曲 航,高 鑫,伊娟娟,王振宇,*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150001;2.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450001)

巨噬細(xì)胞源自單核細(xì)胞,是一類重要的免疫細(xì)胞,具有多種生理功能。巨噬細(xì)胞依靠其特有的吞噬功能,在特異性免疫和非特異性免疫中均發(fā)揮著十分重要的作用。當(dāng)病原微生物等外源物質(zhì)進(jìn)入人體,會(huì)迅速與相應(yīng)的抗體形成抗原抗體復(fù)合物,而巨噬細(xì)胞可以準(zhǔn)確識(shí)別并吞噬這類復(fù)合物,引起免疫應(yīng)答反應(yīng)[1]。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要組成,在細(xì)菌死亡或人為破壞菌的條件下才得以釋放。LPS對(duì)宿主是有毒性的,其毒性作用主要源于類脂質(zhì)A[2]。巨噬細(xì)胞在LPS的誘導(dǎo)下,不僅細(xì)胞增殖能力和吞噬能力明顯增強(qiáng),還會(huì)釋放大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),如一氧化氮(nitric oxide,NO)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等。這些介質(zhì)會(huì)對(duì)病原微生物的入侵產(chǎn)生抵御作用,過(guò)量分泌則會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)[3-4]。炎癥本身是機(jī)體對(duì)外源刺激的一種防御或免疫反應(yīng),但過(guò)度或持續(xù)性炎癥會(huì)引發(fā)多種炎癥相關(guān)性疾病[5]。

多糖是廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中的一類碳水聚合物[6]。作為天然大分子物質(zhì),多糖具有來(lái)源廣泛、低毒副作用、多靶點(diǎn)、高生物活性等優(yōu)勢(shì),因而逐漸成為功能食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外對(duì)多糖生理活性的大量報(bào)道證明多糖具有抗氧化作用[7]、免疫調(diào)節(jié)作用[8]、降脂[9]、降血糖作用[10]、保肝作用[11]、抗菌作用[12]和抗腫瘤[13]等諸多生理功能。紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)是我國(guó)東北地區(qū)特有的名貴木材,其種子紅松松仁是藥食同源類堅(jiān)果。早在《本草綱目》中就有相關(guān)記載“松仁性溫、味甘、無(wú)毒、主治關(guān)節(jié)風(fēng)濕、頭眩、潤(rùn)五臟、逐風(fēng)痹寒氣、補(bǔ)體虛、滋潤(rùn)皮膚、久服輕身不老”[14]。紅松松仁中富含不飽和脂肪酸、氨基酸、多肽和多糖等生物活性分,在抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等方面具有重要作用[15]。前期研究中,課題組從紅松松仁提取出一種生物活性多糖PNP40c-1[11],本研究以小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞系(RAW264.7巨噬細(xì)胞系)為研究對(duì)象,采用LPS進(jìn)行誘導(dǎo),旨在研究PNP40c-1對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用,并探討其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松仁多糖PNP40c-1 實(shí)驗(yàn)室分離純化制得;小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7 黑龍江省腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心;RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基 美國(guó)Hyclone公司;新生胎牛血清FBS 美國(guó)Clark公司;胰蛋白酶(1∶250)、PBS粉末、雙抗(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)、LPS、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、中性紅活細(xì)胞染色液(0.33%) 北京索萊寶科技有限公司;NO檢測(cè)試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;TNF-α、IL-1β、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒 泉州科諾迪生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、內(nèi)參(β-actin)抗體、核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor(erythroid-derived2)-like 2 protein,Nrf2)抗體、血紅素氧化酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體 沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司;RNA提取試劑盒(9767)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR047A) 日本TAKARA公司;定量試劑盒 美國(guó)Bio-Rad公司;其余試劑 均為市售分析純。

Bio-Rad-500酶標(biāo)儀、CFX96 熒光定量PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司;XDS-1B倒置顯微鏡 重慶重光實(shí)業(yè)有限公司;Vert.A1熒光顯微鏡 德國(guó)Axio公司;SW-CJ-1F單人雙面超凈工作臺(tái) 香港藍(lán)豹科技有限公司;TDZ4A-WS低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘麓離心機(jī)儀器有限公司;W205恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術(shù)有限公司;DSX-280B高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;BSA224S分析天平 德國(guó)Satorius科學(xué)儀器有限公司;細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞孔板 美國(guó)Corning公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清FBS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每48 h更換一次培養(yǎng)液。采用胰蛋白酶法消化細(xì)胞,待細(xì)胞開(kāi)始變圓時(shí),終止消化,加入細(xì)胞培養(yǎng)液,輕輕吹打至細(xì)胞完全脫落,收集細(xì)胞懸液,1000 r/min離心5 min后棄上清。再次加入細(xì)胞培養(yǎng)液使細(xì)胞重新懸浮,按1∶3比例將細(xì)胞接種至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)[16]。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞,以1×104個(gè)/孔接種到96孔板中,每孔100 μL。待細(xì)胞完全貼壁后,分別加入25、50、100、200和400 μg/mL的PNP40c-1溶液各5 μL,每組10個(gè)復(fù)孔;空白組加入同等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液,孵育24 h后,加入10 μL MTT溶液(5 g/L),繼續(xù)孵育4 h,然后棄上清,加入150 μL DMSO溶解紫色結(jié)晶,5 min后,用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)下的OD值,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 吞噬能力的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔接種到96孔板中,每孔100 μL。待細(xì)胞完全貼壁后,進(jìn)行分組處理?？瞻捉M:不做任何處理;LPS對(duì)照組:加入10 μg/mL LPS溶液;多糖處理組:分別加入25、50、100和200 μg/mL PNP40c-1溶液;多糖+LPS處理組:分別加入25、50、100和200 μg/mL PNP40c-1和10 μg/mL LPS溶液,每組10個(gè)復(fù)孔。孵育24 h后,向每孔中加入預(yù)先稀釋好的0.1%中性紅染液,繼續(xù)孵育30 min后,棄上清液。用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.4)反復(fù)沖洗三次,然后向各孔中加入200 μL細(xì)胞裂解液,裂解30 min后棄裂解液,將96孔板在4 ℃下放置過(guò)夜[5]。各孔在540 nm波長(zhǎng)下的OD值采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定;中性紅吞噬率按式(1)計(jì)算。

式(1)

式中:A1表示空白組的OD值;A2表示處理組的OD值(包括LPS、多糖和多糖+LPS各處理組)。

1.2.4 NO和一氧化氮合酶的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞,以1×105個(gè)/孔接種到96孔板中,每孔100 μL。細(xì)胞的分組及處理方法同1.2.3。待細(xì)胞孵育24 h后,根據(jù)NO試劑盒的操作說(shuō)明采用Griess法測(cè)定各孔培養(yǎng)液上清中NO的含量。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞,以1×106個(gè)/孔接種到24孔板中,每孔1 mL。細(xì)胞的分組及處理方法同1.2.3。待細(xì)胞孵育24 h后,收集上清液,按照一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)試劑盒的說(shuō)明測(cè)定各孔上清液的OD值,并計(jì)算iNOS酶活力。

1.2.5 酶聯(lián)免疫法測(cè)定細(xì)胞因子含量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞,以1×106個(gè)/孔接種到24孔板中,每孔1 mL。細(xì)胞的分組及處理方法同1.2.3。待細(xì)胞孵育24 h后,收集上清液,分別按照TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒的操作說(shuō)明,測(cè)定各OD值,并分別計(jì)算各組細(xì)胞中分泌細(xì)胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)的含量。

1.2.6 RT-PCR法測(cè)定mRNA表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞,以3×106個(gè)/孔接種到6孔板中,每孔2 mL。細(xì)胞的分組及處理方法同1.2.3。待細(xì)胞孵育24 h后,棄培養(yǎng)液,收集細(xì)胞,采用試劑盒提取細(xì)胞中RNA,然后依次按照試劑盒的操作步驟合成cDNA并進(jìn)行PCR的擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)(見(jiàn)表1),深圳華大基因公司進(jìn)行合成。每次擴(kuò)增均以β-actin基因作為內(nèi)參,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析和比較。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers used for RT-PCR

1.2.7 蛋白免疫印跡(Western Blot)測(cè)定蛋白表達(dá) RAW264.7細(xì)胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)情況采用Western Blot法進(jìn)行測(cè)定。細(xì)胞的分組及處理方法同1.2.3,待培養(yǎng)結(jié)束后棄上清,用預(yù)冷PBS洗滌三次,使用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上裂解蛋白。離心取上清,按照二奎琳甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒的操作說(shuō)明對(duì)所提取的蛋白進(jìn)行定量。滅活后采用聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)分離蛋白,濕轉(zhuǎn)后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,再采用5%脫脂牛奶進(jìn)行封閉,2 h后加入一抗(Nrf2、HO-1和β-actin),于4 ℃下孵育過(guò)夜。緩沖液洗膜后,加二抗(IgG-HRP)共孵育1 h后進(jìn)行ECL顯影。以β-actin為內(nèi)標(biāo),定量分析各組細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

利用MTT法測(cè)定不同濃度的PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響,結(jié)果如圖1所示。PNP40c-1作用濃度在25～200 μg/mL范圍時(shí),細(xì)胞活力有明顯增加趨勢(shì),說(shuō)明該多糖對(duì)巨噬細(xì)胞無(wú)毒性,且對(duì)其增殖活力無(wú)顯著影響(P>0.05);但當(dāng)濃度為400 μg/mL時(shí),細(xì)胞活力與空白組相比有顯著下降(P<0.05),說(shuō)明過(guò)高劑量的PNP40c-1會(huì)抑制RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng),存在細(xì)胞毒性。因此,選取PNP40c-1的濃度為25～200 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of PNP40c-1 at differentconcentrations on RAW264.7 cell viability注:*:P<0.05,表示與空白組差異顯著。

2.2 PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

吞噬作用是評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞活力的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo),也是巨噬細(xì)胞最基本的防衛(wèi)機(jī)制之一,在非特異性免疫防護(hù)中具有重要作用[3]。如圖2所示,在正常情況下,PNP40c-1在濃度25～200 μg/mL范圍下,能夠極顯著提高巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力(P<0.01),且呈劑量依賴關(guān)系。LPS作為一種炎癥刺激物,可極顯著增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力(P<0.01),其效果明顯優(yōu)于PNP40c-1;但從圖2中可以發(fā)現(xiàn),相比于LPS單獨(dú)預(yù)處理的細(xì)胞,PNP40c-1+LPS預(yù)處理細(xì)胞的吞噬能力有極顯著下降(P<0.01),但仍高于PNP40c-1單獨(dú)預(yù)處理組和空白組。結(jié)果與Xiong 等[5]的報(bào)道相一致。因此可以說(shuō)明,PNP40c-1能夠刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞,提高其吞噬能力,起到免疫調(diào)節(jié)作用。

圖2 PNP40c-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.2 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPSon phagocytosis of RAW264.7 cells注:*P<0.05表示與空白組差異顯著;**P<0.01表示與空白組差異極顯著;#P<0.05表示與LPS組差異極顯著;##P<0.01表示與LPS組差異極顯著;圖3～圖9同。

2.3 PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO及iNOS的影響

2.3.1 PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響 NO作為一種重要的信號(hào)傳導(dǎo)介質(zhì),參與多種生理活動(dòng)和病理過(guò)程,其與免疫系統(tǒng)存在密切關(guān)系。NO在免疫調(diào)節(jié)方面具有雙重作用,一方面NO是不可或缺的調(diào)節(jié)因子;另一方面,過(guò)量NO會(huì)誘導(dǎo)炎性因子的產(chǎn)生,引起炎癥,導(dǎo)致組織損傷[17]。如圖3所示,在正常情況下,100和200 μg/mL的PNP40c-1可以顯著刺激巨噬細(xì)胞分泌NO(P<0.05);而當(dāng)LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞過(guò)量分泌NO時(shí),PNP40c-1又能夠極顯著抑制NO的產(chǎn)生(P<0.01),且在濃度范圍25～200 μg/mL內(nèi)該抑制作用呈劑量依賴性。PNP40c-1+LPS預(yù)處理組NO的分泌水平仍要明顯高于PNP40c-1單獨(dú)預(yù)處理組。結(jié)果表明,PNP40c-1在正常情況下可以刺激RAW264.7細(xì)胞少量分泌NO,起到防御和保護(hù)作用;而在LPS誘導(dǎo)炎癥情況下,則能夠抑制NO的過(guò)量產(chǎn)生,起到抗炎作用。

圖3 PNP40c-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響Fig.3 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPSon the secretion of NO in RAW264.7 cells

2.3.2 PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS的影響 在巨噬細(xì)胞中,NO的合成主要依賴于誘導(dǎo)型NOS,即iNOS;iNOS是在應(yīng)激狀態(tài)下催化生成NO的主要酶類,其在免疫應(yīng)答中具有重要作用[18]。為了確定PNP40c-1抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NO的過(guò)量分泌是否與iNOS有關(guān),本實(shí)驗(yàn)對(duì)RAW264.7細(xì)胞中iNOS的酶活力及其mRNA的表達(dá)情況進(jìn)行了研究。如圖4所示,100和200 μg/mL PNP40c-1能夠極顯著提高RAW264.7細(xì)胞的iNOS酶活力(P<0.01),這與NO的結(jié)果一致;但從圖5中可以發(fā)現(xiàn),各劑量的PNP40c-1對(duì)巨噬細(xì)胞中iNOS的mRNA表達(dá)均無(wú)顯著影響(P>0.05),雖然呈明顯的上升趨勢(shì)。這種mRNA水平與蛋白水平并不完全一致的現(xiàn)象可能是由基因在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后加工的過(guò)程中存在降解等現(xiàn)象,或是mRNA自身會(huì)受到miRNA等分子的調(diào)控等因素所造成[19]。在LPS誘導(dǎo)炎癥的情況下,RAW264.7細(xì)胞的iNOS酶活力增加了3.67倍,mRNA的表達(dá)增加了9.50倍。PNP40c-1在25～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)能夠成劑量依賴性地有效抑制LPS所誘導(dǎo)的iNOS酶活力及其mRNA表達(dá)的驟增(P<0.01)。上述結(jié)果表明,PNP40c-1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)iNOS酶活力及其mRNA的表達(dá)而抑制LPS誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞中NO的過(guò)量分泌,從而起到緩解炎癥反應(yīng)的作用。

圖4 PNP40c-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞中iNOS酶活力的影響Fig.4 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPSon the activities of iNOS in RAW264.7 cells

圖5 PNP40c-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPSon mRNA expression of iNOS in RAW264.7 cells

2.4 PNP40c-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響

2.4.1 PNP40c-1對(duì)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量的影響 細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞(如巨噬細(xì)胞、T、B淋巴細(xì)胞等)或某些非免疫細(xì)胞(如表皮細(xì)胞等)在應(yīng)激條件下合成分泌的一類小分子蛋白;其可以通過(guò)與受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和效應(yīng)而調(diào)控免疫應(yīng)答。TNF-α、IL-1β和IL-6是介導(dǎo)炎癥發(fā)生的主要因子,這些炎癥因子不僅可以激活免疫細(xì)胞而起到免疫調(diào)節(jié)作用;也可以刺激其他炎癥介質(zhì)產(chǎn)生而引發(fā)炎癥或加劇炎癥[20]。

TNF-α參與免疫調(diào)節(jié)等多種生理和病理過(guò)程,其在誘導(dǎo)后會(huì)促進(jìn)其它炎癥介質(zhì)如IL-1β和IL-6的分泌,加速炎癥反應(yīng)過(guò)程[16]。IL-1β則可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞能力,吸引中性粒細(xì)胞而引發(fā)炎癥,增強(qiáng)免疫細(xì)胞的殺傷能力等[21]。IL-6既是一種促炎因子,同時(shí)也是一種抗炎因子。當(dāng)IL-6濃度相對(duì)較低時(shí),可以增強(qiáng)免疫防御反應(yīng);當(dāng)其濃度較高時(shí),則會(huì)引發(fā)一系列慢性和急性炎癥反應(yīng)[22]。PNP40c-1及PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響如表2所示。從表中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),在細(xì)胞未受到外界刺激時(shí),PNP40c-1能夠顯著刺激巨噬細(xì)胞分泌IL-1β和IL-6(P<0.05),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;而當(dāng)細(xì)胞受到LPS刺激時(shí),三種細(xì)胞因子的含量極顯著增加(P<0.01),TNF-α、IL-1β和IL-6分別增加4.24、3.61和5.56倍;過(guò)量炎癥因子的產(chǎn)生會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。而PNP40c-1能夠顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的過(guò)量分泌(P<0.01),且呈現(xiàn)出劑量依賴性;這就說(shuō)明PNP40c-1可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子的分泌而有效抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

表2 PNPc-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響Table 2 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPS on the secretion of cytokines in RAW264.7 cells

2.4.2 PNP40c-1對(duì)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響 PNP40c-1對(duì)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響如圖6～圖8所示。由圖可見(jiàn),在正常情況下,PNP40c-1對(duì)TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)并無(wú)顯著影響(P>0.05),但可以顯著提高IL-6的mRNA水平(P<0.05);IL-6水平的提高可以增強(qiáng)細(xì)胞的免疫及防御能力。RAW264.7細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下,三種炎癥因子的mRNA表達(dá)均極顯著提高(P<0.01);而與LPS組相比,PNP40c-1可以呈現(xiàn)劑量依賴性地有效抑制TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)。因此,PNP40c-1能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)情況,抑制LPS誘導(dǎo)下炎癥因子的過(guò)度分泌,從而起到抗炎作用。

圖6 PNP40c-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞中TNF-α mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPSon mRNA expression of TNF-α in RAW264.7 cells

圖7 PNP40c-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞中IL-1β mRNA表達(dá)的影響Fig.7 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPSon mRNA expression of IL-1β in RAW264.7 cells

圖8 PNP40c-1和PNP40c-1+LPS對(duì)RAW264.7細(xì)胞中IL-6 mRNA表達(dá)的影響Fig.8 Effects of PNP40c-1 and PNP40c-1+LPSon mRNA expression of IL-6 in RAW264.7 cells

2.5 PNP40c-1對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響

Nrf2/HO-1信號(hào)通路是經(jīng)典的抗氧化通路之一,但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該通路在抗炎作用中也具有重要作用。Nrf2/HO-1信號(hào)通路可以通過(guò)負(fù)調(diào)控炎癥因子和相關(guān)酶類的產(chǎn)生,抑制炎癥因子過(guò)量表達(dá)所引起的惡性循環(huán),從而起到抗炎作用[23]。同時(shí),HO-1作為誘導(dǎo)型異構(gòu)體限速酶也可以催化促炎因子血紅素降解為膽紅素、一氧化碳和游離鐵離子;生成的膽紅素不僅有助于保護(hù)HO-1,還可以抑制NO和iNOS的過(guò)量表達(dá)[24]。此外,Nrf2通過(guò)調(diào)控mRNA和蛋白的表達(dá)促進(jìn)產(chǎn)生HO-1,也會(huì)抑制NF-κB信號(hào)途徑,緩解炎癥反應(yīng)[25]。

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)PNP40c-1在抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)中呈現(xiàn)劑量依賴性,且200 μg/mL濃度下PNP40c-1的作用效果最佳。因此,為了探究PNP40c-1抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的機(jī)制是否與Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān),本研究中對(duì)高劑量PNP40c-1(200 μg/mL)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)的變化情況進(jìn)行了分析。如圖9(a),200 μg/mL PNP40c-1極顯著提高了LPS誘導(dǎo)下RAW264.7細(xì)胞中Nrf2和HO-1的 mRNA的表達(dá)(P<0.01);圖9(b)也表明PNP40c-1預(yù)處理可顯著上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)。該結(jié)果分別從基因水平和蛋白水平闡明PNP40c-1抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制與調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路存在密切聯(lián)系。雖然PNP40c-1在抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌NO方面并未低于空白組,但對(duì)Nrf2/HO-1信號(hào)通路的影響卻較為明顯;出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是RAW264.7細(xì)胞在LPS作用下,大量產(chǎn)生的活性氧族(ROS)和活性氮族(RNS)加劇了炎癥的發(fā)展。一方面,不斷產(chǎn)生的ROS會(huì)消耗Nrf2/HO-1通過(guò)抗氧化途徑所生成的抗氧化酶等抗氧化物質(zhì),繼而加速了Nrf2/HO-1的抗氧化途徑,在一定程度上削弱了其抗炎作用;另一方面,持續(xù)產(chǎn)生的RNS也會(huì)促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞中NO的合成和分泌。此外,在Nrf2/HO-1抗炎機(jī)制中,對(duì)NO等炎癥因子分泌的抑制作用也可能部分源于Nrf2對(duì)NF-κB和MAPK信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用[22-23]。

圖9 PNP40c-1對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞中Nrf2和HO-1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響Fig.9 Effects of PNP40c-1 on mRNA and protein expressionof Nrf2 and HO-1 in RAW264.7 cells induced by LPS

3 結(jié)論

本研究闡明了紅松松仁多糖PNP40c-1對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的抑制作用:在LPS誘發(fā)炎癥的條件下,PNP40c-1以劑量依賴性顯著提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力(P<0.05),抑制LPS誘導(dǎo)后NO和iNOS的過(guò)量表達(dá)。此外,PNP40c-1還可通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎癥因子TNF-α,IL-1β和IL-6的分泌,緩解炎癥反應(yīng)。綜上所述,紅松松仁多糖PNP40c-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用,其作用機(jī)制與調(diào)控Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。因此,紅松松仁多糖PNP40c-1可作為一種天然抗炎物質(zhì)應(yīng)用于食品及保健品等領(lǐng)域。同時(shí),該項(xiàng)研究也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)松仁中生物活性成分提供了理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。