黃瑞芳,張 忠,曹 瑤，教忠意，施士爭*

(1.江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院，江蘇 南京 211153； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護(hù)與利用平臺(tái)，江蘇 南京 210014；3.沭陽縣生產(chǎn)力促進(jìn)中心，江蘇 沭陽 223600)

蓄電池的制造以及其他涉鉛工礦企業(yè)的發(fā)展，由于工藝、設(shè)備落后，管理不善等原因，造成了較重的鉛污染。而鉛污染不能被生物代謝所分解，在環(huán)境中滯留的時(shí)間較長，積累到一定程度就會(huì)對植物造成毒害，且能通過食物鏈在動(dòng)物和人體內(nèi)富集，對人體的腎臟、血液、神經(jīng)系統(tǒng)等危害極大[1-2]。近年來，越來越多的研究用近超積累植物或速生、生物量大的植物來進(jìn)行鉛污染的修復(fù)。柳樹，尤其是灌木柳，其根系發(fā)達(dá)，適應(yīng)性強(qiáng)，耐水濕，生物量大，生長速度快，用作生物能源，不直接與食物鏈相聯(lián)系。與草本相比，因其高積累性而金屬污染修復(fù)能力強(qiáng)[3]，有研究甚至認(rèn)為柳樹是重金屬的超積累植物[4-5]。因此柳樹是土壤污染生物修復(fù)的理想材料[6]，適合用于修復(fù)低、中濃度重金屬污染[7]。

植物的生長和各生理指標(biāo)的變化是植物在受到鉛脅迫時(shí)的自我防御機(jī)制，是判斷其植物對鉛脅迫耐受性的依據(jù)之一。植物的生物量是其受生長環(huán)境影響后最直觀、最全面的反應(yīng)，是耐鉛性的重要評價(jià)因子之一[8]。生物量越大，植物體的蓋度越大，吸收的重金屬量也越多，修復(fù)受污染土壤的效果越好[9]。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)和過氧化物酶(Peroxidase，POD)是是植物抗氧化酶系統(tǒng)中的重要組成成員，對機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，可以清除超氧陰離子自由基，抑制膜脂過氧化，在植物的抗逆過程中扮演著重要角色[10-11]。丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)是細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量能夠反映出機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，可作為細(xì)胞損傷的指標(biāo)之一?？扇苄缘鞍资侵匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其含量與細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的滲透勢以及原生質(zhì)體內(nèi)外的滲透度等都有很密切的關(guān)系，經(jīng)常用作篩選抗性的指標(biāo)之一。

本文研究了不同鉛脅迫濃度下柳樹4個(gè)無性系的生物量、SOD酶活性、POD酶活性、MDA含量和可溶性蛋白含量的變化，旨在了解鉛脅迫對柳樹的生長和生理特性的影響，了解柳樹對鉛脅迫的生理適應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步篩選耐鉛柳樹品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

杞柳(Salixintegra)、簸箕柳(S.suchowensis)的4個(gè)無性系(見表1)，來自于江蘇省林業(yè)科學(xué)研究院國家柳樹良種基地柳樹種質(zhì)資源圃。

表1 供試無性系

1.2 試驗(yàn)方法

采取水培法。將挑選的柳樹苗置于定植籃中，每籃10株。營養(yǎng)液為改良Hogland。水培瓶200 mL,插穗3株/瓶，Pb2+以Pb(NO3)2的形式加入，處理為0(CK)，20(處理1)，40(處理2)，80 mg/L(處理3)[12]。

1.3 測定方法

脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收獲植株，進(jìn)行超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活性測定，以及丙二醛(MDA)和可溶性蛋白質(zhì)含量的測定。所有生理指標(biāo)均采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進(jìn)行測定。SOD酶活性采用羥胺法測定(試劑盒編號(hào)：A001-1-1)，SOD酶活性采用比色法進(jìn)行測定(試劑盒編號(hào)：A084-3)，MDA含量采用TBA法進(jìn)行測定(試劑盒編號(hào)：A003-1-1)，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定(試劑盒編號(hào)：A045-2)，柳樹各無性系的耐鉛能力選擇加權(quán)隸屬函數(shù)法進(jìn)行計(jì)算。得到的數(shù)據(jù)利用Excel 2010和IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行分析。其中隸屬函數(shù)的計(jì)算方法如下：

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

U(Xi)=1-(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)

(2)

Xi=∑Xij/n

(3)

其中，(1)用于某指標(biāo)與重金屬抗性呈正相關(guān)，(2)用于呈負(fù)相關(guān)。Xi為第i個(gè)指標(biāo)的測定值，Xmax為所有參試無性系中該指標(biāo)測定值中的最大值，Xmin為最小值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫對無性系生物量的影響

從圖1可以看出，隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，柳樹4個(gè)無性系的生物量(g)呈降低趨勢。CK(5.41±0.83)>處理1(3.19±0.75)>處理2(2.77±0.42)>處理3(2.46±0.34)。在鉛脅迫質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，4個(gè)無性系的生物量均極顯著低于對照組(P<0.01)，分別是對照的42.96%，55.17%，71.23%，69.92%，表明已經(jīng)對柳樹的生長產(chǎn)生了明顯的脅迫效應(yīng)。在鉛脅迫質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，4個(gè)柳樹無性系的生物量高于對照50%的只有P63和P1024，表明高質(zhì)量濃度的鉛脅迫處理抑制生長的能力增強(qiáng)。

圖1 不同鉛脅迫質(zhì)量濃度下參試無性系生物量的變化

2.2 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫對無性系SOD酶活性的影響

從圖2可以看出，隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，4個(gè)柳樹無性系SOD酶活性(U/g)呈現(xiàn)增高的趨勢。處理3(92.74±7.31)>處理2(87.95±7.57)>處理1(83.02±12.19)>CK(77.18±9.46)。在鉛處理質(zhì)量濃度為80 mg/L時(shí)，SOD活性最高，分別比對照增加了18.99%，12.99%，43.08%，11.75%。

圖2 不同鉛脅迫質(zhì)量濃度下參試無性系SOD酶活性的變化

2.3 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫對無性系POD酶活性的影響

由圖3可看出，隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，4個(gè)柳樹無性系POD酶活性(U/g)均呈現(xiàn)先增加后減低的趨勢。處理2(196.99±63.98)>處理1(177.66±49.34)>處理3(169.24±72.41)>CK(111.06±25.04)。P61和P63在鉛質(zhì)量濃度為40 mg/L時(shí)，達(dá)到最高值，P61比對照高110.25%，P63比對照高191.67%。P336和P1024均在鉛質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)達(dá)到最高，P336比對照高18.75%，P1024比對照高261.76%。在鉛質(zhì)量濃度達(dá)到80 mg/L時(shí)，P63比對照高155.20%，P1024比對照高99.04%，而P61與對照無顯著差異。

圖3 不同鉛脅迫質(zhì)量濃度下參試無性系POD酶活性的變化

2.4 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫對無性系MDA含量的影響

由圖4可看出，隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，4個(gè)柳樹無性系MDA含量(nmol/g)均呈整體升高趨勢，且均顯著高于對照。處理3(39.52±9.57)>處理2(24.58±5.29)>處理1(18.17±5.72)>CK(13.67±3.49)。在鉛質(zhì)量濃度達(dá)到80 mg/L時(shí)，P61，P63，P336，P1024分別比對照高206.52%，318.74%，174.38%，98.83%。

圖4 不同鉛脅迫質(zhì)量濃度下參試無性系DA含量的變化

2.5 不同質(zhì)量濃度鉛脅迫對無性系可溶性蛋白含量的影響

由圖5可看出，4個(gè)柳樹無性系可溶性蛋白含量(mg/kg)隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加均呈現(xiàn)下降的趨勢。在質(zhì)量鉛濃度達(dá)到80 mg/L時(shí)，P61，P63，P336，P1024分別是對照的62.26%，58.61%，79.98%，61.88%，P63的變化最大，P336的變化最小。

圖5 不同鉛脅迫質(zhì)量濃度下參試無性系可溶性蛋白含量的變化

2.6 柳樹各無性系耐鉛能力比較

對植物的抗逆性狀進(jìn)行綜合評價(jià)時(shí)，加權(quán)隸屬函數(shù)法是常用也是較為認(rèn)可的綜合評價(jià)方法[13]。一般采用主成分分析法來篩選綜合指標(biāo)。再依據(jù)各綜合指標(biāo)的貢獻(xiàn)率來確定各自的權(quán)重，進(jìn)而利用加權(quán)隸屬函數(shù)法算出每個(gè)參試無性系的抗逆性綜合評價(jià)值(D值)，據(jù)此對參試無性系的抗逆性進(jìn)行排序。

對參試無性系的5個(gè)指標(biāo)進(jìn)行了主成分分析，共提取了2個(gè)主成分，第1主成分貢獻(xiàn)率為47.89%，第2主成分貢獻(xiàn)率為23.49%。其中主成分1=-0.77×生物量+0.17×SOD酶活性+0.59×POD酶活性+0.85×MDA含量-0.84×可溶性蛋白含量；主成分2=0.10×生物量+0.91×SOD酶活性-0.50×POD酶活性+0.31×MDA含量+0.05×可溶性蛋白含量；綜合主成分=-0.34×生物量+0.29×SOD酶活性+0.17×POD酶活性+0.48×MDA含量-0.39×可溶性蛋白含量。

根據(jù)主成分分析確定的各指標(biāo)貢獻(xiàn)值進(jìn)行加權(quán)隸屬函數(shù)分析，根據(jù)式(1)(2)(3)得出各無性系耐鉛性的綜合評價(jià)值，結(jié)果(見表2)表明4個(gè)無性系耐鉛能力的強(qiáng)弱順序?yàn)镻336>P63>P1024>P61。

表2 參試無性系可各指標(biāo)的隸屬函數(shù)值比較

3 討論與結(jié)論

鉛是植物的非必需元素，植物在受到鉛脅迫時(shí)，其生長受到抑制，表現(xiàn)為植株矮小，生物量下降，甚至出現(xiàn)死亡。本研究中隨著鉛脅迫濃度的增加，柳樹無性系的生物量呈降低趨勢，這是因?yàn)殂U脅迫抑制了柳樹的生長。P61在鉛質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)生物量下降程度最高，可能說明P61的生長受到鉛脅迫的抑制較為明顯。

植物在正常生長條件下，其體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡，而在逆境脅迫下，平衡被打破，體內(nèi)積累大量的活性氧，從而使植物細(xì)胞受到氧化脅迫，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)為抗氧化防御系統(tǒng)的重要組成成員，可清除活性氧[14-15]。本研究中隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，柳樹無性系的SOD酶活性呈增高趨勢，而POD酶活性呈先增高后下降的趨勢，這可能是因?yàn)殂U脅迫刺激導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，從而導(dǎo)致抗氧化酶活性發(fā)生改變[16-17]，從而提高植物的抗逆能力[18]。P336的SOD酶活性的上升程度顯著高于其他3個(gè)無性系，說明P336的SOD酶對鉛脅迫的敏感程度較其他3個(gè)無性系高。而P1024在鉛質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)極顯著增高，達(dá)到最高值，這可能說明P1024的POD酶對鉛脅迫較為敏感。

生物體內(nèi)的自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生丙二醛，可使蛋白質(zhì)、核酸等交聯(lián)聚合，產(chǎn)生細(xì)胞毒性。若丙二醛過多，會(huì)引發(fā)膜脂過氧化[19]，因此MDA含量能間接反映植物的衰老生理和抗性生理。本研究中柳樹在受到鉛脅迫后，MDA含量顯著上升，這說明柳樹在受到鉛脅迫以后導(dǎo)致了膜脂過氧化，植物受到損傷。P1024在鉛質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)MDA含量即顯著增加，可能是因?yàn)镻1024的MDA對鉛脅迫較為敏感。值得一提的是，P1024在鉛脅迫3個(gè)質(zhì)量濃度處理下的MDA的含量并無顯著差異，這可能說明隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的有限增加，P1024受損傷的程度并無增加，而其余3個(gè)無性系都有顯著增加。

植物在逆境下會(huì)主動(dòng)進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，積累各種有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)來降低滲透勢，從而抵抗逆境脅迫。但不同植物其溶質(zhì)的累積程度也不同，主要是由于他們的基因表達(dá)不同，而基因表達(dá)的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)也會(huì)不同，因此可溶性蛋白也是植物抗性指標(biāo)之一[20]。本研究中，隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的增加，柳樹無性系的可溶性蛋白含量呈下降趨勢。P1024的下降程度顯著高于其他3個(gè)無性系，且P1024在鉛質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)可溶性蛋白即顯著降低，而4個(gè)柳樹無性系在鉛脅迫3個(gè)質(zhì)量濃度處理下的可溶性蛋白含量并無顯著差異，這可能說明隨著鉛脅迫質(zhì)量濃度的有限增加，鉛進(jìn)入細(xì)胞后對蛋白水解酶的活性以及蛋白合成相關(guān)酶的毒害和鈍化作用并無顯著增加。

綜上所述，本研究中設(shè)計(jì)的鉛質(zhì)量濃度嚴(yán)重抑制了柳樹的生長和生物量，并且破壞了體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，造成了植物細(xì)胞膜損傷，滲透調(diào)節(jié)能力降低，對柳樹的生理活動(dòng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的脅迫效應(yīng)。

植物對重金屬的耐受性與許多細(xì)胞活動(dòng)都有關(guān)，如金屬離子的螯合、運(yùn)輸、富集等[21-22]，雖然利用生理生化指標(biāo)可以一定程度上評價(jià)植物的耐鉛性，相對縮短林木耐重金屬新品種的選育過程，但單純的用生理指標(biāo)進(jìn)行植物的耐鉛性評價(jià)還不夠，要想全面反映植物的耐鉛性，還需綜合考慮各項(xiàng)指標(biāo)。