李媛媛,李 宏,周智輝,楊文婷,鄭鵬生

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000;2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710061)

宮頸癌(CC,cervical cancer)是女性中最常見的惡性腫瘤,發(fā)病率及死亡率在全球女性中均位于第4位[1]。2014年我國宮頸癌大約有10.2萬新生病例,3.1萬死亡病例[2]。近年來,宮頸癌的研究出現(xiàn)了突破性進(jìn)展,HPV感染作為宮頸癌的首要病因已經(jīng)得到肯定,但是發(fā)病原因及機(jī)制尚不明確[3]。

Nodal屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β,transforming growth factor-β)超家族成員之一,作為早期胚胎誘導(dǎo)信號(hào)的關(guān)鍵成分,是胚胎干細(xì)胞發(fā)育、誘導(dǎo)胚胎組織形成完整體軸中的重要調(diào)節(jié)因子,參與了中胚層和內(nèi)胚層之間的形成、前-后體軸位置的確定和左-右體軸的特化等一系列關(guān)鍵性事件,在脊椎動(dòng)物早期發(fā)育過程中具有重要作用[4-6]。Nodal與腫瘤的關(guān)系密切,參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成,并維持胚胎干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞多向分化的潛能性[7]。目前已在多種腫瘤組織及細(xì)胞株中檢測(cè)到Nodal的存在,如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑色素瘤、乳腺癌、肝細(xì)胞癌和前列腺癌等[8-12],并發(fā)現(xiàn)Nodal在惡性腫瘤中隨著病理分級(jí)的增加而表達(dá)上調(diào),因此推測(cè)其可能與腫瘤惡性程度有關(guān)。但Nodal蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)目前還未見報(bào)道,研究主要通過免疫組織化學(xué)探索Nodal在宮頸癌組織中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

Anti-Nodal抗體(Abnova,美國),檸檬酸(Sigma,美國),檸檬酸三鈉(Sigma,美國),冰乙酸(廣東汕頭市西隴化工廠,中國),羊抗鼠(兔)SP試劑盒(武漢博士德公司,中國),二氨基聯(lián)苯胺(DAB,diaminobenzidine)顯色劑(北京中山生物技術(shù)有限公司,中國),蘇木素(Sigma,美國),其余常規(guī)化學(xué)試劑(西安化學(xué)試劑廠,中國)。

1.2 標(biāo)本收集

47例正常宮頸(NC,normal cervix),4例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN,cervical intraepithelial neoplasia)及68例宮頸浸潤(rùn)癌(ICC,invasive cervical carcinoma)組織于2008年1月—2013年8月收集自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院及西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科因子宮肌瘤及宮頸癌住院患者。宮頸癌患者年齡在31～71歲之間,患者術(shù)前經(jīng)活檢確診,術(shù)前均未接受放化療治療,行廣泛全子宮切除保留或不保留卵巢+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。組織一部分置于10%中性福爾馬林溶液中固定,另一部分置于DMEM培養(yǎng)基(10% FBS,10×抗生素)中,半小時(shí)內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室做進(jìn)一步處理。

1.3 免疫組織化學(xué)

將固定后的組織經(jīng)石蠟包埋,以5 μm厚度進(jìn)行切片,按照常規(guī)免疫組織化學(xué)法進(jìn)行[13]。簡(jiǎn)單步驟如下:63～65 ℃干燥箱中過夜烤片,脫蠟,水化,檸檬酸鈉修復(fù)液中進(jìn)行熱修復(fù),PBS洗滌,3% H2O2封閉,洗滌,4 ℃濕盒過夜孵育一抗(Nodal,1∶100,陰性對(duì)照:以PBS代替一抗進(jìn)行孵育),洗滌后孵育二抗,DAB顯色,復(fù)染,脫水,透明,封片。觀察拍照:在光學(xué)顯微鏡下,根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行免疫染色評(píng)分并拍照。陽性細(xì)胞百分率等級(jí)評(píng)分如下:<10%(0);10%～25%(1);25%～50%(2);50%～75%(3);≥75%(4);染色強(qiáng)度等級(jí)評(píng)分如下:陰性(0);弱陽性(1);中陽性(2);強(qiáng)陽性(3)。最終評(píng)分計(jì)算公式為:免疫反應(yīng)評(píng)分(IRS,immunoreactivity score)=陽性細(xì)胞百分率評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分,總評(píng)分>3定義為陽性染色。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有資料經(jīng)統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism V5.01分析,結(jié)果都以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SEM)展示,2組及3組之間IRS及計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果分析

2.1 Nodal在宮頸組織標(biāo)本中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)對(duì)收集的宮頸組織標(biāo)本進(jìn)行染色,其中正常宮頸47例,宮頸上皮內(nèi)瘤變4例,宮頸浸潤(rùn)癌68例。染色結(jié)果如圖1所示,Nodal在宮頸組織中的陽性表達(dá)率及染色免疫反應(yīng)評(píng)分如圖2所示。由圖1可知,Nodal主要在細(xì)胞漿、細(xì)胞核中表達(dá);由圖2可知,Nodal在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸浸潤(rùn)癌中的表達(dá)逐漸升高。

圖1 正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸浸潤(rùn)癌組織中Nodal免疫組化染色

圖2 Nodal在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸浸潤(rùn)癌中的表達(dá)

Nodal在NC、CIN及ICC中的陽性表達(dá)率分別為:NC為46.81%(22/47)、CIN為50%(2/4)、ICC為79.41%(54/68)。經(jīng)χ2檢驗(yàn),Nodal在正常宮頸和宮頸浸潤(rùn)癌之間有明顯差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。分析免疫反應(yīng)評(píng)分也發(fā)現(xiàn),Nodal的IRS評(píng)分呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì),分別為NC(3.574±0.520)、CIN(4.250±2.72)和ICC(6.912±0.490),方差分析結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

研究結(jié)果都表明,Nodal蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)是增加的,隨著宮頸癌的進(jìn)展,Nodal的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸上升趨勢(shì),結(jié)果顯示Nodal在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能起著一定的作用。

3 討論

Nodal在大多數(shù)成人組織中不活躍,但其再表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)與多數(shù)類型的人類腫瘤相關(guān),Nodal已成為腫瘤生長(zhǎng)和細(xì)胞可塑性的驅(qū)動(dòng)因素[14]。為了研究Nodal在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用,利用免疫組織化學(xué)方法分別檢測(cè)Nodal在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸浸潤(rùn)癌組織中的表達(dá)。Nodal蛋白表達(dá)陽性率在正常宮頸組織中為46.81%(22/47),在宮頸上皮內(nèi)瘤變中為50%(2/4),在宮頸浸潤(rùn)癌中為79.41%(54/68)(P<0.001)。Nodal蛋白免疫染色的IRS評(píng)分在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸浸潤(rùn)癌中也是逐漸上升的(P<0.001)。這些結(jié)果都表明,Nodal蛋白表達(dá)隨著宮頸癌病變的進(jìn)展呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),Nodal在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起著一定的作用。由于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織數(shù)量較少,IRS標(biāo)準(zhǔn)差較大,但是在正常宮頸和宮頸浸潤(rùn)癌中的差異毋庸置疑。