韓子晗,孫 堯,楊富雅,高 冷

(長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,吉林長春 130012)

東北林蛙(RanatemporariachensinensisensisDavid),簡稱林蛙,又稱雪蛤,俗稱田雞、哈士蟆,屬兩棲綱、無尾目、蛙科、林蛙屬,廣泛分布于我國中北部,主產(chǎn)于我國黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古。中國林蛙體內(nèi)富含蛋白質(zhì)、糖類以及多種維生素和激素等營養(yǎng)成分[1],具有重要的保健功能[2]。林蛙卵是林蛙油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物之一,林蛙卵的年產(chǎn)量大且未能得到充分利用逐漸得到關(guān)注。林蛙卵油中含有豐富的不飽和脂肪酸成分[3-4],林蛙卵油具有抗驚厥[5]、抗焦慮[6]和調(diào)節(jié)血脂[7]等作用。近幾年,國外對于林蛙的研究微乎其微,對于林蛙卵油的研究尚未查閱到相關(guān)文獻(xiàn),國內(nèi)劉俊梅等[8]對林蛙卵的營養(yǎng)成分和保健功效進(jìn)行了系統(tǒng)分析,陳寧寧等[9]對林蛙卵油進(jìn)行成分分析,并利用脂肪酸的乳化性質(zhì)在化妝品領(lǐng)域進(jìn)行產(chǎn)品研制。

CO2是一種無毒、純度高、可再循環(huán)利用的溶劑,是超臨界流體提取技術(shù)最常用的溶劑[10-11]。與常見的有機(jī)溶劑提取法相比,超臨界流體提取物中沒有溶劑殘留,同時CO2的臨界壓力與臨界溫度較為溫和,提取過程可以在較低的壓力溫度下進(jìn)行,不會對熱敏性物質(zhì)產(chǎn)生影響,更不會引起部分物質(zhì)的氧化[12]。作為一種環(huán)境友好型技術(shù),超臨界流體提取被應(yīng)用于各種科學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[13]。楊小斌等[14]研究了超臨界二氧化碳萃取藍(lán)圓鲹魚油的工藝條件,探究了不同提取條件對藍(lán)圓鲹魚油提取率的影響;Nuria等[15]使用超臨界二氧化碳對魚油進(jìn)行提取,并與其它方法進(jìn)行了比較。

氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用靈敏度較高、抗干擾能力強(qiáng),在化學(xué)、生物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[16-18]。肖井雷等[19]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)的方法,對林蛙油中激素類成分進(jìn)行了測定。

本文采用超臨界CO2提取法從林蛙卵中提取林蛙卵油,以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),研究不同的提取因素對林蛙卵油提取率的影響,后續(xù)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和極差分析,得出各因素之間的交互作用,確定不同因素對林蛙卵油提取率的影響強(qiáng)弱,對最佳提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。采用GC-MS對林蛙卵油的成分進(jìn)行檢測分析,鑒定其主要成分,進(jìn)而對其進(jìn)行抗氧化活性研究[20-21],為更好地開發(fā)并利用林蛙卵油提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

林蛙卵 長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)室;正己烷 分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;氫氧化鈉、甲醇、乙醚、氫氧化鉀、無水乙醇、鹽酸、氯化鈉 分析純,北京化工廠;水楊酸、鄰苯三酚 分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工有限公司;硫酸亞鐵 分析純,廊坊科瑞化工有限公司;過氧化氫 分析純,西隴化工股份有限公司;Tris(生化試劑) 上海展云化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 分析純,合肥巴斯夫生物科技有限公司。

SCION SQ氣質(zhì)聯(lián)用儀 上海冉超光電科技有限公司;HA221-50-06超臨界CO2提取儀 江蘇華安科技有限公司;AE1012031紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;CO2鋼瓶(40 L) 沈陽鑫東基化工氣體有限公司;MixPlus漩渦振蕩器 南京東邁科技儀器有限公司;JE101電子天平 上海浦春計(jì)量儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 林蛙卵油的提取

1.2.1.1 原料預(yù)處理 將林蛙卵除雜后放至超聲波清洗儀(40 kHz,30 ℃下超聲清洗30 min)中清洗,再進(jìn)行真空干燥,相對真空度0.09 MPa,溫度90 ℃干燥至表面不含水分,使用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎,-20 ℃放置備用。

1.2.1.2 林蛙卵油提取工藝 稱取1 kg經(jīng)過預(yù)處理的干燥林蛙卵原料裝入提取釜中,加蓋擰緊,裝入反應(yīng)容器中,控制單因素實(shí)驗(yàn)條件,在一定的溫度、一定的壓力、一定的時間和一定的CO2流量進(jìn)行提取,通過收集林蛙卵油,計(jì)算提取率,確定最佳單因素范圍。

1.2.1.3 單因素實(shí)驗(yàn) a:提取溫度對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預(yù)處理過的林蛙卵原料,控制提取時間150 min,提取壓力30 MPa,CO2流量10 L/h恒定不變,改變提取溫度分別為40、45、50、55、60、65和70 ℃,提取林蛙卵油,研究提取溫度對林蛙卵油提取率的影響。

b:提取壓力對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預(yù)處理過的林蛙卵原料,控制提取時間150 min,提取溫度55 ℃,CO2流量10 L/h恒定不變,改變提取壓力分別為15、20、25、30、35、40和45 MPa,提取林蛙卵油,研究提取壓力對林蛙卵油提取率的影響。

c:提取時間對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預(yù)處理過的林蛙卵原料,控制提取溫度55 ℃,提取壓力30 MPa,CO2流量10 L/h恒定不變,改變提取時間分別為60、90、120、150、180、210和240 min,提取林蛙卵油,研究提取時間對林蛙卵油提取率的影響。

d:CO2流量對林蛙卵油提取率的影響:稱取1 kg預(yù)處理過的林蛙卵原料,控制提取時間150 min,提取溫度55 ℃,提取壓力30 MPa,改變CO2流量分別為4、6、8、10、12、14和16 L/h,提取林蛙卵油,研究CO2流量對林蛙卵油提取率的影響。

1.2.1.4 正交試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之上,篩選出對提取率影響較大的因素:提取溫度、提取壓力、提取時間、CO2流量,并以林蛙卵油提取率為檢驗(yàn)指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor and level of Orthogonal test L9(34)

1.2.1.5 林蛙卵油提取率測定方法 使用電子天平稱量出干燥林蛙卵的質(zhì)量,記為m2,使用超臨界CO2提取,提取完成稱量林蛙卵油質(zhì)量,記為m1,根據(jù)公式計(jì)算出林蛙卵油提取率X。林蛙卵油提取率公式為:

式(1)

式中,X:林蛙卵油的提取率(%);m1:林蛙卵油的質(zhì)量(g);m2:干燥林蛙卵的質(zhì)量(g)。

1.2.2 脂肪酸組成的檢測方法

1.2.2.1 林蛙卵油樣品前處理 準(zhǔn)確稱取提取后的林蛙卵油0.20 g,加入正己烷使林蛙卵油完全溶解并定容在10.00 mL容量瓶中,搖勻后用移液槍移取50 μL于10 mL試管中,加入0.4 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液2.00 mL后,放置在漩渦振蕩器中,振蕩2 min,放置10 min,再加入1.95 mL正己烷于試管中,將其放入旋渦振蕩器振蕩2 min,讓后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0%的氯化鈉溶液稀釋至10 mL,以2000 r/min離心10 min后吸出上清液于微量試管中,過0.45 μm的微孔濾膜過濾,再經(jīng)過三氟化硼法進(jìn)行脂肪酸的甲酯化處理[22],最后取1 μL樣品進(jìn)行GC-MS分析。

1.2.2.2 色譜條件 DB-5MS毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 μm×0.25 nm),進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫:90 ℃持續(xù)1 min,以5 ℃/min至140 ℃,再以以3 ℃/min至170 ℃,持續(xù)1 min,最后以10 ℃/min至250 ℃,持續(xù)5 min。載氣:高純氦氣;流量1 mL/min;分流比:40∶1。

1.2.2.3 質(zhì)譜條件 EI+離子源,離子能量70 eV;燈絲流量0.2 mA;離子源溫度:230 ℃;接口溫度:250 ℃;掃描質(zhì)量范圍:10～550 amu。

1.2.2.4 圖譜分析 GC-MS數(shù)據(jù)的定性分析:樣品經(jīng)過 GC-MS分析后,以峰的保留時間及譜庫檢索進(jìn)行定性分析,然后與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)峰面積進(jìn)行比較完成定量分析得出林蛙卵油主要的化學(xué)成份。

1.2.3 抗氧化活性

1.2.3.1 DPPH自由基清除率的測定 依據(jù)賀銀菊等[23]的描述,配制1 mmol/L的DPPH溶液,放置在4 ℃冰箱中備用。實(shí)驗(yàn)前,用無水乙醇將配制好的溶液稀釋至0.2 mmol/L使用。取1～8號試管中分別加入不同濃度的林蛙卵油作為實(shí)驗(yàn)組,9號試管作為對照組,依次測定在519 nm處的吸光度值。

DPPH自由基清除率(I,%)公式

I(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(2)

式中:A0為空白對照組的吸光度值;A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光度值。

1.2.3.2 羥基自由基清除率的測定 采用水楊酸乙醇-分光光度法[24]并做適當(dāng)改進(jìn),測定林蛙卵油對羥基自由基的清除能力,取1～8號為樣品組、9號為空白組、10～17號為不加顯色劑的對照組。1～8號試管中分別加入1 mL不同濃度的林蛙卵油,再依次加入1 mL的硫酸亞鐵溶液、1 mL的乙醇-水楊酸溶液,11 mL去離子水以及1 mL的過氧化氫溶液。向9號管中添加1 mL的硫酸亞鐵溶液、1 mL的乙醇-水楊酸溶液,12 mL去離子水以及1 mL的過氧化氫溶液。向10～17號管中分別添加1 mL的硫酸亞鐵溶液、1 mL的乙醇-水楊酸溶液,12 mL去離子水以及各濃度的林蛙卵油。水浴15 min后取出,在510 nm處依次測定反應(yīng)后各溶液吸光度值。

I(%)=[A0-(A1-AX)]/A0×100

式(3)

式中:A0為空白對照組的吸光度值;A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光度值;AX為不加顯色劑對照組的吸光度值。

1.2.3.3 超氧陰離子自由基清除率的測定 參考Siswoyo等[25]的方法,取1～8號試管中分別加入2 mL不同濃度的林蛙卵油作為實(shí)驗(yàn)組,9號試管中加入2 mL去離子水作為對照組,再加入5.0 mL Tris-HCl緩沖溶液,充分混勻,37 ℃水浴10 min,加入1.0 mL鄰苯三酚溶液,充分反應(yīng)6 min,迅速加入0.5 mL HCl終止反應(yīng)。依次測定反應(yīng)后各溶液在420 nm處的吸光度值。

超氧陰離子自由基清除率(I,%)公式:

I(%)=[(A0-A1)/A0]×100

式(4)

式中:A0為空白對照組的吸光度值;A1為實(shí)驗(yàn)樣品組的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2超臨界提取條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1A可以看出,溫度低于60 ℃時,提取溫度升高使分子間的熱運(yùn)動加劇,傳質(zhì)效率和擴(kuò)散系數(shù)增加,從而增加CO2流體的溶解度,提取率也隨之升高。而當(dāng)溫度高于60 ℃時,溫度升高,CO2流體的密度降低,導(dǎo)致其溶解能力降低,提取率也隨之降低[26]。因此溫度選擇為55、60、65 ℃。

由圖1B可以看出,在提取過程中當(dāng)壓力低于35 MPa時,CO2流體的密度隨著壓力的升高而增加,不斷接近林蛙卵油的密度而發(fā)揮CO2的脂溶性,根據(jù)相似相溶原理,林蛙卵油在CO2流體中的溶解度不斷增加,從而使提取率快速升高。當(dāng)壓力達(dá)到35 MPa時,繼續(xù)升高壓力,溶解度基本達(dá)到飽和狀態(tài),林蛙卵油的溶解量幾乎不再增加,提取率增加變緩,甚至不變[27]。因此提取壓力選擇為30、35、40 MPa。

由圖1C可以看出,當(dāng)提取時間小于150 min時,CO2流體對物料浸提不完全,提取率低,提取時間增加,CO2流體與物料充分接觸,使浸提充分,所以能迅速地提高提取率。當(dāng)提取時間達(dá)到150 min后,物料已基本被充分提取,再增加提取時間對提取率影響不大[28]。因此提取時間選擇為150、180、210 min。

由圖1D可以看出,當(dāng)CO2流量增大,提取釜入口處的CO2流速增大,提取釜中CO2的流動方向由于卷吸效應(yīng)發(fā)生彎曲,CO2流量越大,卷吸效應(yīng)越強(qiáng),使得提取釜中的原料與超臨界CO2充分反應(yīng),使提取速率不斷升高。當(dāng)CO2流量超過10 L/h時,提取率變化不大。因此CO2流量選擇為8、10、12 L/h。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The result of single factor experiment

根據(jù)圖1所示的曲線,從量化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)方面考慮,為了提高林蛙卵油的提取率,同時又降低能源損耗,選取提取溫度在55～65 ℃,最適提取壓力在30～40 MPa之間,最適提取時間在150～210 min之間,最適CO2流量在8～12 L/h之間。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用四因素三水平的的正交設(shè)計(jì)方案,在9種不同工藝條件下提取林蛙卵油,分別測定其提取率,結(jié)果見表2。表2的極差分析結(jié)果表明,超臨界提取4個因素對林蛙卵油提取率的影響順序?yàn)?提取壓力>提取溫度>CO2流量>提取時間。綜合考慮,林蛙卵油的最佳提取方案為A2B2C1D2,即最佳提取工藝條件組合為提取壓力35 MPa,提取溫度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取時間150 min。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

2.3 正交試驗(yàn)最佳提取條件驗(yàn)證

在上述最佳條件下(提取壓力35 MPa,提取溫度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取時間150 min)進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn),其林蛙卵油提取率分別為34.36%、34.18%和34.24%,得到平均提取率為34.26%±0.09%,由提取率可看出,最佳提取工藝條件具有較好的重復(fù)性,林蛙卵油提取率較高,說明該工藝條件是合理的、可靠的。

2.4 林蛙卵油成分分析結(jié)果

采用GC-MS分析法對CO2超臨界提取法所得到的林蛙卵油脂肪酸甲酯液進(jìn)行分析,得林蛙卵油油脂肪酸甲酯色譜圖,如圖5所示。同時采用面積歸一化法定量分析計(jì)算出各成分的相對含量,結(jié)果見表3。由表3可知,林蛙卵油中共鑒定出34種脂肪酸,其飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量分別為31.95%、68.05%。十六烷酸為7.65%、十六碳一烯酸為14.66%、十八碳烯酸(油酸)為27.94%、二十碳五烯酸(EPA)為8.85%及二十二碳六烯酸(DHA)為2.32%。

圖2 林蛙卵油脂肪酸甲酯色譜圖Fig.2 Fatty acids methyl esterschromatogram of Rana chensinensis egg oil

表3 林蛙卵油脂肪酸成分與含量Table 3 Compositions and contents offatty acids in Rana chensinensis egg oil

如圖3,VC清除DPPH自由基能力隨濃度升高而增加,當(dāng)VC濃度為0.8 mg/mL后繼續(xù)提高濃度清除率基本不發(fā)生改變;林蛙卵油清除DPPH能力隨林蛙卵油濃度增加而增加,當(dāng)林蛙卵油濃度為1.0 mg/mL后繼續(xù)提高林蛙卵油濃度清除率上升緩慢。使用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,得出VC對DPPH自由基清除能力IC50值為0.289 mg/mL,林蛙卵油對DPPH自由基清除能力IC50值為0.897 mg/mL。

圖3 林蛙卵油濃度對DPPH自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on DPPH free radicals

如圖4所示,VC清除羥基自由基能力隨濃度升高而增加,當(dāng)VC濃度為0.8 mg/mL時,清除率達(dá)到最大值,后繼續(xù)提高濃度清除率基本不發(fā)生改變;林蛙卵油清除羥基自由基能力隨林蛙卵油濃度增加而增加,當(dāng)林蛙卵油濃度為1.0 mg/mL時繼續(xù)提高林蛙卵油濃度清除率上升緩慢。使用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,VC對羥基自由基清除能力IC50值為0.317 mg/mL,林蛙卵油對羥基自由基清除能力IC50值為1.392 mg/mL。

圖4 林蛙卵油濃度對羥基自由基的清除效果Fig.4 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on hydroxyl free radicals

如圖5所示,VC清除超氧陰離子自由基能力隨濃度升高而增加,當(dāng)VC濃度為1.0 mg/mL后繼續(xù)提高濃度清除率基本不發(fā)生改變;林蛙卵油清除超氧陰離子自由基能力隨林蛙卵油濃度增加而增加,當(dāng)林蛙卵油濃度為1.0 mg/mL時繼續(xù)提高林蛙卵油濃度清除率上升緩慢。使用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,VC對超氧陰離子自由基清除能力IC50值為0.457 mg/mL,林蛙卵油對超氧陰離子自由基清除能力IC50值為1.687 mg/mL。

圖5 林蛙卵油濃度對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.5 Scavenging effect of Rana chensinensis egg oilconcentration on superoxide anion free radicals

通過與呂培霖等[29]研究的紅花籽油、樊梓鸞等[30]研究的紅松松針精油、梁美融等[31]研究的花椒精油相比,相同濃度的林蛙卵油抗氧化活性更加優(yōu)良。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定超臨界CO2法提取林蛙卵油的最佳提取工藝為:提取壓力35 MPa,提取溫度60 ℃,CO2流量10 L/h,提取時間150 min,此時林蛙卵油的提取率為34.26%。在此條件下采用GC-MS分析法對林蛙卵油脂肪酸甲酯液的成分進(jìn)行檢測,確定其含有34種脂肪酸,其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對含量分別為31.95%和68.05%,主要脂肪酸有十六烷酸、十六碳一烯酸、十八碳烯酸、十八碳二烯酸、二十碳五烯酸(EPA)及二十二碳六烯酸(DHA)。通過抗氧化活性研究試驗(yàn)表明,林蛙卵油對DPPH自由基的IC50值為0.897 mg/mL,對羥基自由基的IC50值為1.392 mg/mL,對超氧陰離子的IC50值為1.687 mg/mL。林蛙卵油具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性,在天然抗氧化劑和保健食品中有良好的開發(fā)利用價值。