王瑞琪,陳 鋼,闕發(fā)秀,朱宏林,郭月山,簡素平

(南昌大學,食品科學與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)是一種典型的模式真菌,被廣泛應(yīng)用于遺傳學、生物化學及分子生物學等領(lǐng)域的研究[1]。經(jīng)過兩百多年的研究發(fā)現(xiàn),粗糙脈孢菌可在多種類型的培養(yǎng)基上快速生長,且沒有檢測到霉菌毒素的生成[2]。在不同條件下對粗糙脈孢菌進行培養(yǎng)可生成多種代謝產(chǎn)物,番茄紅素是其中之一。據(jù)報道,番茄紅素具有抗氧化、抗菌和消炎等生理活性[3],其中較強的抗氧化能力有利于降低癌癥[4]、心血管疾病[5]等的風險,因此在工業(yè)上常作為重要的營養(yǎng)補充劑、食品著色劑及飼料添加劑等[6]。

目前,番茄紅素的提取方法主要包括有機溶劑提取法[7]、超聲輔助萃取法[8]及微波輔助萃取法[9]等。盡管操作簡便,但由于番茄紅素是一種親脂性物質(zhì),易被菌體細胞內(nèi)的脂肪酸甘油酯及游離脂肪酸等脂溶性物質(zhì)束縛[10],通過傳統(tǒng)的提取方法難以使萃取介質(zhì)完全進入生物質(zhì)內(nèi)部,得到的番茄紅素亦含有脂溶性物質(zhì)等雜質(zhì),從而造成得率及純度均不高[11]。為解決這些問題,廉博[12]提出先用皂化反應(yīng)進行前處理,再用有機溶劑浸提的方法,結(jié)果表明通過該法得到的黏紅酵母番茄紅素得率比不皂化時提高了20.3%。皂化反應(yīng)不僅可以破壞脂肪酸甘油酯的酯鍵,形成水溶性的脂肪酸鹽和甘油,讓番茄紅素充分釋放出來[13];而且,堿性皂化劑對細胞壁具有破壞作用,可提高有機溶劑的萃取率[14];還有研究表明,在堿性環(huán)境下進行皂化反應(yīng)不會造成由于結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而引起的有效成分破壞[15]。因此,通過皂化反應(yīng)對番茄紅素提取具有多方面重要的積極作用,但是關(guān)于皂化反應(yīng)對粗糙脈孢菌番茄紅素提取的研究還較少。

本研究通過皂化反應(yīng)結(jié)合有機溶劑對粗糙脈孢菌番茄紅素進行提取,研究了皂化溫度、皂化時間及NaOH濃度對得率的影響,通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化得到最佳皂化提取條件,并對粗糙脈孢菌番茄紅素進行了體外抗氧化活性測定,為粗糙脈孢菌番茄紅素的提取及其開發(fā)利用提供了新的思路及理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)3.1607 本實驗室保藏;種子培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基(%):葡萄糖54.54,蛋白胨36.36,NaNO35.45，MgSO40.91,KCl 0.91,FeSO40.02,K2HPO41.82,121 ℃滅菌20 min;乙酸乙酯 分析純,天津市大茂化學試劑廠;丙酮 分析純,上海試劑化學有限公司;乙腈、二氯甲烷 色譜純,德國Merck公司;番茄紅素標準品 純度≥98%,北京Solarbio公司;抗壞血酸、維生素E 分析純,北京Solarbio公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、β-胡蘿卜素、鄰苯三酚、三羥基氨基甲烷(Tris)、水楊酸等 均為國產(chǎn)分析純。

VD-650型凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;ZHP-160智能恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學儀器有限公司;WZF-UV-2000紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;Agilent 1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 將4 ℃保藏的粗糙脈孢菌接種于PDA培養(yǎng)基上于30 ℃活化培養(yǎng)48 h,挑取2環(huán)至30 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中混勻制得孢子懸浮液(105個/mL),以5%的接種量接種到裝有50 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,于30 ℃振蕩(110 r/min)培養(yǎng)19 h后靜止培養(yǎng)87 h,全程光照。發(fā)酵結(jié)束后離心(8000 r/min,5 min)去除發(fā)酵液,蒸餾水洗滌三次后收集菌體,于45 ℃鼓風干燥箱中烘干至恒重,密封避光于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 皂化提取番茄紅素工藝 稱取0.1 g烘干后的菌體,加入適量石英砂混合后充分研磨至粉末狀,加入2 mL NaOH溶液(0.10 mol/L)后置于50 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)30 min。皂化反應(yīng)結(jié)束后通過鹽酸(1 mol/L)調(diào)節(jié)pH至中性,離心(4500 r/min,10 min)去除上清液后用無水乙醇洗滌脫水。再加入10 mL乙酸乙酯-丙酮溶液(2∶3,V:V),先超聲萃取20 min(200 W,40 kHz,25 ℃),再于30 ℃水浴鍋中暗室提取2.5 h,離心(6000 r/min,10 min)得到上清的色素浸提液,適當稀釋后經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,于HPLC檢測番茄紅素含量。

1.2.3 番茄紅素含量的測定方法 Agilent Ecllpse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm);流動相為乙腈-二氯甲烷溶液(60∶40,V∶V);流速1 mL/min;柱溫28 ℃;進樣量10 μL;檢測波長472 nm;運行時間10 min。

1.2.4 番茄紅素標準曲線的繪制 精確稱取番茄紅素標準品1.00 mg,用乙酸乙酯-丙酮溶液(2∶3,V∶V)定容至10 mL容量瓶中,搖勻,即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標準品母液。將母液逐步稀釋配制成80、60、40、20、0 μg/mL的標準溶液。在“1.2.3”檢測條件下進行測定,以番茄紅素質(zhì)量濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標進行線性回歸分析,得到番茄紅素質(zhì)量濃度標準曲線:y=24.246x+51.938,R2=0.9988。

1.2.5 番茄紅素得率的計算 根據(jù)式(1)計算番茄紅素得率(Y)。

Y(mg/g)=((y-51.938)/24.246)×(V/m)×10-3

式(1)

式中:y表示番茄紅素峰面積,mAU·s;V表示樣品浸提稀釋液總體積,mL;m表示干菌體質(zhì)量,g。

1.2.6 單因素實驗 依據(jù)“1.2.2”提取方法,研究皂化溫度、皂化時間及NaOH濃度三個因素對番茄紅素得率的影響。

1.2.6.1 皂化溫度對番茄紅素得率的影響 在皂化時間為30 min,NaOH濃度為0.10 mol/L的條件下,考察皂化溫度為20、30、40、50、60、70 ℃對番茄紅素得率的影響。

1.2.6.2 皂化時間對番茄紅素得率的影響 在皂化溫度為60 ℃,NaOH濃度為0.10 mol/L的條件下,考察皂化時間為10、20、30、40、50 min對番茄紅素得率的影響。

1.2.6.3 NaOH濃度對番茄紅素得率的影響 在皂化溫度為60 ℃,皂化時間為20 min的條件下,考察NaOH濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16 mol/L對番茄紅素得率的影響。

1.2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在“1.2.6”單因素實驗的基礎(chǔ)上,以番茄紅素得率為響應(yīng)值,依據(jù)Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計原理,通過Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化確定皂化溫度、皂化時間及NaOH濃度三個因素對番茄紅素提取的最佳工藝條件。試驗因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素和水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.8.1 番茄紅素待測樣品液的制備 稱取1.0 g烘干的粗糙脈孢菌菌體,依據(jù)最優(yōu)皂化條件進行前處理后,加入20 mL乙酸乙酯-丙酮溶液(2∶3,V∶V),先超聲萃取20 min,后于30 ℃水浴鍋中暗室提取2.5 h,離心(6000 r/min,10 min)得到上清液色素浸提液,于30 ℃進行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,得到番茄紅素提取物,密封避光于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時稱取一定質(zhì)量的番茄紅素,通過二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解制備得到待測樣品溶液。

1.2.8.2 DPPH·清除能力測定 參考Herchi等[16]的方法并稍作修改。分別取0.5 mL濃度為10、30、50、100、150、200、250 μg/mL的樣品溶液,與2.5 mL濃度為2.5×10-5mol/L的DPPH-乙醇溶液充分混勻,于室溫下避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度值。

根據(jù)式(2)測定各樣品溶液對DPPH·的清除率。

清除率(%)=[1-(A-A1)/A0]×100

式(2)

式中,A為各試驗組吸光度值;A0為試劑空白吸光度值,即以去離子水代替樣品溶液;A1為試液空白吸光度值,即以去離子水代替自由基溶液。

以相同濃度梯度的VC、VE及β-胡蘿卜素樣品溶液按上述方法測定對DPPH·的清除率。其中,VC用去離子水溶解,VE及β-胡蘿卜素用DMSO溶解。

1.2.8.4 ·OH清除能力測定 根據(jù)Fenton法測定樣品對·OH的清除能力,參考Liu等[18]的文獻內(nèi)容并稍作修改。分別取1.5 mL濃度為50、100、200、400、600、800、1000、1200 μg/mL的樣品溶液,再加入1.5 mL FeSO4溶液(9.0 mmol/L)及1.5 mL水楊酸-乙醇溶液(9.0 mmol/L),振蕩混勻后立即加入1.5 mL H2O2溶液(8.8 mmol/L),再次混勻后于37 ℃下反應(yīng)30 min,在510 nm波長處測定反應(yīng)體系的吸光度值。

按式(2)計算各樣品溶液對·OH的清除率。測定相同濃度梯度的VC、VE及β-胡蘿卜素樣品溶液對·OH的清除率。

1.2.8.5 FRAP法測定抗氧化能力 參考Xiong等[19]的試驗方法并稍作修改。制備300 mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液及20 mmol/L FeCI3溶液,按10∶1∶1配制FRAP工作液。分別取40 μL濃度為20、40、60、80、100、120、140 μg/mL的樣品溶液及3 mL FRAP工作液,充分混勻后于暗處反應(yīng)20 min,在593 nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度值。

按照上述方法,以0.1～1.8 mmol/L的FeSO4標準溶液代替樣品溶液繪制標準曲線,得到回歸方程:y=0.2598x+0.0271,R2=0.9995。試驗結(jié)果通過各樣品溶液所測得的吸光度值,根據(jù)標準曲線回歸方程計算出其相對應(yīng)的FeSO4濃度(mmol/L),即定義為FRAP值,FRAP值越大,表明其抗氧化活性越強。

以相同濃度梯度的VC、VE及β-胡蘿卜素樣品溶液按上述方法測定FRAP值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均進行三次平行,測定結(jié)果以平均值±標準差表示,應(yīng)用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA分析,采用Duncan法進行多重比較檢驗,P<0.05表示具有顯著性差異。通過Excel 2013作圖,并采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 皂化溫度對番茄紅素得率的影響 由圖1可知,粗糙脈孢菌番茄紅素得率明顯受皂化溫度影響。隨著溫度升高,得率上升,當反應(yīng)溫度為60 ℃時,得率達到最大(1.183±0.006) mg/g,當溫度繼續(xù)升高至70 ℃時,其與60 ℃條件下的得率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。實際上,皂化反應(yīng)是一個吸熱過程,當溫度較低時,其反應(yīng)速度和傳質(zhì)速度均較低,并且其熱效應(yīng)不足以破壞生物質(zhì)細胞壁以更好的滲透浸提溶液,導(dǎo)致皂化反應(yīng)不充分,繼而造成番茄紅素得率不高[13,20]。因此,溫度的升高可為分子反應(yīng)提供足夠的能量,提高脂質(zhì)轉(zhuǎn)化動力學,促進番茄紅素從脂質(zhì)中釋放出來[20]。但是番茄紅素是一種熱敏性物質(zhì),在較高溫度下會發(fā)生氧化分解;同時,番茄紅素在高溫下可能由反式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)為順式結(jié)構(gòu),影響其品質(zhì),降低其抗氧化活性[21]。綜合考慮選擇60 ℃用于響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖1 皂化溫度對番茄紅素得率的影響Fig.1 Effect of saponification temperatureon the extraction yield of lycopene注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05);圖2、圖3同。

2.1.2 皂化時間對番茄紅素得率的影響 由圖2可知,當時間小于20 min時,番茄紅素得率隨著時間的增加而增加;當反應(yīng)時間為20 min時,其得率顯著高于其它試驗組(P<0.05);當延長反應(yīng)時間,得率大幅下降,可能是由于番茄紅素被氧化分解的可能性大大增加。研究表明,反應(yīng)時間對皂化反應(yīng)的影響是復(fù)雜的,受皂化試劑濃度及溫度的影響,當堿溶液濃度或溫度較高時,需選擇較短的反應(yīng)時間以減弱對易分解物質(zhì)的破壞作用[13]。因此,選擇反應(yīng)時間20 min用于響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖2 皂化時間對番茄紅素得率的影響Fig.2 Effect of saponification timeon the extraction yield of lycopene

2.1.3 NaOH濃度對番茄紅素得率的影響 據(jù)報道,堿性催化劑比酸性催化劑能更有效地誘導(dǎo)皂化反應(yīng),并且其比酸性催化劑在皂化時所需溶液體積更少[22],因此選用NaOH作為皂化反應(yīng)的催化劑。由圖3可知,在試驗濃度范圍內(nèi),番茄紅素得率呈先升高后下降的變化趨勢。當NaOH濃度為0.06 mol/L時,番茄紅素得率達到最大(1.613±0.014) mg/g,比未皂化組(1.170±0.013) mg/g提高了37.86%,同時發(fā)現(xiàn)其得率顯著高于其他試驗組(P<0.05);同樣地,孫協(xié)軍等[23]通過皂化前處理提取β-胡蘿卜素,其得率提高了21.43%。番茄紅素通常儲存于中性脂質(zhì)中,NaOH可與甘油三酯及游離脂肪酸通過皂化反應(yīng)形成鈉鹽而溶于水相,將番茄紅素釋放為游離態(tài)[24]。同時,NaOH濃度的增加有利于破壞細胞壁結(jié)構(gòu),促進有機溶劑進入生物質(zhì)內(nèi)部對番茄紅素進行浸提[14]。但是,強堿環(huán)境對番茄紅素具有破壞作用,可能致其得率降低[25]。因此,選擇NaOH濃度0.06 mol/L用于響應(yīng)面試驗設(shè)計。

圖3 NaOH濃度對番茄紅素得率的影響Fig.3 Effect of NaOH concentrationon the extraction yield of lycopene

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗分析

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計方案及試驗結(jié)果 依據(jù)“2.1”單因素實驗結(jié)果,通過Design-Expert 8.0.6軟件,以番茄紅素得率(Y)為指標,對皂化溫度(A)、皂化時間(B)及NaOH濃度(C)進行3因素3水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗,共17個試驗點,包含12個析因子及5個中心點。設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 The results of response surface methodology

2.2.2 模型的建立及方差分析 通過Design Expert 8.0.6軟件對表2中試驗結(jié)果進行多元回歸擬合,得到以番茄紅素得率為響應(yīng)值的回歸方程:

Y=1.62-0.059A+0.047B+0.061C+0.022AB+0.00975AC-0.00175BC-0.14A2-0.15B2-0.16C2

表3 響應(yīng)面模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface model

2.2.3 各因素間交互作用分析 響應(yīng)面圖和等高線圖可形象地反映各因素間的相互作用及最佳參數(shù)。等高線圖呈橢圓形表示交互作用顯著,呈圓形表示交互作用不顯著。由圖4a可知,在NaOH濃度為0.06 mol/L條件下,當皂化溫度在54.0～62.5 ℃范圍內(nèi),皂化時間在17～26 min范圍內(nèi),番茄紅素得率達到峰值,等高線圖呈橢圓形,表明這兩因素間交互作用顯著;圖4b為皂化時間恒定于20 min,NaOH濃度和皂化溫度對得率的影響。當NaOH濃度在0.055～0.072 mol/L范圍內(nèi),皂化溫度在54～63 ℃范圍內(nèi),番茄紅素得率達到峰值,等高線圖呈圓形,表示此兩因素間交互作用不顯著;當皂化溫度恒定為60 ℃時,NaOH濃度和皂化時間對得率的影響如圖4c所示,在NaOH濃度在0.055～0.072 mol/L及時間在17.5～26.0 min范圍內(nèi),兩者的共同作用下,番茄紅素得率達到最大值,等高線圖呈圓形,表明這兩因素間交互作用不顯著。

圖4 番茄紅素得率的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface stereogram of the extraction yield of lycopene

2.2.4 皂化提取番茄紅素最佳工藝參數(shù)的確定 通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到皂化提取番茄紅素的最佳條件為:NaOH濃度0.06 mol/L,皂化溫度58.05 ℃及皂化時間21.41 min,番茄紅素得率的預(yù)測值為1.634 mg/g。對優(yōu)化后的參數(shù)進行驗證試驗,考慮到操作的方便性,將試驗條件修改為:NaOH濃度0.06 mol/L,皂化溫度58 ℃及皂化時間21 min,通過三次平行試驗得到番茄紅素得率為(1.620±0.011) mg/g,與模型預(yù)測結(jié)果基本一致,比未皂化組(1.170±0.013) mg/g提高了38.46%。

2.3 體外抗氧化分析結(jié)果

2.3.1 番茄紅素提取物對DPPH·清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的深紫色自由基,抗氧化劑可通過電子配對中和DPPH·從而發(fā)生顯色變化,是最常用的抗氧化活性測定方法之一[26]。由圖5可知,在試驗濃度范圍內(nèi),各物質(zhì)對DPPH·的清除能力均隨濃度的增大而增強,其清除能力順序為β-胡蘿卜素>番茄紅素提取物>VC>VE。盡管粗糙脈孢菌番茄紅素的清除能力低于β-胡蘿卜素,但是β-胡蘿卜素的抗氧化能力會隨著外界條件的變化而變化,消失甚至轉(zhuǎn)化為促氧化功能[27]。在此試驗中,粗糙脈孢菌番茄紅素最大清除率達86.43%,表明了對DPPH·具有較好的清除能力。

圖5 四種物質(zhì)對DPPH·清除效果Fig.5 Scavenging effects of the four substances on DPPH·

圖6 四種物質(zhì)對清除效果Fig.6 Scavenging effects of the four substances on

2.3.3 番茄紅素提取物對·OH清除能力 ·OH是目前所知活性氧中活性最強的自由基,它能破壞細胞內(nèi)大部分的生物大分子[31]。如圖7所示,在試驗濃度范圍內(nèi),各物質(zhì)對·OH的清除率與其濃度呈正相關(guān)性,其清除能力順序為β-胡蘿卜素>番茄紅素提取物>VC>VE,此與DPPH·清除能力表現(xiàn)一致。有研究報道,類胡蘿卜素更易通過自由基加成反應(yīng)機制與自由基反應(yīng),即自由基通過直接加成至類胡蘿卜素的共軛雙鍵上形成一種新的化合物,從而達到清除自由基的目的[32]。盡管粗糙脈孢菌番茄紅素對·OH清除能力比β-胡蘿卜素弱,但最大清除率達85.83%,表明其對·OH具有較好的清除能力。

圖7 四種物質(zhì)對·OH清除效果Fig.7 Scavenging effects of the four substances on ·OH

2.3.4 FRAP法測定番茄紅素提取物的抗氧化能力 FRAP法是一種非自由基氧化還原電位法來測定物質(zhì)的抗氧化活性。由圖8可知,各物質(zhì)的抗氧化能力順序為β-胡蘿卜素>VC>番茄紅素提取物>VE,粗糙脈孢菌番茄紅素表現(xiàn)出較小的抗氧化能力,此與其它抗氧化試驗結(jié)果差異較大。一方面可能是由于此種測定方法其本身與其它測定方法存在很弱的關(guān)聯(lián);另一方面在此反應(yīng)體系中,為保持鐵離子的溶解性及驅(qū)動電子轉(zhuǎn)移,是在酸性條件下進行的(pH=3.6),而酸性環(huán)境對番茄紅素穩(wěn)定性有顯著的破壞作用[33-34]。

圖8 四種物質(zhì)抗氧化能力的測定(FRAP法)Fig.8 Determination of antioxidant capacity offour substances(FRAP method)

3 結(jié)論