鄭 璐，胡金貴，張佳智，葛 睿，李青山

1山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001；2山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 基于炎性反應(yīng)的重大疾病創(chuàng)新藥物山西省重點實驗室，晉中 030619

扶芳藤(Euonymusfortunei(Turcz.) Hand.-Mazz)，衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬常綠藤本灌木，別名換骨筋、山百足、萬年青、衛(wèi)生草等[1]，是我國少數(shù)民族常用的中藥，具有益氣血、補肝腎、舒筋活絡(luò)、止血、化瘀等功效[2]，其有效成分主要是山柰酚、槲皮素、甜醇等[3，4]。提取物中所含主要成分的差異，為更有效的利用民族中藥資源提供科學(xué)依據(jù)。扶芳藤傳統(tǒng)用于治療風(fēng)濕痹痛等癥，對現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及骨關(guān)節(jié)炎疾病有顯著療效，且無明顯毒副作用。同時，有文獻(xiàn)資料顯示[5]，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與氧自由基產(chǎn)生過多有著密切的關(guān)系。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)扶芳藤的乙醇總提物具有較好的抗氧化作用，可以改善體內(nèi)外丙二醛(malondialdehyde，MDA)的清除效果和谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，由此扶芳藤抗氧化方面有著進(jìn)一步研發(fā)的價值。本研究對扶芳藤總提物進(jìn)行進(jìn)一步地有效部位分離，所得各萃取極性部位樣品進(jìn)行體內(nèi)、體外抗氧化實驗研究，以進(jìn)一步確定扶芳藤抗氧化活性的有效部位。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

扶芳藤乙醇總提物；乙酸乙酯、正丁醇、石油醚及無水乙醇均為分析純；DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)、WST-1水溶性四唑鹽試劑(碧云天生物技術(shù))；LPS(北京索萊寶試劑)；塞來昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、GSH-Px檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 儀器

AMR-100型全自動酶標(biāo)分析儀(杭州奧盛儀器有限公司)；UV-1200型紫外分析儀(上海美普達(dá)儀器有限公司)；萬分之一內(nèi)較電子天平(賽多麗斯科學(xué)儀器有限公司，京制00000246號)；低速離心機(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，SC-2554)；手術(shù)器械；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)。

1.3 動物

雄性昆明小鼠120只，體質(zhì)量為22±2 g，來自山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(動物合格證編號：SCXK(晉)2015-0001)，小鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)動物實驗研究中心小鼠飼養(yǎng)室。

2 方法

2.1 受試物及對照品溶液的制備

2.1.1 扶芳藤不同提取部位

稱取干燥扶芳藤乙醇提取物粗粉100.0 g，浸泡于蒸餾水中2～3天，用等體積石油醚[6]、乙酸乙酯、正丁醇萃取，然后減壓濃縮，分別得到三個萃取部位[7]。

2.1.2 DPPH工作液及ABTS工作液的配置

參考試劑盒說明書完成。

2.2 體外抗氧化實驗

2.2.1 對DPPH自由基的抑制作用

依據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，設(shè)置扶芳藤正丁醇、乙酸乙酯、石油醚部位的濃度梯度分別為0.025、0.050、0.075、0.100、0.150、0.200、0.300、0.400、0.500 mg/mL；0.025、0.050、0.075、0.125、0.150、0.175、0.225、0.250、0.275、0.350、0.450、0.500 mg/mL及0.083、0.160、0.333、0.500、0.667、0.833、1.000 mg/mL。96孔板每孔加入DPPH溶液120 μL，加扶芳藤不同極性提取部位樣品液60 μL，混勻，靜置30 min后，用酶標(biāo)儀在519 nm處測定OD樣品值。扶芳藤不同極性提取部位對DPPH自由基清除性能按下式計算：清除率=(OD0-OD樣品)/OD0×100%[8,9]。對DPPH自由基清除性能與扶芳藤不同提取部位的濃度做散點圖，并計算IC50值。

2.2.2 對ABTS自由基的抑制作用

依據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，設(shè)置扶芳藤正丁醇及乙酸乙酯部位的濃度梯度為：0.100、0.250、0.500、0.750、1.000、1.500、2.000、3.000、4.000、5.000 mg/mL；石油醚部位濃度梯度為0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、6.000、8.000、10.000、12.000、14.000 mg/mL。96孔板每孔加入ABTS工作液200 μL，加扶芳藤不同極性提取部位樣品液10 μL，輕輕混勻，室溫避光靜置5 min后，用酶標(biāo)儀在734 nm處測定OD樣品值。扶芳藤不同極性提取部位對ABST自由基清除性能按下式計算：抑制率=(OD0-OD樣品)/OD0×100%[10-12]。對ABTS自由基清除性能與扶芳藤不同提取部位的濃度繪制的散點圖，并計算IC50值。

2.3 體內(nèi)抗氧化實驗

2.3.1 試驗劑量

前期急性毒性實驗結(jié)果表明小鼠灌胃扶芳藤最大給藥量為130.8 g生藥/kg體重，幾乎無急性毒性。因此參考扶芳藤臨床日用量(10 g生藥)計算扶芳藤不同提取部位的濃度，以5‰CMC-Na為溶劑按劑量配制成所需濃度。

2.3.2 動物分組及造模

取雄性昆明小鼠120只，隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照組(塞來昔布)、扶芳藤石油醚部位低中高劑量組、乙酸乙酯部位低中高劑量組、正丁醇部位低中高劑量組，共計12組，每組10只。各組小鼠灌胃給藥，0.1 mL/10 g，每日1次，給藥14天。對照組給予等體積的5‰CMC-Na溶液。14天后用100 g/L的水合氯醛對小鼠進(jìn)行腹腔注射(4 mL/kg)麻醉，麻醉后用鑷子牽拉小鼠的舌，用移液槍吸取1 g/L的LPS 50 μL滴于小鼠咽喉壁，并馬上捏住小鼠的鼻子，20 s后松開舌及鼻，造成急性肺損傷模型[13-15]，陽性藥塞來昔布在造模前1 h灌胃給藥。造模12 h后眼眶取血，離心取血清于0.5 mL的EP管中，冰箱-20 ℃凍存。

2.3.3 血清中SOD活力、MDA含量和GSH-Px酶活力的測定

MDA活性的測定采用硫代巴比妥酸法；SOD活性的測定采用WST-1法(WST-1水溶性四唑鹽試劑)，具體操作流程按照試劑盒的說明書進(jìn)行[16-18]。在進(jìn)行正式實驗之前需進(jìn)行預(yù)實驗。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 體外抗氧化實驗

3.1.1 對DPPH 自由基的抑制作用

按照前述公式計算清除率，不同濃度的扶芳藤提取部位對DPPH的清除率如圖1所示。由圖1可以看出扶芳藤不同提取部位對DPPH自由基都具有清除作用。其清除作用與扶芳藤不同提取部位的濃度在一定范圍內(nèi)呈一定的化學(xué)計量關(guān)系。在0.010～0.150 mg/mL的有效范圍內(nèi)，隨著扶芳藤正丁醇部位的濃度不斷增加，清除率也隨之不斷增加，IC50=0.100 mg/mL；在0.010～0.275 mg/mL的有效范圍內(nèi)，隨著扶芳藤乙酸乙酯部位的濃度不斷增加，清除率也隨之不斷增加，IC50=0.256 mg/mL；在0.080～1.000 mg/mL的有效范圍內(nèi)，隨著扶芳藤石油醚部位的濃度不斷增加，清除率也隨之不斷增加，IC50=0.700 mg/mL。

圖1 扶芳藤不同提取部位對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging ratio of the extract components from E.fortunei on DPPH radical s,n = 3)

3.1.2 ABTS自由基清除率的測定

按照前述公式進(jìn)行計算抑制率，不同濃度的扶芳藤不同極性提取部位對ABTS的抑制率如圖2所示。由圖2可以看出扶芳藤不同極性提取部位對ABTS的產(chǎn)生都具有抑制作用。

隨著扶芳藤正丁醇部位的濃度不斷增加，抑制率也隨之不斷增加，當(dāng)濃度大于2 mg/mL后抑制作用進(jìn)入平臺期，抑制率最大在80%左右，IC50=0.814 mg/mL；隨著扶芳藤乙酸乙酯部位的濃度不斷增加，清除率也隨之不斷增加，當(dāng)濃度大于4 mg/mL后抑制作用出現(xiàn)下降趨勢，抑制率最大在70%左右，IC50=2.384 mg/mL；隨著扶芳藤石油醚部位的濃度不斷增加，清除率也隨之不斷增加，當(dāng)濃度大于4 mg/mL后抑制作用出現(xiàn)下降趨勢，抑制率最大在90%左右，IC50=2.059 mg/mL。

3.2 體內(nèi)抗氧化實驗

3.2.1 對小鼠體內(nèi)SOD活性影響

乙酸乙酯中高劑量組(8.8和、17.6 mg/kg)和正丁醇低中高劑量組(6.7、13.4、26.8 mg/kg)對提高小鼠體內(nèi)SOD活性均有良好的效果，與模型組比較有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。石油醚低中高劑量組均無顯著影響。結(jié)果見表1和圖3。

圖2 扶芳藤不同提取部位對ABTS自由基的抑制率Fig.2 Scavenging ratio of the extract components from E.fortunei on ABST radical s,n =3)

3.2.2 對小鼠體內(nèi)MDA含量的影響

乙酸乙酯低中高劑量組和正丁醇低中高劑量組能夠降低MDA的含量，與模型組比較有顯著差異(P<0.05，P<0.01)，石油醚低中高劑量組均無顯著影響。結(jié)果見表1和圖4。

3.2.3 對小鼠體內(nèi)GSH-Px活性影響

乙酸乙酯低中高劑量組和正丁醇低中高劑量組對提高小鼠體內(nèi)GSH-Px活性均有良好的效果，與模型組比較有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。石油醚低中高劑量組均無顯著影響。結(jié)果見表1和圖5。

表1 扶芳藤各萃取極性部位對SOD、MDA、GSH-Px酶活力的影響Table 1 Effects of the extract components from the E.fortunei on SOD,MDA,GSH-Px activity s,n = 8)

注：a陽性對照；與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:aPositive control;Compared with control group，#P<0.05，##P<0.01，#P<0.05;Compared with model group,*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

4.1 體外抗氧化實驗

體外DPPH、ABST自由基實驗，常用于恒定植物抗氧化活性的體外實驗指標(biāo)。DPPH是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，它的穩(wěn)定性主要來自3個苯環(huán)的π-π共軛作用及空間障礙，使夾在中間的氮原子上不成對的電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對作用。作為一種穩(wěn)定的自由基，DPPH可以捕獲其他的自由基。因此通過加入DPPH后觀察某一化學(xué)反應(yīng)的速率是否減慢，來作為這一反應(yīng)是否具有自由基反應(yīng)本質(zhì)的指標(biāo)。

本實驗以扶芳藤為原料，萃取扶芳藤各極性部位，并設(shè)計多個劑量組實驗，其清除作用與扶芳藤不同極性萃取部位的濃度在一定范圍內(nèi)呈一定的化學(xué)劑量關(guān)系，說明扶芳藤萃取部位具有很好的體外抗氧化活性。分別以DPPH和ABTS自由基清除法測定不同扶芳藤萃取物的自由基清除能力，在DPPH實驗中，正丁醇部位的清除力最好[19]，在低濃度時就達(dá)到良好的清除效果，其IC50值為0.103 mg/mL，乙酸乙酯部位次之其IC50值為0.258 mg/mL，石油醚部位最末IC50值為0.702 mg/mL；在ABST實驗中，同樣也表現(xiàn)為正丁醇部位的清除力最好，在低濃度時就達(dá)到較好的清除效果，其IC50值為0.814 mg/mL，石油醚部位次之其IC50值為2.059 mg/mL，乙酸乙酯部位最末IC50值為2.384 mg/mL。

圖3 扶芳藤不同極性萃取部位對SOD活性的影響Fig.3 Effects of the extract components from the E.fortunei on SOD activity注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vsLPS group.

圖4 扶芳藤不同極性萃取部位對MDA含量的影響Fig.4 Effects of the extract components from the E.fortunei on MDA activity注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vsLPS group.

4.2 體內(nèi)抗氧化實驗

體內(nèi)抗氧化研究主要通過檢測扶芳藤不同萃取部位抗氧化物質(zhì)對動物模型相關(guān)抗氧化指標(biāo)的影響，來反應(yīng)其抗氧化作用的強弱。機體內(nèi)有許多酶及非酶保護(hù)屏障對抗自由基造成的DNA、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的損傷，如通過SOD和MDA、還原型谷胱甘肽(GSH)等酶的作用，可防御自由基造成的氧化損傷[20]，從而實現(xiàn)機體內(nèi)內(nèi)源性自我保護(hù)系統(tǒng)，達(dá)到抗損傷的目的。體內(nèi)MDA、SOD和GSH-Px酶活力三個實驗結(jié)果顯示，在SOD實驗中，扶芳藤萃取正丁醇部位抗氧化效果最優(yōu)；在MDA和GSH-Px酶活力這兩個實驗中，扶芳藤萃取乙酸乙酯部位抗氧化效果則最好。

圖5 扶芳藤不同極性萃取部位對GSH-Px酶活力的影響Fig.5 Effects of the extract components from the E.fortunei on GSH-Px activity注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。Note:##P<0.01 vs control group;*P<0.05,**P<0.01 vs LPS group.

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是由各種因素所致的肺彌漫性炎癥損傷，以呼吸窘迫及進(jìn)行性低氧血癥為特征，嚴(yán)重時會引發(fā)多臟器功能障礙，甚至導(dǎo)致死亡[21]。其發(fā)病機制非常復(fù)雜，多種病因均可誘發(fā)ALI，其中革蘭陰性菌感染所致的肺炎是ALI最常見的發(fā)病因素，內(nèi)毒素是革蘭陰性菌感染時解體后所釋放的一種毒性物質(zhì)，可激活機體的免疫體統(tǒng)，誘使多種炎癥細(xì)胞因子的釋放，引起機體急性炎癥，是目前研究ALI較理想的誘導(dǎo)劑。較多研究認(rèn)為肺組織的炎癥反應(yīng)失衡是導(dǎo)致各種ALI的根本原因，而氧化損傷也是導(dǎo)致 ALI的重要原因之一[22]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)扶芳藤乙醇總提物對LPS誘導(dǎo)的ALI有一定的保護(hù)作用，抗氧化是否是該保護(hù)作用產(chǎn)生的原因之一就是亟待解決的問題。

塞來昔布是臨床上常見的一種抗炎藥物，但長期過量用藥可引起較多的副作用，因此選擇高效低毒的中藥有著積極的意義。本研究選擇公認(rèn)的抗炎藥物塞來昔布作為陽性對照藥，對比扶芳藤各萃取部位對ALI的影響。

根據(jù)自由基學(xué)說，人體疾病的發(fā)生都和氧自由基有一定的關(guān)系。人體內(nèi)，約95%以上的自由基都是氧自由基，由于氧自由基的外層電子不成對，因此它的化學(xué)性質(zhì)很活潑，很容易和其他物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)。氧自由基的存在有著兩面性，一方面，在人體的新陳代謝中氧自由基是有益的，比如氧化還原代謝反應(yīng)；但另一方面，過多的氧自由基會對人體造成傷害，比如自由基介導(dǎo)炎癥關(guān)節(jié)滑液中透明質(zhì)酸的降解，破壞透明質(zhì)酸、降解關(guān)節(jié)軟骨并造成骨損傷，從而引起類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。而本文的扶芳藤已證實其有著良好的抗氧化作用，能夠清除氧自由基，對過多的氧自由基引起的關(guān)節(jié)炎疾病有著一定療效。

綜上所述，結(jié)合體內(nèi)外實驗結(jié)果可知扶芳藤萃取物乙酸乙酯及正丁醇部位具有較好的抗氧化活性，其中以乙酸乙酯部位的活性更為顯著，結(jié)合扶芳藤中化學(xué)成分的考慮，萃取部位可能含有黃酮苷、酚酸類和多糖類等物質(zhì)[23]。目前國內(nèi)外對于黃酮類、酚酸類和多糖類的抗氧化能力也有報道，所以推測扶芳藤不同極性部位的萃取物都可能存在不同含量的黃酮類或者酚酸類等物質(zhì)，從而表現(xiàn)出不同程度的抗氧化能力[24]。本研究為進(jìn)一步驗證扶芳藤中何種成分起主要作用，為尋找新的高效低毒的天然抗氧化劑及后續(xù)開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

本實驗的極性部位是天然的提取物，提取過程中環(huán)保無污染，從而對其進(jìn)行研究和將其開發(fā)成天然抗氧化劑或自由基清除劑對保障機體健康、預(yù)防心腦血管疾病有著重要的意義。