肖 瑤，田寶玉，張炳火

1福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350000；2九江學(xué)院藥學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，九江 332000

藍(lán)藻水華是一個突出的世界性環(huán)境問題[1]，爆發(fā)時產(chǎn)生的藍(lán)藻毒素等有毒物質(zhì)嚴(yán)重威脅人類健康[1,2]，給魚類等水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[3]。因此，藍(lán)藻水華的防治受到國內(nèi)外的高度關(guān)注。

長期以來，藍(lán)藻水華的防治主要依賴于CuSO4等化學(xué)殺藻劑[4]。雖然這些傳統(tǒng)化學(xué)殺藻劑控制水華快速高效[5]，但它們選擇性差，抑制整個浮游生物，毒害水生動物，并導(dǎo)致重金屬富集[5,6]，造成二次污染，對水體生態(tài)系統(tǒng)具有潛在危害[7]。因此，尋找環(huán)境友好的新型殺藻劑具有重要的意義。

放線菌以代謝產(chǎn)物種類極為豐富而著稱。研究表明，水陸環(huán)境中均存在大量溶藻放線菌，目前報道的主要是其中的鏈霉菌屬，諸如不產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesachromogenes)[8]、生暗鏈霉菌(S.phaeofaciens)[9]、脫葉鏈霉菌(S.exfoliatus)[10]、寢屋川鏈霉菌(S.neyagawaensis)[11]、灰霉素鏈霉菌(S.griseinus)[12]、九江鏈霉菌(S.jiujiangensis)[13]、廬山鏈霉菌(S.lushanensis)[14]和S.eurocidicus[15]等，它們對水華藍(lán)藻具有較好的特異性，可分泌包括蛋白質(zhì)[11]、氨基酸[9,13]、抗生素[16,17]和其他多種活性成分[15,18]，產(chǎn)生溶藻作用。因此，從放線菌及其代謝產(chǎn)物中篩選高效環(huán)保的藍(lán)藻水華防治劑具有很大前景。本文研究了放線菌JXJ 0170溶藻活性成分的發(fā)酵時間、孢子、胞外產(chǎn)物和菌絲體的溶藻效率、溶藻活性成分的部分理化性質(zhì)和作用機制、發(fā)酵液對水生動物的毒性以及該菌在野外對水華的防治效果等，以評價該菌在研制藍(lán)藻水華防治劑方面的潛力。

1 材料與方法

1.1 研究菌株、銅綠微囊藻和培養(yǎng)基

放線菌JXJ 0170，為本實驗室從廬山土樣中分離獲得。銅綠微囊藻(MicrocystisaeruginosaFACHB-905)，購自中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫。

放線菌JXJ 0170發(fā)酵培養(yǎng)基和藻培養(yǎng)基見參考文獻(xiàn)[19]。

1.2 溶藻菌株初步鑒定

采用插片法觀察菌絲形態(tài)特征。采用溶菌酶法提取菌株基因組DNA，并擴增其16S rRNA基因序列，從數(shù)據(jù)庫EzBioCloud’s Identify Service(http://www.ezbiocloud.net/identify)中調(diào)出相似性高的菌株序列，用軟件CLUSTAL_X1.83進(jìn)行多重序列比對，軟件MEGA 5構(gòu)建16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 菌株發(fā)酵

用無菌水洗下菌株斜面上的孢子，將孢子懸液接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，使孢子終密度為1.0×105CFU/mL，于28 ℃、160 rpm條件下培養(yǎng)，每24 h取樣1次，樣品置于無菌離心管內(nèi)離心(4 500 rpm，20 min)，取上清液2 mL，加入100 mL藻液(5.0×106CFU/mL)中，空白對照組加入2 mL無菌水，培養(yǎng)基對照組加入2 mL無菌發(fā)酵培養(yǎng)基，于25 ℃、光照強度為3 000 lx的人工氣候箱中靜置培養(yǎng)，光暗比為12∶12，每天搖動4次，每次約30 s，3天后鏡檢藻細(xì)胞數(shù)量，每組試驗做3個平行。

1.4 溶藻活性成分的理化性質(zhì)

1.4.1 對熱和酸堿處理的穩(wěn)定性

將發(fā)酵6天的放線菌發(fā)酵上清液進(jìn)行以下處理：(1)分別置于40、50、60、70、80、90和100 ℃的水浴處理2 h后，冷卻至室溫；(2)用1.0 mol/L的NaOH和HCl溶液，將樣品pH值分別調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0，靜置24 h后再將pH值調(diào)至原始值。取各處理樣品2 mL加入100 mL藻液(5.0×106CFU/mL)中，對照組加入2 mL無菌水，培養(yǎng)3天后鏡檢藻細(xì)胞密度，每組試驗做3個平行。

1.4.2 發(fā)酵產(chǎn)物溶藻活性

將發(fā)酵上清液減壓蒸餾濃縮至原體積的1/3，用乙酸乙酯充分萃取，除去乙酸乙酯即得極性較小的脂溶性組分；萃余相減壓蒸餾至膏狀物后，分別先后用丙酮、甲醇和無菌水充分溶解，除去各溶劑后即分別得到丙酮、甲醇和水溶解的組分，重新減壓蒸餾、稱重；再將4個組分用相應(yīng)溶劑重新溶解，使各組分樣品濃度相同，取一定體積的樣品溶液于無菌濾紙片上，使每張濾紙片含1 mg樣品，待溶劑完全揮發(fā)后，再將濾紙片置于藻平板上，3天后觀察溶藻圈的產(chǎn)生情況。

1.5 溶藻機制

1.5.1 對藻細(xì)胞形態(tài)的影響

在藻液(1.0×107/mL)中加入2%(V/V)的放線菌發(fā)酵上清液(空白對照不加)，培養(yǎng)3天后按照參考文獻(xiàn)[20]制樣并觀察藻細(xì)胞形態(tài)變化。(1)將藻液離心，收集沉淀，加入2.5%的戊二醛(用0.1 mol、pH7.0的磷酸緩沖液配制)固定藻細(xì)胞樣品1 h；(2)先后采用50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液對藻細(xì)胞脫水(每次脫水時間不超過5 min)；(3)將樣品置于蓋玻片上自然干燥；(4)用掃描電鏡(VEGAⅡLSU，TESCAN)對藻細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.5.2 對藻細(xì)胞光合作用的影響

采用密封培養(yǎng)裝置(上有導(dǎo)管可通氣體或加入液體樣品)培養(yǎng)藻液，藻液(1.0×107CFU/mL)中加入2%的放線菌發(fā)酵上清液，光照條件下培養(yǎng)，產(chǎn)生的氧氣通入裝滿液體的密閉裝置(上有一根內(nèi)徑1 mm的兩端開口的玻璃管)，記錄玻璃管中的水柱高度。對照組不加代謝產(chǎn)物。根據(jù)水柱高度判斷放線菌代謝產(chǎn)物抑制藻細(xì)胞光合作用的效率。

1.6 孢子、發(fā)酵上清液和菌絲體的溶藻活性

根據(jù)文獻(xiàn)[19]制造藻平板，將放線菌孢子接種于藻平板上，25 ℃、3 000 lx光照強度下靜置培養(yǎng)，每天觀察孢子萌發(fā)、菌絲生長和藻平板顏色變化情況。采用1.4中的條件培養(yǎng)菌株JXJ 0170，6天后離心，分別收集上清液和菌絲體備用。在藻液(5.0×106CFU/mL)中加入1%、2%和3%(V/V)的上清液，培養(yǎng)3天后鏡檢藻細(xì)胞密度。將菌絲體用無菌水洗滌3次，除去胞外產(chǎn)物，再在無菌條件下稱取0.5、1.0、1.5和2.0 g菌絲體(濕重)分別加入100 mL藻液(5.0×106CFU/mL)中，培養(yǎng)3天后鏡檢藻細(xì)胞密度，每組試驗做3個平行。以不加菌藻液為對照組。

1.7 發(fā)酵液對水生動物的毒性

取20條生長良好的彭澤鯽魚(平均重量約50 g/條)，放入45 L自來水中，并加入1%(V/V)的放線菌發(fā)酵液和100 g大米，每天換水一次，同時加入1%(V/V)的發(fā)酵液和100 g大米，連續(xù)飼喂7天，觀察魚有無中毒死亡現(xiàn)象，并計算死亡率。取生長良好的田螺120個(平均重量約2.87 g/個)，放入5 L自來水中，并加入1%(V/V)的發(fā)酵液和50 g小白菜葉，每天換水一次，同時加入1%(V/V)的發(fā)酵液和50 g小白菜葉，連續(xù)飼喂7天，觀察田螺有無中毒死亡，并計算死亡率。對照組以無菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基代替放線菌發(fā)酵液，其他條件相同。試驗時室溫15 ℃，所有試驗重復(fù)3次。

1.8 野外水華防治試驗

試驗池塘位于九江市郊區(qū)農(nóng)村，面積約為1 660 m2，平均水深約為1.5 m，試驗前在池塘中間筑壩，將池塘一分為二。兩個分區(qū)水中分別于6月1日和9月1日投放硝酸鈉和復(fù)合肥各50 kg，增加水中氮磷元素含量，試驗組投放20 L溶藻放線菌發(fā)酵液，對照組投放20 L無菌發(fā)酵培養(yǎng)基，每月1號和15號于水面15～20 cm處取樣一次，取樣點3個，采用熱乙醇法[15]測樣品的葉綠素a(Chlorophyll a，Chl-a)含量。試驗時間，2018年6月1日至2018年10月30日。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用軟件SPSS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。確定3次重復(fù)實驗的平均值(mean value)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(standard deviation，SD)，繪圖數(shù)據(jù)取3次試驗的平均值，試驗組與對照組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P≤0.05為差異顯著，P≤0.01為差異極顯著。溶藻效率=(1-試驗組藻細(xì)胞密度或Chl-a含量/對照組藻細(xì)胞密度或Chl-a含量)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲形態(tài)特征和16S rRNA基因序列分析

放線菌JXJ 0170氣生菌絲灰白色，孢子絲鏈狀，孢子卵圓形(圖1)。16S rRNA基因序列(1535 bp，GenBank登錄號：KY613504)分析表明，該菌是鏈霉菌屬(Streptomyces)的成員，且與S.anulatusNRRL B-2000T、S.cyaneofuscatusNRRL B-2570T、S.fulvissimusDSM 40593T和S.luridiscabieiNRRL B-24455T的親緣關(guān)系最近，相似性均為99.93%，然而該菌僅與S.cyaneofuscatus和S.griseussubsp.griseusKCTC 9080T聚在一大支上(圖2)，而與其它三株菌聚在不同分支上，因此，該菌的確切分類學(xué)地位尚需要進(jìn)一步的試驗數(shù)據(jù)。

2.2 菌株溶藻發(fā)酵時間

如圖3所示，試驗條件下培養(yǎng)3天后，空白對照組藻細(xì)胞密度由5.0×106CFU/mL增加到1.41×107CFU/mL，發(fā)酵培養(yǎng)基對照組(即未接菌的培養(yǎng)基)藻細(xì)胞密度只有空白對照組的78.51%，溶藻效率為21.49%(P<0.01)，這說明發(fā)酵培養(yǎng)基中的一些成分對藻細(xì)胞生長有抑制作用，但這些物質(zhì)隨著孢子的萌發(fā)與菌絲生長而被消耗。因此，接種培養(yǎng)1天后的發(fā)酵上清液對藻細(xì)胞基本沒有溶藻活性，2天后的發(fā)酵上清液甚至促進(jìn)了藻細(xì)胞的生長，但此后發(fā)酵液的溶藻活性迅速增加，5天后到達(dá)91.85%(P<0.01)，6天后變化不大，8天后略有下降。因此，確定該菌發(fā)酵時間為6天。

圖1 放線菌JXJ 0170培養(yǎng)4天后的孢子絲掃描電鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron micrograph of spore chains of actinomycete JXJ 0170 after culturing for four days

圖2 以鄰接法構(gòu)建菌株JXJ 0170系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of strain JXJ 0170 注：>50%的步長值(以重復(fù)1 000次的百分率表示)在節(jié)點處標(biāo)注；標(biāo)尺：0.05%的序列分歧度。Note:Bootstrap values (expressed as percentages of 1 000 replications) > 50 % are shown at the nodes.Bar,0.05% sequence divergence.

圖3 菌株JXJ 0170不同發(fā)酵時間上清液的溶藻效率Fig.3 Alga-lysing efficiency of fermentation broth supernatant of strain JXJ 0170 at different culture time注：**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著。Note:** indicated the significant differences between the controls and the tests at the level P<0.01.

2.3 溶藻活性成分的理化性質(zhì)

2.3.1 對熱和酸堿處理的穩(wěn)定性

如圖4所示，未進(jìn)行熱處理的試驗組(28 ℃)藻細(xì)胞密度為1.20×106CFU/mL，為對照組1.43×107CFU/mL的8.49%，即溶藻效率為91.51%；處理溫度≤70 ℃時，發(fā)酵上清液的溶藻活性沒有顯著變化，溶藻效率在90.23%以上，達(dá)到未處理組溶藻效率的98.60%以上；但處理溫度分別為80～100 ℃時，發(fā)酵上清液的溶藻活性比未處理組降低了4.38%～31.78%(P<0.05或P<0.01)。如圖4所示，在pH7.0～8.0時發(fā)酵上清液溶藻效率最高，約為91.37%，當(dāng)處理pH≤7.0時，發(fā)酵上清液的溶藻效率隨pH值的增加而增加，當(dāng)處理pH≥8.0時，發(fā)酵上清液的溶藻效率隨pH值的增加而降低。

2.3.2 發(fā)酵產(chǎn)物溶藻活性

試驗結(jié)果顯示，乙酸乙酯和丙酮溶解的樣品沒有形成溶藻圈，甲醇溶解的樣品形成的溶藻圈直徑約為1.7 cm(圖5 C)，而水溶性成分形成的溶藻圈直徑約為3.5 cm(圖5 D)，這說明菌株JXJ 0170產(chǎn)生的溶藻活性成分主要是水溶性物質(zhì)。

2.4 溶藻機制

2.4.1 對藻細(xì)胞形態(tài)的影響

掃描電鏡觀察結(jié)果(圖6)顯示，空白對照組的藻細(xì)胞球形，表面有黏液，且有大量細(xì)胞正在分裂繁殖；而加了菌株JXJ 0170發(fā)酵產(chǎn)物的試驗組藻細(xì)胞變形，且其表面粘性物質(zhì)喪失，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜穿孔，最終藻細(xì)胞裂解死亡。

2.4.2 對藻細(xì)胞光合作用的影響

試驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)6 h后，空白對照組的藻細(xì)胞培養(yǎng)裝置壁上有大量氣泡，其玻璃管中的液柱高度為27.58±0.85 cm；而加了菌株JXJ 0170發(fā)酵產(chǎn)物的試驗組藻培養(yǎng)裝置的壁上沒有氣泡，其玻璃管中的液柱高度僅為8.18±0.37 cm，僅為空白對照組的29.66%(P<0.01)，即6 h內(nèi)菌株JXJ 0170發(fā)酵產(chǎn)物對藻細(xì)胞光合作用的抑制率達(dá)到70.34%，這說明該菌發(fā)酵產(chǎn)物對銅綠微囊藻的光合作用具有較強的抑制作用。

圖4 不同溫度和pH處理后的發(fā)酵上清液的溶藻效率Fig.4 Alga-lysing efficiencies of fermentation broth supernatant treated with different temperatures and pH values注：**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著，*和**分別表示未處理組與處理組在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。Note:** indicated the significant differences between the controls and the tests at the level P<0.01;* and ** indicated the significant differences between the untreated groups and the treated groups.

圖5 菌株JXJ 0170發(fā)酵產(chǎn)物的溶藻活性Fig.5 Alga-lysing activities of fermentation substances of strain JXJ 0170 注：A、B、C和D分別為乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水的提取物。Note:A,B,C and D,extracted by acetic ether,acetone,methanol and H2O,respectively.

圖6 菌株JXJ 0170代謝產(chǎn)物對藻細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.6 The influences of metabolites produced by strain JXJ 0170 on the morphology of algae cells 注：A和B分別為對照組和試驗組的藻細(xì)胞。Note:A and B are the cells in control and test groups,respectively.

2.5 孢子、發(fā)酵上清液和菌絲體的溶藻活性

2.5.1 孢子的溶藻活性

菌株JXJ 0170的孢子在藻平板上能夠萌發(fā)生長，并形成溶藻圈，隨后其生長范圍和溶藻圈直徑均逐漸擴大，15天后單菌落溶藻圈直徑為12.71 mm，25天后溶藻圈直徑達(dá)到29.42 mm，這說明該菌株孢子在缺乏有機碳源的組合培養(yǎng)基中能夠正常萌發(fā)、直接殺死藻細(xì)胞，并利用藻細(xì)胞裂解后釋放的有機物作為營養(yǎng)成分繼續(xù)生長，再產(chǎn)生溶藻活性成分，進(jìn)而發(fā)揮活性成分溶藻作用。

2.5.2 發(fā)酵上清液和菌絲體的溶藻活性

如圖7所示，發(fā)酵上清液和菌絲體均有良好的溶藻活性，且呈劑量效應(yīng)。當(dāng)上清液劑量為1.0%(V/V)，3天后藻細(xì)胞密度為2.8×106CFU/mL，是對照組1.31×107CFU/mL的21.37%，即溶藻效率為78.63%，當(dāng)劑量為3.0%時，溶藻效率達(dá)到96.70%；在藻液中加入0.5 g菌絲體，3天后溶藻效率為50.51%，當(dāng)使用劑量增到2.0 g時，溶藻效率達(dá)到93.39%。

2.6 發(fā)酵液對水生動物的毒性

試驗結(jié)果顯示，試驗組和對照組的鯽魚生長均正常，未出現(xiàn)死亡，這說明菌株JXJ 0170及其代謝產(chǎn)物對鯽魚的生長沒有不利影響，不會導(dǎo)致魚類中毒死亡。田螺試驗結(jié)果表明，試驗組和對照組的田螺死亡率分別為7.22%±1.92%和6.67%±3.00%，沒有顯著差異(P>0.05)，因此，菌株JXJ 0170及其發(fā)酵產(chǎn)物對軟體動物田螺也沒有顯著性致死作用。

2.7 野外防治試驗

如圖8所示，在試驗期間，試驗組池塘中的水沒有出現(xiàn)明顯顏色變化，水面水樣雖然有懸浮顆粒存在，但基本無色，且透明(圖8 A)；對照組池塘水的顏色逐漸變綠，其水面水樣深藍(lán)綠色，不透明，水面漂浮一層藍(lán)綠色的浮膜(圖8 B)。水面15～20 cm下的水樣，對照組葉綠素a含量在試驗期間，由起始0.008 8±0.001 6 mg/L逐漸增加到0.126 0±0.008 1 mg/L，而試驗組葉綠素a含量為0.005 8±0.000 3～0.023 7±0.000 5 mg/L(圖9)，只有對照組的6.20%～24.20%，對水華的防治效率為75.80%～93.80%。

圖7 菌株JXJ 0170發(fā)酵上清液和菌絲體的溶藻效率Fig.7 Alga-lysing efficiencies of fermentation broth supernatant and mycelia of actinomycete strain JXJ 0170注：1～3分別為1%、2%和3%的發(fā)酵上清液；4～7分別是濕重為0.5、1.0、1.5和2.0 g的菌絲體。**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著。Note:1-3 were the fermentation broth supernatant of 1%,2% and 3%,respectively;4-7 were mycelia of wet weight 0.5,1.0,1.5 g and 2.0 g,respectively.** indicated the significant differences between the test and control at the level P<0.01.

圖8 試驗組和對照組池塘的表面水樣顏色Fig.8 Surface water color of the ponds of the experimental group and control group 注：A和B分別為試驗組和對照組的池塘水面。Note:A and B and the surfaces of test and control ponds,respectively.

圖9 野外水華防治的試驗組和對照組葉綠素a含量Fig.9 The chlorophyll a contents of the experimental group and control group of water bloom prevention and cure in the wild注：**表示試驗組與對照組在P<0.01水平上差異顯著。Note:** indicated the significant differences between the test and the control at the level P<0.01.

3 討論與結(jié)論

放線菌JXJ 0170是鏈霉菌屬的成員，與該菌16S rRNA基因序列親緣關(guān)系最近的鏈霉菌均未見溶藻活性的報道，這說明該菌是一株新的溶藻鏈霉菌。

微生物一般可通過兩種作用方式溶藻：微生物細(xì)胞接觸藻細(xì)胞后導(dǎo)致藻細(xì)胞溶解，即直接溶藻[21]、通過分泌活性成分而導(dǎo)致藻細(xì)胞溶解，即間接溶藻[9]。目前文獻(xiàn)報道的放線菌一般通過分泌活性成分而發(fā)揮溶藻作用[9,11,15-18]。本研究表明，菌株JXJ 0170發(fā)酵上清液具有很強的溶藻活性，且具有一定的劑量效應(yīng)，這說明該菌能通過分泌活性成分而發(fā)揮間接溶藻作用；同時，該菌的菌絲體和孢子也具有很強的溶藻活性，特別是其孢子在藻平板上能夠萌發(fā)，并表現(xiàn)出良好的溶藻活性，這說明該菌亦具有直接溶藻作用。

目前文獻(xiàn)報道的鏈霉菌分泌的溶藻活性成分，多是熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性較好的非蛋白質(zhì)物質(zhì)[9,15-18]。菌株JXJ 0170分泌的溶藻活性成分對高溫和酸堿處理相對較穩(wěn)定，這說明該活性成分也是非蛋白質(zhì)性質(zhì)的，但具體是何種物質(zhì)還需要進(jìn)一步的研究。

鏈霉菌產(chǎn)生的溶藻活性化合物能夠促進(jìn)藻細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，抑制其抗氧化劑的合成，破壞葉綠素a、細(xì)胞膜和細(xì)胞壁[15]，最終導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡，本研究結(jié)果也證明了這一點。

Sigee等[10]研究表明，脫葉鏈霉菌(S.exfoliatus)RG12在實驗室可控條件下具有很強的溶藻活性，但在野外條件下，其溶藻活性大大降低，因而難以用來防治藍(lán)藻水華。本研究表明，菌株JXJ 0170無論在實驗室可控條件下，還是在野外全開放條件下，均具有較好的溶藻效果，且該菌的溶藻作用方式多樣，對魚類和軟體動物等水生經(jīng)濟(jì)動物生長沒有不良影響，因此，該菌在研制高效、環(huán)保的放線菌源藍(lán)藻水華防治劑方面具有較大的潛力。