn)企業(yè)污水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌的存在并提出了厭氧氨氧化菌代謝模型(圖1)，即亞硝酸鹽被亞硝酸鹽還原酶還原為羥胺(NH2OH)，聯(lián)氨水解酶催化羥胺和氨縮合成聯(lián)氨(N2H2)，最后，聯(lián)氨在聯(lián)氨氧化酶HZO(或羥胺氧化還原酶HAO)的催化下轉(zhuǎn)化成氮?dú)?，同時(shí)釋放的電子通過傳遞鏈傳遞給亞硝酸鹽還原酶。厭氧氨氧化菌(Anaerobic ammonia oxidation bacteria, AnAOB)俗稱為“紅菌”，因富集培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色顆粒狀而得其名。Anammox菌對(duì)環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，在污水處理廠活性污泥、海洋、淡水湖和河底土壤生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，甚至在北極海底冰川中能夠存活，這為厭氧氨氧化菌的實(shí)際應(yīng)用提供了新的思路。然而，研究顯示此類微生物在最佳生長(zhǎng)條件下代時(shí)約為10～12 d，Anammox緩慢地生長(zhǎng)速率使其在污水處理系統(tǒng)中具有較低的污泥產(chǎn)量，導(dǎo)致啟動(dòng)時(shí)間過長(zhǎng)，通常情況下，啟動(dòng)時(shí)間可能長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月到幾年[3]，由此限制了其在廢水處理系統(tǒng)中的應(yīng)用[4]，因此探討快速有效的Anammox富集培養(yǎng)方法對(duì)厭氧氨氧化技術(shù)的推廣至關(guān)重要。本文綜述了國內(nèi)外厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動(dòng)過程的影響因素及微生物群落變化的最新研究進(jìn)展，并對(duì)該技術(shù)今后的研究方向提出了建議，期望對(duì)厭氧氨氧化領(lǐng)域的后續(xù)研究提供參考。

圖1 基于15N示蹤研究的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway based on 15N tracer study

1 厭氧氨氧化機(jī)理

反應(yīng)可以看成由兩個(gè)過程組成：①分解(產(chǎn)能)代謝：以氨為電子供體，亞硝酸鹽為電子受體，兩者以1∶1的比例反應(yīng)生成氮?dú)?，并把產(chǎn)生的能量以ATP形式儲(chǔ)存起來；②合成代謝：以亞硝酸鹽為電子受體提供還原力，利用二氧化碳為碳源，以分解代謝產(chǎn)生的ATP為能源合成細(xì)胞物質(zhì)，并在該過程中產(chǎn)生硝酸鹽[5]。

2 Anammox菌富集培養(yǎng)裝置

上流式厭氧污泥床(Up-flow anaerobic sludge blanket reactor, UASB)是目前最受歡迎的用于廢水厭氧生物處理反應(yīng)器，由lettinga等在20世紀(jì)70年代開發(fā)[6]。與傳統(tǒng)的厭氧處理相比，UASB反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)在于污泥持留量高、容積負(fù)荷高，反應(yīng)器可以在較短的水力停留時(shí)間下運(yùn)行。

UASB反應(yīng)器通常由四個(gè)部分組成：①顆粒污泥床；②流化區(qū)；③氣固分離器；④沉降室。UASB反應(yīng)器裝置構(gòu)造見圖2。

圖2 UASB系統(tǒng)裝置圖Fig.2 Schematic diagram of the UASB system

3 影響厭氧氨氧化反應(yīng)的因素

3.1 溫度

溫度會(huì)影響微生物的活性，厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)溫度條件要求很高，并且不同種類的厭氧氨氧化細(xì)菌對(duì)溫度要求不同[7]。De等[8]研究了溫度降低(從35 ℃降至20 ℃)對(duì)厭氧氨氧化序批式反應(yīng)器(SBR)脫氮性能和微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。結(jié)果表明，氨氮和亞硝態(tài)氮的平均去除率在富集期的第一階段(35 ℃)和第二階段(25 ℃)較高(96%)，在20 ℃運(yùn)行時(shí)略有下降(90%)。同時(shí)，溫度降低會(huì)改變微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。當(dāng)反應(yīng)器溫度從35 ℃降至20 ℃時(shí)Chloroflexi(綠彎菌門)的相對(duì)豐度從36%降至16%，由于該門細(xì)菌大多數(shù)嗜熱，低溫會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌活性和代謝降低。此外，在具有厭氧氨氧化活性的反應(yīng)器中，Chloroflexi利用的碳源主要來自細(xì)胞裂解，低溫條件下細(xì)胞衰減率可能會(huì)降低，因此限制了Chloroflexi的生長(zhǎng)。Li等[9]研究了厭氧氨氧化序批式反應(yīng)器(SBR)在較低氮負(fù)荷率(NLR)(0.28 kgN/(m3/d))時(shí)，不同溫度下的脫氮性能和微生物群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，當(dāng)溫度從(33±1) ℃下降到(15±1) ℃時(shí)，脫氮性能明顯下降(P<0.05)，出水氮化合物急劇增加，NVLR容量從(0.70 ± 0.05) mgN/(L·h)降至(0.55 ±0.08) mgN/(L·h)，說明在較低溫度下Anammox活性受到抑制，Gonzalez-Martinez等[10]利用亞硝酸鹽(CANON)生物反應(yīng)器通過降溫(從35 ℃到15 ℃)處理厭氧消化物，并通過降低氨濃度(從466 mgN/L降至100 mgN/L)觀察反應(yīng)器除氮性能，表明在低溫下氮去除性能明顯下降。但也有研究發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境下Anammox菌有不同的適宜溫度，在格陵蘭島的海洋沉積物中，Anammox的最適溫度為12 ℃[11]。說明海洋厭氧氨氧化菌適宜的溫度范圍比污水廠低得多，可以在較低溫度下處理含海水污水[12]。

3.2 溶解氧

Anammox菌是厭氧微生物，對(duì)溶解氧非常敏感，溶解氧過高對(duì)厭氧氨氧化活性有抑制作用，但該抑制過程是可逆的[13]。Carvajal-Arroyo等[14]研究DO含量為(1.0～8.0) mg/L時(shí)厭氧氨氧化反應(yīng)器的處理效果，發(fā)現(xiàn)在DO為8.0 mg/L時(shí)，Anammox菌活性嚴(yán)重抑制，在DO為1.0 mg/L時(shí)，僅觀察到20%以下的部分Anammox菌活性受到抑制，而Anammox菌在低水平的溶解氧下可以保持相當(dāng)大的活性。溶解氧抑制作用的強(qiáng)弱與富集期間使用的反應(yīng)器類型有關(guān)。在UASB反應(yīng)器中，溶解氧濃度為0.30 mg/L對(duì)厭氧氨氧化活性沒有明顯影響，Jetten等[15]利用SBR反應(yīng)器研究了氧氣對(duì)Anammox過程的影響，控制DO濃度從2%逐漸降低到0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0.5%、1%和2%DO條件下，氨氮沒有被氧化。向反應(yīng)器內(nèi)通入氬氣除去所有空氣后，氨氮和亞硝酸氮的轉(zhuǎn)化才得以恢復(fù)，說明SBR反應(yīng)器內(nèi)的Anammox菌只有在嚴(yán)格厭氧條件下才能保持穩(wěn)定的活性。Wang等[16]使用不含氨和亞硝酸鹽的合成廢水洗滌Anammox污泥直至檢測(cè)不到氨和亞硝酸鹽，將Anammox污泥等量轉(zhuǎn)移到2個(gè)“饑餓”反應(yīng)器(即滴加式半間歇反應(yīng)器)中進(jìn)行批量實(shí)驗(yàn)，通過氨去除率、活/死菌染色和熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)研究了經(jīng)過84 d饑餓脅迫期間Anammox菌的活性變化，Anammox菌的厭氧和好氧衰變率分別為(0.015± 0.001) /d和(0.028± 0.001) /d，表明與厭氧饑餓條件相比，Anammox菌在有氧饑餓條件下會(huì)更快地失去活性。Kalvelage等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Anammox菌對(duì)溶解氧適應(yīng)的濃度上限為20 μmol/L，也有文獻(xiàn)報(bào)道在Anammox反應(yīng)器中最高DO濃度為1.5 mg/L。

3.3 pH

3.4 鹽度

Anammox菌活性和反應(yīng)器除氮性能受鹽度影響很大。當(dāng)廢水中含鹽量過高時(shí)，會(huì)破壞Anammox菌細(xì)胞膜和胞內(nèi)酶，對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。Dapena-Mora等[22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽度添加到20 g/L時(shí)SAA值(厭氧氨氧化活性)會(huì)降低，低鹽度對(duì)Anammox菌活性有利，淡水厭氧氨氧化菌在鹽度為10 g/L時(shí)具有最大厭氧氨氧化率。Meng等[23]研究了鹽度變化對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌功能蛋白的影響，結(jié)果表明，反應(yīng)器內(nèi)鹽度從0 g/L增加到20 g/L，導(dǎo)致厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能下降，有18種蛋白質(zhì)含量降低，血紅蛋白(I3IPU4)和血紅素合成蛋白(I3IL00)急劇減少，說明在高鹽度下Anammox菌活性受到抑制。Jiang等[24]在鹽度梯度(0%～40%)下進(jìn)行了連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，研究了長(zhǎng)江口潮間濕地厭氧氨氧化菌活性、多樣性和豐度對(duì)鹽度變化的響應(yīng)，結(jié)果表明，對(duì)Anammox進(jìn)行長(zhǎng)期培養(yǎng)(120 d)，當(dāng)鹽度為5 g/L時(shí)，表現(xiàn)出最大的厭氧氨氧化細(xì)菌的活性和豐度，在短時(shí)間內(nèi)(10 d)當(dāng)鹽度介于(0～20) g/L之間時(shí)，Anammox菌活性和豐度會(huì)隨鹽度的增加而增加，但當(dāng)鹽度增加到30 g/L，其活性明顯減弱，與Engelbrecht等[25]研究結(jié)果一致。此外，鹽度的長(zhǎng)期影響比短期影響更明顯，鹽度的急劇變化比鹽度逐漸增加對(duì)Anammox菌的影響更大，Yang等[26]發(fā)現(xiàn)鹽度從14 g/L急劇增加到20 g/L時(shí)，厭氧氨氧化反應(yīng)器性能完全抑制。Anammox菌對(duì)高鹽度敏感是阻礙厭氧氨氧化工藝在含氮廢水處理中應(yīng)用的關(guān)鍵因素，目前關(guān)于經(jīng)過高鹽度抑制后的厭氧氨氧化過程性能恢復(fù)的研究還比較少。

3.5 抗生素

污水處理過程中抗生素的出現(xiàn)與積累越來越受到關(guān)注，國內(nèi)外已有大量關(guān)于抗生素對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)影響的研究報(bào)道?？股貙?duì)厭氧氨氧化菌的影響可分為短期抑制和長(zhǎng)期抑制，其中青霉素G和土霉素對(duì)厭氧氨氧化菌活性的長(zhǎng)期抑制遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于短期抑制。馬靜等[27]通過考察青霉素、土霉素和硫酸多粘菌素對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥活性的短期抑制特性，結(jié)果表明，硫酸多粘菌素對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥的活性抑制作用最強(qiáng)，其次是土霉素和青霉素，厭氧氨氧化顆粒污泥對(duì)3種抗生素具有較好的耐受能力。多粘菌素對(duì)Anammox菌的活性抑制作用強(qiáng)的原因可能是多粘菌素為多肽類抗生素，能殺死大多數(shù)革蘭陰性菌。Zhang等[28]研究了兩種抗生素(諾氟沙星(NOR)和紅霉素(ERY))對(duì)Anammox菌生物膜的長(zhǎng)期影響，表明NOR不僅會(huì)降低Anammox的活性，還會(huì)降低其功能性O(shè)TU豐度，而向Anammox系統(tǒng)中添加ERY，可以誘導(dǎo)細(xì)菌體內(nèi)ermB和mphA兩個(gè)基因的擴(kuò)增，其中ermB具有抵抗ERY的作用，mphA可以使ERY失活，因此Anammox菌的活性和功能性O(shè)UT沒有明顯變化。

3.6 污泥來源

選擇合適的接種污泥或菌劑作為接種物是快速啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，Anammox菌適宜生存在同時(shí)有氨鹽和亞硝酸鹽的環(huán)境中。這種環(huán)境通常存在于好氧-厭氧環(huán)境中沉積物或水體的界面。目前，不同類型的污泥已被作為用來快速啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器的接種物，常見的主要有好氧硝化污泥、厭氧消化污泥、厭氧顆粒污泥、海水底泥以及上述幾種的混合污泥。研究發(fā)現(xiàn)，在上流式厭氧污泥床(UASB)反應(yīng)器中接種成熟的厭氧氨氧化物顆粒用于厭氧氨氧化菌富集，在兩周內(nèi)成功富集了厭氧氨氧化細(xì)菌，縮短了厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)時(shí)間[29]。在有機(jī)物耐受方面，顆粒污泥比絮凝污泥更具有優(yōu)勢(shì)。反應(yīng)器在啟動(dòng)過程中通常添加富集的厭氧氨氧化污泥，但這樣在含氮廢水的處理中具有局限性[30]。為了快速啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器，國內(nèi)外許多研究者對(duì)接種污泥的選擇進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)并取得了一定的進(jìn)展。李瑩瑩[31]采用厭氧序批式反應(yīng)器，對(duì)5種不同類型的污泥進(jìn)行厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動(dòng)，結(jié)果如表1所示。接種不同污泥對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)啟動(dòng)存在差別，好氧顆粒污泥未能成功富集Anammox菌，在成功富集出的4種污泥中，污泥源中C/N越低，反應(yīng)器啟動(dòng)時(shí)間越短，與Sheng等[32]研究的結(jié)果相似，當(dāng)C/N比增加時(shí)，Anammox菌豐度會(huì)相對(duì)減少。高氮厭氧污泥啟動(dòng)時(shí)間最短，但在實(shí)際應(yīng)用過程中較難獲得，而混合污泥較為廣泛，可作為富集Anammox菌的泥源。

4 厭氧氨氧化接種物選擇的分子鑒定

由于厭氧氨氧化細(xì)菌生長(zhǎng)速度極為緩慢，目前仍沒有成功分離出其純菌種，因此分子技術(shù)成為用于鑒定Anammox菌最廣泛的方法。利用PCR方法對(duì)各種污泥中的厭氧氨氧化細(xì)菌進(jìn)行鑒定，具有快速、操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。表2中列舉了用于厭氧氨氧化菌鑒定使用的引物序列。

5 厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動(dòng)過程中群落結(jié)構(gòu)特征

到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌共有7個(gè)屬：Kuenenia、Brocadia、Anammoxoglobus、Brasilis、Jettenia、Scalindua、Anammoximicrobium；20個(gè)種[40]。表3中列舉了目前已發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌。其中大多數(shù)來自污水處理系統(tǒng)中的活性污泥，還有一部分來自海洋與河流沉積物。

表1 不同接種污泥對(duì)厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動(dòng)的影響[30]

Table 1 Influence of different inoculation sludge on start-up of anammox reactor[30]

表2 用于厭氧氨氧化菌鑒定的16S rRNA基因PCR擴(kuò)增引物

注：a表示實(shí)時(shí)定量熒光PCR

表3 目前已發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌

楊瑞麗等[60]對(duì)啟動(dòng)成功Anammox工藝中的污泥樣品進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析，于浮霉菌門中檢測(cè)到4個(gè)Anammox菌屬：CandidatusJettenia、Ca.Kuenenia、Ca.Brocadia和Ca.Anammoximicrobium屬，占測(cè)序總數(shù)的1.65%，Ca.Jettenia和Ca.Kuenenia是反應(yīng)器中主要的Anammox菌屬。譚錫誠等[61]分析了UASB系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，厭氧氨氧化優(yōu)勢(shì)菌種由Ca.Brocadia(20 d)變?yōu)镃a.Jettenia和Ca.Kuenenia的混合菌種(134 d)。姚芳等[62]分別接種城市污水處理廠活性污泥(A)和厭氧顆粒污泥(B)啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器，經(jīng)過119 d的啟動(dòng)，A反應(yīng)器中Ca.Brocadia豐度可以達(dá)到11.34%，而B反應(yīng)器中Ca.Brocadia豐度僅為7.28%。汪瑤琪等[63]通過高通量測(cè)序法對(duì)不同負(fù)荷情況下反應(yīng)器污泥群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)綠彎菌門 (Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、WWE3門、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)是優(yōu)勢(shì)菌門，其中浮霉菌門中檢測(cè)出有Ca.Brocadia、Ca.Jettenia、Ca.Kuenenia等，Ca.Brocadia增幅最大，其豐度從0.07% 增至13.40%。Ca.Scalindua屬主要分布在海洋環(huán)境中，而其他幾個(gè)屬廣泛存在于淡水環(huán)境中。在Scalindua屬中，已經(jīng)鑒定出兩種海洋分子分離物，其中一種，在黑海的缺氧水柱中發(fā)現(xiàn)，暫定名為S.sorokinii[38]，另一種在蘭德爾峽灣的底泥中被發(fā)現(xiàn)[64]。

6 展 望

近年來，同時(shí)具備脫氮和能量自給的反應(yīng)工藝是污水處理的目標(biāo)，與傳統(tǒng)的硝化反硝化相比，厭氧氨氧化工藝具有污泥產(chǎn)量較低、無需曝氣、成本低且不產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器快速啟動(dòng)并能夠穩(wěn)定運(yùn)行是目前厭氧氨氧化技術(shù)投入到工程應(yīng)用的關(guān)鍵，綜上所述，選擇適宜的溫度、溶解氧、pH、鹽度、抗生素、接種污泥等進(jìn)行富集培養(yǎng)，可有效地促進(jìn)Anammox菌的快速增長(zhǎng)，提高富集培養(yǎng)器的啟動(dòng)時(shí)間。目前所發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的Anammox菌有7個(gè)屬、20個(gè)種，并廣泛分布于各種環(huán)境中，可應(yīng)用于不同來源廢水的處理與處置。雖然目前還無法通過傳統(tǒng)微生物學(xué)的方法對(duì)其進(jìn)行深入研究，但是分子生態(tài)學(xué)方法的引入使得該領(lǐng)域的研究已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段。