劉莉莉，馮麗麗，王 博

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所,河南 鄭州 450002)

哺乳動物的乳汁具有營養(yǎng)、免疫保護和信息傳遞等功能,充足的乳汁是新生動物生存和繁殖的前提，乳及乳制品也是人類主要的營養(yǎng)食品。乳蛋白是乳汁的主要營養(yǎng)成分，其中酪蛋白是乳腺上皮細(xì)胞分泌的特有磷酸化蛋白。酪蛋白有多種，而β-酪蛋白是酪蛋白中最主要的一種蛋白質(zhì)，約占酪蛋白總量的36%，它的合成和分泌水平在一定程度上反映了哺乳動物乳腺上皮細(xì)胞的泌乳能力。研究表明，乳腺發(fā)育和生長受多種激素共同調(diào)控，動物啟動和維持泌乳需要神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)直接參與[1-2]。調(diào)控泌乳啟動的激素可以分為2類：一類對泌乳有促進作用，如催乳素(Prolactin,PRL)、雌激素(Estrogen,E)和生長激素(Growth hormone,GH)等；另一類對泌乳有抑制作用，如孕酮(Progesterone,P)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，改變這些內(nèi)分泌激素的水平，能不同程度地影響動物泌乳[5-6]。這些激素主要通過與其相應(yīng)受體如催乳素受體(PRLR)、雌激素受體(ERα和ERβ)、孕酮受體(PR)、生長激素受體(GHR)等結(jié)合而發(fā)揮作用[3]。

以往多是利用外源性激素來促進動物乳腺發(fā)育、誘導(dǎo)和維持泌乳，但是外源性激素的殘留問題和對人畜健康的潛在危害，極大地限制了其在乳業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。中藥由于保持了各種成分的天然狀態(tài)和生物活性，具有毒副作用小、不產(chǎn)生抗藥性和無殘留等優(yōu)點，有望成為促進乳腺發(fā)育和泌乳的綠色添加劑，從而提高動物泌乳量[7]。近年來，中草藥對神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)控作用成為醫(yī)學(xué)和動物營養(yǎng)學(xué)研究的熱點內(nèi)容之一，前人研究結(jié)果表明，中藥促進哺乳動物泌乳的功效與其能促進泌乳相關(guān)激素分泌或發(fā)揮類激素作用有關(guān)[8-9]。

通草(Tetrapanaxpapyriferus)為五加科類植物，具有清熱、利尿、通氣下乳等功效，可用于水腫尿少、乳汁不下等癥。為研究通草對哺乳動物的促乳效果及其能否調(diào)節(jié)泌乳相關(guān)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激素水平及受體表達，將低劑量和高劑量的通草提取物灌服泌乳小鼠模型，測定哺乳期母鼠的泌乳量和乳腺β-酪蛋白的表達水平，檢測血清和乳腺組織中PRL、雌二醇(E2)、P、GH的水平及乳腺中各激素受體的表達情況，進而從內(nèi)分泌系統(tǒng)角度探討通草對哺乳動物乳腺泌乳調(diào)節(jié)的影響，以期為催乳中藥對哺乳動物泌乳調(diào)節(jié)機制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 中藥和供試動物

通草(Tetrapanaxpapyriferus)購自黑龍江省藥材公司，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)于丹副教授鑒定為五加科通脫木屬通脫木的干燥莖髓。

清潔級Balb/C小鼠，體質(zhì)量(20.0±2.0)g，雌鼠40只，雄鼠20只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全性評價中心提供，許可證號SCXK(黑)2018-003。飼養(yǎng)條件：20～25 ℃條件下自然照明，自由飲水和進食。

1.2 主要試劑

RIPA裂解液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；小鼠PRL、E2、P、GH 的ELISA 檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；PRLR、PR、β-actin抗體購自Cell signalling公司；ERα、ERβ抗體購自Abcam公司；GHR抗體購自Santa cruz公司。

1.3 通草濃縮提純

1 kg通草生藥用20倍蒸餾水浸泡24 h，然后于100 ℃ 沸水浴中加熱4 h，過濾后留存提取液。重復(fù)上述操作過程2次，合并3次水煮液。用4層紗布過濾雜質(zhì)，濾液經(jīng)3 000 r/min離心15 min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮至原體積的1/3。濃縮液中加入無水乙醇，至乙醇含量達到75%，4 ℃ 靜置過夜，3 000 r/min離心15 min，取上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得4 g(生藥)/mL及12 g(生藥)/mL的通草提取物，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹10]。

1.4 試驗設(shè)計

Balb/C小鼠按照雌雄2∶1的比例進行配種，次晨取雌鼠陰道分泌物鏡檢，單籠飼養(yǎng)。分娩后選擇分娩時間接近的15窩進行試驗，分為對照組(等量生理鹽水)、通草低劑量組、通草高劑量組，每組5窩，每窩留取8只仔鼠，用于泌乳試驗。以分娩當(dāng)日為第0天，為減少分娩對母鼠的應(yīng)激和體質(zhì)下降的因素對試驗結(jié)果造成影響，本試驗從第3天開始灌服通草提取物，記錄母鼠的泌乳量，至第15天結(jié)束。灌服每日進行，通草低劑量組母鼠和通草高劑量組母鼠每日灌服通草提取物1次即0.25 mL，灌服通草提取物的質(zhì)量濃度分別為4 g(生藥)/mL 和12 g(生藥)/mL，對照組母鼠給予等量生理鹽水。

1.5 泌乳期小鼠泌乳量的檢測

在哺乳第3、5、7、9、11、13、15天，通過檢測母鼠體質(zhì)量計算每天的泌乳量。具體方法如下：將每只泌乳的母鼠及其哺乳的仔鼠作為1個觀察單位，每個觀察單位當(dāng)日上午9：00起將仔鼠與泌乳的母鼠分離，4 h后將仔鼠放回泌乳的母鼠身邊哺乳，哺乳1 h，用天平分別稱取每窩母鼠哺乳前后的體質(zhì)量，計算差值為該泌乳母鼠在此時間段的泌乳量。在哺乳1 h期間內(nèi)禁食、禁水。從哺乳第3天至第15天，共記錄7次。每次分離和合籠過程中，盡量控制實驗室的濕度及溫度不變，避免聲音和光的刺激，避免驚擾，以減少環(huán)境因素對母鼠喂養(yǎng)及小鼠吮吸的影響[7]。

1.6 泌乳期小鼠血清和乳腺組織泌乳相關(guān)內(nèi)分泌激素水平的檢測

在第7次記錄母鼠泌乳量后，摘眼球采血，全血于37 ℃恒溫水浴2 h，3 500 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA 法，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測血清中PRL、E2、P、GH水平。

摘眼球采血后將其處死，迅速分離乳腺組織，取大小適宜的小鼠乳腺組織，利用生理鹽水制備10%組織勻漿液，采用ELISA 法，按照ELISA試劑盒說明書操作，檢測乳腺組織勻漿液PRL、E2、P、GH水平。

1.7 泌乳期小鼠乳腺組織β-酪蛋白和泌乳相關(guān)激素受體表達量的檢測

取大小適宜的小鼠乳腺組織，用RIPA裂解液提取乳腺組織總蛋白質(zhì)，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，用1×Loading Buffer稀釋蛋白質(zhì)樣品至1 μg/μL，然后對蛋白質(zhì)進行變性，最后采用 Western blot 技術(shù)檢測乳腺組織β-酪蛋白、PRLR、ERα、ERβ、PR、GHR蛋白的表達水平。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用BandScan軟件對Western blot圖譜進行灰度掃描。試驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 通草對泌乳期小鼠泌乳量的影響

在哺乳第3、5、7、9、11、13、15天通過檢測母鼠體質(zhì)量計算每天的泌乳量，結(jié)果見圖1。對照組小鼠第3～15天泌乳量分別為0.311、0.420、0.622、0.713、0.884、0.952、1.146 g/h；低劑量通草處理組小鼠第3～15天泌乳量分別為0.331、0.571、0.782、0.894、1.024、1.168、1.350 g/h；高劑量通草處理組小鼠第3～15天泌乳量分別為0.341、0.693、0.924、1.145、1.285、1.424、1.587 g/h。各組小鼠在泌乳初期(泌乳的第3天)泌乳量相差不大。隨著仔鼠日齡的增加，各組泌乳小鼠的泌乳量都呈上升趨勢。在第5～15天時，高劑量通草處理組和低劑量通草處理組小鼠的泌乳量顯著高于對照組小鼠泌乳量(P<0.05)，同時高劑量通草處理組小鼠的泌乳量明顯高于低劑量通草處理組小鼠(P<0.05)。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同The different lowercase letters show significant differences (P<0.05).The same below圖1 通草對小鼠泌乳量的影響Fig.1 The effects of Tetrapanax papyriferus on the milk yield of mice

2.2 通草對泌乳期小鼠乳腺組織β-酪蛋白表達的影響

對照組、低劑量通草處理組和高劑量通草處理組小鼠乳腺組織β-酪蛋白的表達情況如圖2和圖3顯示，高劑量通草處理組和低劑量通草處理組小鼠乳腺組織β-酪蛋白的表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)，同時高劑量通草處理組小鼠乳腺組織β-酪蛋白的表達量明顯高于低劑量通草處理組(P<0.05)。

1：對照組;2：低劑量通草處理組;3：高劑量通草處理組1:Control group;2:Low dose of Tetrapanax papyriferus treatment group;3:High dose of Tetrapanax papyriferus treatment group圖2 小鼠乳腺組織β-酪蛋白表達的Western blot分析結(jié)果Fig.2 Western blot results about the expression of β-casein in mammary gland of mice

圖3 通草對小鼠乳腺組織β-酪蛋白表達的影響Fig.3 The effects of Tetrapanax papyriferus on the protein expression of β-casein in mammary gland of mice

2.3 通草對泌乳期小鼠血清和乳腺組織PRL、E2、P和GH水平的影響

通草對泌乳期小鼠血清和乳腺組織泌乳相關(guān)激素PRL、E2、P和GH水平影響的檢測結(jié)果如表1和表2所示。與對照組相比，高劑量組小鼠血清PRL、E2、GH的水平分別顯著提高112.50%、129.15%、223.48%，低劑量組小鼠血清PRL、E2、GH的水平分別顯著提高49.84%、68.18%、100.76%。與對照組相比，高劑量組小鼠乳腺PRL、E2、GH的水平分別顯著提高60.68%、269.35%、105.19%，低劑量組小鼠乳腺PRL、E2、GH的水平分別顯著提高32.27%、129.03%、53.68%。高劑量組和低劑量組小鼠血清和乳腺組織PRL、E2和GH的水平明顯高于對照組(P<0.05)，同時高劑量組小鼠血清和乳腺組織PRL、E2和GH的水平顯著高于低劑量組(P<0.05)。而各處理組小鼠血清和乳腺組織P的水平無顯著性差異(P>0.05)。

表1 通草對小鼠血清泌乳相關(guān)激素水平的影響Tab.1 The effects of Tetrapanax papyriferus on the levels of hormones related to lactation in serum of mice

表2 通草對小鼠乳腺組織泌乳相關(guān)激素水平的影響Tab.2 The effects of Tetrapanax papyriferus on the levels of hormones related to lactation in the mammary gland of mice

2.4 通草對小鼠乳腺組織PRLR、ERα、ERβ、PR和GHR蛋白表達量的影響

通草對小鼠乳腺組織泌乳相關(guān)激素受體PRLR、ERα、ERβ、PR和GHR蛋白表達量影響的檢測結(jié)果如圖4和圖5所示，高劑量通草處理組和低劑量通草處理組小鼠乳腺組織PRLR、ERα、ERβ 和GHR的表達水平均顯著高于對照組(P<0.05)；而且，高劑量通草處理組PRLR、ERα、ERβ 和GHR蛋白的表達水平明顯高于低劑量通草處理組(P<0.05)。但對照組、低劑量通草處理組和高劑量通草處理組小鼠的PR表達水平無顯著差別(P>0.05)。

1：對照組;2：低劑量通草處理組;3：高劑量通草處理組1:Control group;2:Low dose of Tetrapanax papyriferus treatment group;3:High dose of Tetrapanax papyriferus treatment group圖4 小鼠乳腺組織PRLR、ERα、ERβ、PR和GHR表達的Western-blot分析結(jié)果Fig.4 Western-blot results about the expression of PRLR,ERα,ERβ,PR and GHR in mammary gland of mice

圖5 通草對小鼠乳腺組織PRLR、ERα、ERβ、PR和GHR蛋白表達的影響Fig.5 The effects of Tetrapanax papyriferus on the expression levels of PRLR,ERα,ERβ,PR and GHR in mammary gland of mice

3 結(jié)論與討論

動物泌乳量通常是反映泌乳性能的重要指標(biāo)。β-酪蛋白常作為研究外源性激素和其他細(xì)胞因子作用乳腺上皮細(xì)胞泌乳性能評判的重要指標(biāo)。李健等[11]研究表明，芪歸催乳散能顯著提高母豬的及泌乳相關(guān)激素水平而促進泌乳。相關(guān)研究結(jié)果表明，中藥能顯著提高動物的泌乳量[12-13]。本研究結(jié)果表明，小鼠泌乳期灌服低劑量和高劑量的通草提取物，除了泌乳第3天外，均能顯著提高哺乳期小鼠的泌乳量，且高劑量通草處理組提高泌乳量的效果更加顯著，提示通草具有較強的增乳作用。前人研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的紫花地丁、黃芪、澤蘭、訶子中藥提取物能顯著促進奶牛乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白的分泌[14]。葎草黃酮處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞后，乳腺細(xì)胞內(nèi)β-酪蛋白的表達量明顯上調(diào)[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，通草提取物能提高哺乳期小鼠乳腺組織β-酪蛋白的表達量。說明通草對β-酪蛋白的表達起到上調(diào)作用，可促進泌乳動物乳腺β-酪蛋白的合成與分泌，從而提高乳品質(zhì)。

乳腺的生長發(fā)育及泌乳的啟動和維持有賴于各種相關(guān)內(nèi)分泌激素的調(diào)控。PRL是一種主要的生乳激素，對泌乳啟動和維持起重要作用。PRL要發(fā)揮其促乳功能，必須與乳腺上皮細(xì)胞膜表面的PRLR相結(jié)合，激活JAK2/STAT5信號傳導(dǎo)途徑，激活的STAT5作用于乳蛋白基因啟動子區(qū)的靶序列元件，調(diào)節(jié)其下游乳蛋白合成相關(guān)基因的表達，進而實現(xiàn)泌乳的啟動[16]。E是乳腺腺泡發(fā)育和泌乳啟動過程中必不可少的調(diào)節(jié)激素，目前在動植物體內(nèi)均有大量發(fā)現(xiàn)[17]。ER包括ERα和ERβ 2種類型，泌乳期多數(shù)乳腺細(xì)胞共同表達 2 種受體。E主要通過與受體ER結(jié)合而發(fā)揮其生物學(xué)作用。E可刺激垂體分泌PRL，并與PRL共同作用誘導(dǎo)泌乳的啟動[18]。GH是具有廣泛生理功能的生長調(diào)節(jié)激素，與靶細(xì)胞表面的受體GHR結(jié)合，由GHR介導(dǎo)通過不同的途徑將信號傳到細(xì)胞內(nèi)，進而產(chǎn)生一系列生理效應(yīng)，GH能提高奶牛乳蛋白產(chǎn)量[19-20]。GH也能與PRL協(xié)同誘導(dǎo)和維持泌乳[21]。郭旭東[8]發(fā)現(xiàn)，灌服蘆丁的哺乳母鼠泌乳量提高，體內(nèi)E2、GH和PRL水平均升高，同時蘆丁能誘導(dǎo)乳腺組織中ER、PRLR、GHR的表達，推測蘆丁具有弱雌激素樣的作用功效。石寶明等[9]報道,王不留行、益母草、黃芪能顯著提高泌乳中后期母鼠的泌乳量和母鼠血清中GH、PRL和胰島素樣生長因子1(IGF-1)的含量。本研究表明，通草可以促進小鼠機體PRL、E2、GH的釋放，提高乳腺組織中PRL、E2、GH的水平及PRLR、ERα、ERβ、GHR的表達。推測通草能促進泌乳期小鼠泌乳相關(guān)激素PRL、E2、GH分泌，并通過與相應(yīng)受體結(jié)合，更好地發(fā)揮PRL與E2、GH的協(xié)同調(diào)節(jié)作用，進而啟動和維持泌乳；通草還有可能通過PRL、E2及GH間接激活乳腺泌乳信號通路，調(diào)控下游一系列靶基因的表達，誘導(dǎo)和維持泌乳，提高小鼠的泌乳量和乳品質(zhì)。P是維持妊娠的主要激素，其主要作用為促進乳腺小葉及腺泡的發(fā)育，P通過其自身受體PR的介導(dǎo)，與靶基因的效應(yīng)元件結(jié)合以調(diào)控基因表達，發(fā)揮其促進乳腺發(fā)育的作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠妊娠期孕酮的含量高于泌乳期，泌乳后下降到較低水平，并且維持在低水平[23]。在泌乳啟動過程中，P對泌乳啟動具有明顯抑制作用[3]。本試驗結(jié)果也表明，泌乳期對照組小鼠血清和乳腺組織P含量以及乳腺組織中PR表達量處于較低的水平，說明P是小鼠泌乳啟動的反向調(diào)控因子?？梢姡ú萏崛∥锬芡ㄟ^正向調(diào)節(jié)泌乳期小鼠乳腺PRL、E2、GH及PRLR、ERα、ERβ、GHR的水平，進而提高小鼠泌乳量及β-酪蛋白的合成分泌。

綜上，通草能通過提高泌乳期小鼠及上調(diào)泌乳相關(guān)內(nèi)分泌激素水平及乳腺組織PRLR、ERα、ERβ和GHR的表達，進而促進動物乳腺泌乳。