李守娟， 王 麗， 陳 竹， 胡朝霞， 王 磊， 吳 蓓， 朱 麗， 段 萌

成都市公共衛(wèi)生臨床醫(yī)療中心 肝病科， 成都 610066

Association of genotype with cellular immunity and coagulation function in chronic hepatitis B virus infection patients with different disease spectrums in Sichuan, China

LIShoujuan,WANGLi,CHENZhu,etal.

(DepartmentofHepatology,ChengduPublicHealthMedicalCenter,Chengdu610066,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the genotype distribution of chronic hepatitis B virus (HBV) infection patients with different disease spectrums in Sichuan, China, as well as the association of genotypes with cellular immunity and coagulation function.MethodsA total of 543 patients with chronic HBV infection who were hospitalized in Chengdu Public Health Medical Center from January 2015 to June 2017 were enrolled, among whom there were 31 chronic HBV carriers, 285 patients with chronic hepatitis B (CHB), 77 patients with severe hepatitis B, 81 patients with hepatitis B cirrhosis, and 69 patients with hepatocellular carcinoma (HCC). Blood samples were collected; gene microarray was used to determine the genotypes of HBV DNA, and T lymphocyte subsets and coagulation function were measured. An analysis of variance was used for comparison of continuous data between multiple groups, and the SNK-qtest was used for further comparison between two groups; the chi-square test was used for comparison of categorical data between groups.ResultsAmong the 543 patients with chronic HBV infection, 400 (73.66%) had type B infection, 123 (22.65%) had type C infection, 10 (1.84%) had mixed type B and C infection, and 10 (1.84%) had mixed type C and D infection. There were no significant differences in the distribution of HBV genotypes, prothrombin time, and prothrombin activity in different disease spectrums between the patients with type B infection and those with type C infection (allP>0.05). According to the results of T lymphocyte subsets, in the severe hepatitis B group, the patients with type C infection had higher percentages of CD3+and CD3+CD4+T cells than those with type B infection; in the chronic hepatitis B group, the patients with type C infection had a higher percentage of CD3+CD8+T cells than those with type B infection; in the chronic HBV carrier group, severe hepatitis B group, and hepatitis B cirrhosis group, the patients with type C infection had a higher CD4+/CD8+ratio than those with type B infection; in the hepatitis B cirrhosis group, the patients with type C infection had lower percentages of CD3+, CD3+CD4+, and CD3+CD8+T cells than those with type B infection; in the HCC group, the patients with type C infection had lower percentages of CD3+, CD3+CD4+, and CD3+CD8+T cells and a lower CD4+/CD8+ratio than those with type B infection, with significant differences in the percentages of CD3+CD4+T cells (t=2.078,P=0.041) and CD3+CD8+T cells (t=6.672,P<0.001) between the patients with type C infection and those with type B infection in the hepatitis B cirrhosis group.ConclusionTypes B and C are the main genotypes of chronic HBV infection in different disease spectrums in Sichuan, with type B more commonly seen than type C, and there is no difference in the distribution of HBV genotypes between patients with different disease spectrums. Disorder of cellular immune function is observed in patients with chronic HBV infection, with different immune disorders in different stages of infection, and the genotype of infection is not associated with coagulation function and cellular immune function.

Keywords：hepatitis B virus; genotype; immunity, cellular; blood coagulation; Sichuan

HBV感染機(jī)體后主要通過(guò)宿主免疫機(jī)制引起肝損傷，造成HBV感染后不同臨床轉(zhuǎn)歸的原因有病毒、環(huán)境因素、宿主遺傳因素等[1]，不同的病毒基因型可能影響抗原表達(dá)而產(chǎn)生不同的臨床表現(xiàn)，具有不同的流行特征及致病性。肝臟在凝血機(jī)制中占有極其重要的地位，凝血因子合成能力反映了肝細(xì)胞的功能狀態(tài)。國(guó)外學(xué)者Sass等[2]認(rèn)為凝血時(shí)間是判斷重型肝炎預(yù)后的重要因素。不同疾病譜慢性HBV感染者基因型是否導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的差異及凝血功能的改變，臨床報(bào)道不多。本研究通過(guò)對(duì)四川地區(qū)慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化及肝細(xì)胞癌患者的基因型和T淋巴細(xì)胞及凝血功能變化進(jìn)行分析，以探討不同基因型與細(xì)胞免疫及凝血功能的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2015年1月-2017年6月于本院住院的四川地區(qū)(宜賓、巴中、廣安、廣元、成都、甘孜州、阿壩州)HBV感染者。根據(jù)患者癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查結(jié)果，將患者分為慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝細(xì)胞癌(在慢性乙型肝炎基礎(chǔ)上發(fā)生的肝細(xì)胞癌)5組，診斷符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[3]。納入患者均進(jìn)行HBV DNA基因分型以及T淋巴細(xì)胞亞群和凝血功能檢測(cè)。排除甲型肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎、HIV、酒精性肝病、自身免疫性肝炎、藥物性、代謝性等疾病?；颊呔炇鹬橥鈺?。

1.2 HBV DNA基因分型檢測(cè) 采用基因芯片法，使用珠海賽樂奇生物技術(shù)有限公司提供的儀器及配套試劑盒，將待測(cè)不同HBV基因型的特征基因片段(靶基因)固定于玻片上制成檢測(cè)芯片，從患者血清中抽提出的HBV DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增標(biāo)記后與芯片進(jìn)行雜交，雜交信號(hào)由掃描儀掃描，再經(jīng)計(jì)算機(jī)分析確認(rèn)結(jié)果。嚴(yán)格按照試劑盒上說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.3 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 使用BECKMAN FC500流式細(xì)胞儀及配套試劑檢測(cè)T淋巴細(xì)胞亞群CD3、CD4、CD8：每個(gè)樣品測(cè)定管中加入50 μl抗凝血(EDTA-K2抗凝)，各管加入10 μl三色單抗，輕微振蕩混勻，室溫避光放置20 min；加1 ml溶血素裂解紅細(xì)胞，輕微振蕩，避光10 min，接著離心棄上清2次，加PBS后上機(jī)檢測(cè)。取50 μl全血加10 μl IgG1-FITC/IgG1-PE/IgGl-PE-Cy5(小鼠)，作為陰性對(duì)照，其他步驟同上。每份標(biāo)本測(cè)定5000個(gè)細(xì)胞，全部數(shù)據(jù)用流式細(xì)胞儀和軟件SYSTEM Ⅱ獲取及分析。

1.4 肝功能及凝血功能測(cè)定 采用Labospect 008全自動(dòng)生化分析儀和邁克生物生化試劑檢測(cè)肝功能各項(xiàng)指標(biāo)，包括ALT、AST、Alb、TBil。通過(guò)Sysmex CS-2000血凝儀及武漢中太生物技術(shù)有限公司血凝試劑進(jìn)行PT、凝血酶原活動(dòng)度(PTA)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 共納入543例HBV感染者，年齡18～70歲，平均(41.25±13.67)歲，其中男416例，女127例。納入患者中慢性HBV攜帶者31例，慢性乙型肝炎(包括輕、中、重度)285例，重癥乙型肝炎(包括早、中、晚期)77例，乙型肝炎肝硬化81例，肝細(xì)胞癌69例。其中B型400例，占73.66%；C型123例，占22.65%；B、C混合型10例(漢族)，C、D混合型10例(漢族4例，藏族6例)，各占1.84%。各組均以B型、C型常見，B型為主，可見極少部分B、C混合型及C、D混合型，沒有發(fā)現(xiàn)A、E、F、G、H、I、J型(表1)。

表1 不同類型HBV感染者的基因分型情況[例(%)]

2.2 B/C不同基因型慢性HBV感染者肝功能測(cè)定 因B、C混合型及C、D混合型例數(shù)較少，故僅選取B型和C型共523例慢性HBV感染者進(jìn)行肝功能測(cè)定。慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化以及肝細(xì)胞癌各組中HBV基因型的分布無(wú)差異(χ2=8.770，P=0.067)。肝功能檢測(cè)結(jié)果顯示，各組內(nèi)B型與C型患者比較，慢性乙型肝炎組Alb(t=2.073，P=0.039)、乙型肝炎肝硬化組ALT(t=2.851，P=0.006)和AST(t=3.182，P=0.002)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余指標(biāo)組內(nèi)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。同一基因型不同分組間肝功能比較顯示，B基因型中慢性HBV攜帶者ALT、AST、TBil、Alb水平與其他組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；B/C基因型中，重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組、肝細(xì)胞癌組比較，ALT、AST、TBil水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)；而乙型肝炎肝硬化組與肝細(xì)胞癌組各項(xiàng)肝功能指標(biāo)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

2.3 B/C不同基因型慢性HBV感染者凝血及T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定 各組內(nèi)B型與C型患者比較，僅乙型肝炎肝硬化組CD3+CD4+(t=2.078，P=0.041)、CD3+CD8+(t=6.672，P<0.001)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余指標(biāo)組內(nèi)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。同一基因型不同組間凝血功能檢測(cè)結(jié)果顯示，慢性乙型肝炎組與重癥乙型肝炎組、重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組和肝細(xì)胞癌組相比，PT、PTA差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；而慢性HBV攜帶者與慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與肝細(xì)胞癌患者凝血功能比較均無(wú)差異(P值均>0.05)。同一基因型不同組間T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果顯示，B基因型中慢性乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細(xì)胞癌組、重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細(xì)胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/ CD8+差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，且乙型肝炎肝硬化患者CD3+CD8+數(shù)量明顯高于肝細(xì)胞癌患者(P<0.05)。C基因型中慢性HBV攜帶者與重癥乙型肝炎組、乙型肝炎肝硬化組及肝細(xì)胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細(xì)胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+數(shù)量差異亦均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎3組分別與乙型肝炎肝硬化組和肝細(xì)胞癌組比較，CD3+CD8+數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；CD4+/CD8+各組間比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表3)。

3 討論

目前根據(jù)HBV全基因序列差異>8%或S基因片段差異>4%分為A～J共10個(gè)基因型[4]。HBV基因型分布具有明顯的地域特征，在我國(guó)主要是B型和C型[5-6]，也存在A型、D型及B和C型混合感染[7]。胡朝輝等[8]報(bào)道四川地區(qū)HBV基因型以B、C型為主，而B型占優(yōu)勢(shì)地位。本研究結(jié)果顯示，納入543例HBV感染者中B型占73.66%，C型占22.65%，B、C混合型及C、D混合型各占1.84%，沒有發(fā)現(xiàn)A、E、F、G、H、I、J型。筆者對(duì)523例B/C不同基因型各疾病譜慢性HBV感染者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組中HBV基因型的分布無(wú)差異，肝功能檢測(cè)中慢性乙型肝炎組Alb，乙型肝炎肝硬化組ALT、AST比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在HBV導(dǎo)致的有明顯肝臟炎癥及纖維化程度較重的肝臟疾病譜中，B型比C型更易引起炎癥反應(yīng)，但C型患者肝臟合成能力較差。同一基因型各疾病譜間比較結(jié)果顯示，B基因型中慢性HBV攜帶者與各組比較肝功能指標(biāo)均有差異(P值均<0.05)；B/C基因型除Alb外，其余指標(biāo)在重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組、肝細(xì)胞癌組比較中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而乙型肝炎肝硬化組與肝細(xì)胞癌組各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)，表明在HBV所致肝細(xì)胞壞死程度與引起不良臨床結(jié)局方面B與C基因型之間無(wú)差異。

表2 B/C不同基因型慢性HBV感染者肝功能檢測(cè)結(jié)果

注：與慢性HBV攜帶者比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05；與重癥乙型肝炎組比較，3)P<0.05。

表3 B/C不同基因型慢性HBV感染者凝血功能及T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果

組別例數(shù)CD3+CD4+(個(gè)/μl)B型C型CD3+CD8+(個(gè)/μl)B型C型CD4+/CD8+B型C型慢性HBV攜帶者31746.11±78.09734.25±61.87409.93±68.58365.50±40.911.85±0.242.02±0.10慢性乙型肝炎278577.20±204.631)554.97±150.411)401.43±179.54420.21±217.741.57±0.521.50±0.52重癥乙型肝炎75485.27±180.021)2)500.19±114.991)309.13±205.951)2)292.10±123.791.90±0.751.94±0.75乙型肝炎肝硬化77377.19±243.581)2)3)266.96±131.941)2)3)223.09±159.631)2)3)135.45±2.511)2)3)2.15±1.202)3)2.28±2.02肝細(xì)胞癌62313.00±124.421)2)3)306.00±54.041)2)3)152.23±54.341)2)3)4)144.33±23.401)2)3)2.19±0.912)3)2.14±0.32F值34.17031.92329.16631.52312.2873.436P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.0010.369

注：與慢性HBV攜帶者比較，1)P<0.05；與慢性乙型肝炎組比較，2)P<0.05；與重癥乙型肝炎組比較，3)P<0.05；與乙型肝炎肝硬化組比較，4)P<0.05。

肝臟是合成凝血因子的主要場(chǎng)所。隨著肝損傷程度的加重，慢性乙型肝炎患者凝血功能有降低的趨勢(shì)，特別是對(duì)于慢性重型乙型肝炎患者和肝硬化患者[9]。肝病患者凝血因子的變化對(duì)合理判斷預(yù)后具有重要參考價(jià)值[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，同一基因型不同疾病譜間比較，隨著肝損傷的加重，PT延長(zhǎng)，PTA降低，尤其是重癥乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者更明顯，與上述研究[9]結(jié)果一致。而同一疾病譜內(nèi)B基因型患者PT延長(zhǎng)及PTA降低程度雖比C基因型患者明顯，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。

外周血T淋巴細(xì)胞的數(shù)量、功能和各亞群構(gòu)成比的變化反映了機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。HBV感染后，患者主要依靠機(jī)體細(xì)胞毒效應(yīng)與非細(xì)胞毒效應(yīng)兩種免疫機(jī)制清除病毒。其中T淋巴細(xì)胞參與的細(xì)胞毒效應(yīng)起主導(dǎo)作用。研究[11]顯示慢性乙型肝炎患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂。本研究中，各疾病譜內(nèi)CD3+、CD3+CD4+數(shù)量在重癥乙型肝炎組，CD3+CD8+數(shù)量在慢性乙型肝炎組，CD4+/CD8+在慢性HBV攜帶者組、重癥乙型肝炎組及乙型肝炎肝硬化組C型均高于B型，而乙型肝炎肝硬化組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數(shù)量與肝細(xì)胞癌組CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數(shù)量、CD4+/CD8+則是C基因型患者低于B型，且僅乙型肝炎肝硬化患者CD3+CD4+、CD3+CD8+數(shù)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，說(shuō)明肝硬化患者C型較B型CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞受損嚴(yán)重，以致其免疫功能更低下[12]。同一基因型不同疾病譜間比較結(jié)果顯示，B基因型中隨著病情的加重，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數(shù)量逐漸減少，CD4+/CD8+僅慢性乙型肝炎組低于慢性HBV攜帶者，其余各組均高于慢性HBV攜帶者且逐漸上升，其中慢性乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細(xì)胞癌組比較、重癥乙型肝炎組與乙型肝炎肝硬化組及肝細(xì)胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+數(shù)量和CD4+/CD8+差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，且乙型肝炎肝硬化組與肝細(xì)胞癌組CD3+CD8+數(shù)量比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，說(shuō)明在慢性HBV感染的過(guò)程中，機(jī)體的免疫細(xì)胞在清除病毒過(guò)程中造成自身不同程度損耗，致使患者免疫力低下，可能會(huì)進(jìn)一步促發(fā)乙型肝炎肝硬化狀態(tài)下的肝細(xì)胞惡變[12]。C基因型中，肝細(xì)胞癌組CD3+、CD3+CD4+數(shù)量高于乙型肝炎肝硬化組，其余各組隨病情的進(jìn)展逐漸減少但均高于肝細(xì)胞癌組；慢性HBV攜帶者分別與重癥乙型肝炎組、乙型肝炎肝硬化組及肝細(xì)胞癌組比較，重癥乙型肝炎組分別與乙型肝炎肝硬化組、肝細(xì)胞癌組比較，CD3+、CD3+CD4+數(shù)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)；CD3+CD8+數(shù)量變化從大到小依次為：慢性乙型肝炎>慢性HBV攜帶者>重癥乙型肝炎>肝細(xì)胞癌>乙型肝炎肝硬化，且慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎、重癥乙型肝炎3組分別與乙型肝炎肝硬化和肝細(xì)胞癌組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而CD4+/CD8+變化順序?yàn)椋阂倚透窝赘斡不?肝細(xì)胞癌>慢性HBV攜帶者>重癥乙型肝炎>慢性乙型肝炎，但各疾病譜間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。說(shuō)明在慢性HBV感染的不同階段，機(jī)體的免疫紊亂各不相同[12]。

綜上所述，四川地區(qū)不同疾病譜慢性HBV感染者基因分型以B型、C型常見，B型為主；各疾病譜中B、C基因型的分布無(wú)差異。同一基因型不同疾病譜間比較，隨著肝損傷的加重，PT延長(zhǎng)，PTA降低，尤其是重癥乙型肝炎和乙型肝炎肝硬化患者更為明顯，同一疾病譜內(nèi)B基因型PT延長(zhǎng)及PTA降低程度雖比C型明顯，但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均>0.05)。在慢性HBV感染者體內(nèi)存在細(xì)胞免疫功能的紊亂，且隨感染的不同階段，機(jī)體的免疫紊亂各不相同，除乙型肝炎肝硬化患者C型較B型CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞受損嚴(yán)重有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組CD3+、CD4+/CD8+組內(nèi)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HBV基因型是否可導(dǎo)致不同疾病譜慢性乙型肝炎患者細(xì)胞免疫功能的差異有待進(jìn)一步研究。