劉 偉,劉倩楠,張 良,胡宏海,*,宋 弋

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)是以血糖水平升高為特征的代謝性疾病,長期餐后高血糖狀態(tài)可引起冠心病、腎病、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥。α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶在人體中主要參與食物中碳水化合物消化吸收,抑制其活性可以延緩葡萄糖釋放,抑制餐后血糖水平升高。目前,市面上α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制劑主要有伏格列波糖、米格列醇和阿卡波糖等,但是服用后容易引起胃腸道功能紊亂等不良反應(yīng)。多糖是一類由醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物,廣泛存在于動物、植物和微生物細胞壁,具有抗氧化、免疫調(diào)控、降血糖等生物活性[1-7]。因此,以功能性多糖為原料開發(fā)天然α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制劑具有廣闊的市場需求和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)果實色澤鮮紅、酸甜可口、香氣濃郁、軟嫩多汁、營養(yǎng)豐富,深受廣大消費者喜愛。相關(guān)研究表明草莓具有抗氧化、抗炎、抗肥胖、抗癌、抗細胞凋亡、抗高血壓、抑制心血管疾病、抑制神經(jīng)變性等生物活性和生理功能,主要與抗氧化成分如多酚、花青素、鞣花酸、阿魏酸、葉酸、VC等相關(guān)[8-16]。Liu等[17]發(fā)現(xiàn)草莓多糖(strawberry polysaccharides,SP)可顯著提高脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞產(chǎn)生Bcl-2蛋白的表達水平,同時SP通過上調(diào)抗炎因子(IL-10)、下調(diào)促炎因子(白介素(IL)-1b和IL-6)發(fā)揮良好的抗炎活性,表明SP具有潛在開發(fā)利用價值。但是,草莓多糖降血糖活性的相關(guān)研究未見報道。

草莓多糖混有色素,不僅影響其外觀品質(zhì),而且不利于多糖分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定與構(gòu)效關(guān)系研究。目前,多糖脫色的方法主要有活性炭法、雙氧水法和透析法等,活性炭脫色和透析法處理時間長、多糖損失量大;過氧化氫脫色容易造成多糖水解,生物活性降低,不適于食品級多糖加工利用。大孔樹脂是一類人工合成、具有多孔立體結(jié)構(gòu)的聚合物,具有比表面積大、色素吸附能力強、方便操作、易再生等特點。近年來,大孔樹脂廣泛應(yīng)用于猴頭菌、龍眼、熟地、香椿等不同植物多糖脫色[18-21],顯示了較好的脫色效果和較高的多糖保留率。本文比較了ADS-17、DA201、X-5、AB-8、D101、NKA-9等12種不同極性大孔吸附樹脂對草莓多糖脫色作用,篩選、優(yōu)化大孔樹脂的最佳脫色工藝參數(shù),對草莓多糖的化學(xué)成分、單糖組成、分子量、光譜特性、抗氧化活性以及α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮草莓(品種:紅顏) 北京美廉美超市;無水乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫鈉等 均為國產(chǎn)分析純,國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司;大孔樹脂的種類和物理性質(zhì)如表1所示 北京索萊寶科技有限公司;總抗氧化能力檢測試劑盒(FRAP法)、總抗氧化能力檢測試劑盒(ABTS法) 碧云天生物技術(shù)有限公司;總蛋白測定試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司;單糖和糖醛酸標樣、對硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷(pPNG)、阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶源葉生物、豬胰α-淀粉酶等 美國Sigma公司。

表1 大孔樹脂的物理性質(zhì)Table 1 Physical properties of the macroporous resins

Wyatt Technology DAWN EOS多角度激光光散射儀 美國懷雅特技術(shù)公司;DIONEX ICS-3000離子色譜 美國戴安公司;SIGMA 3K-15高速冷凍離心機 德國SIGMA公司;FTIR 7000傅里葉紅外光譜儀 美國瓦里安公司;RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;DNM-9606酶標分析儀 北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 草莓多糖制備 草莓去蒂,清洗,瀝干,切成小塊,冷凍干燥48 h,粉碎,過40目篩。取20 g草莓粉和200 mL的95%乙醇置于索氏提取器,80 ℃回流處理2次,每次4 h?；亓魈幚砗蟮牟葺哼^濾后置于通風廚通風處理48 h,真空包裝,4 ℃冷藏備用。

取50 g經(jīng)過回流處理的草莓粉,加入蒸餾水1500 mL,于80 ℃水浴浸提4 h,離心后收集上清液,殘渣繼續(xù)用蒸餾水(料液比1∶3 g/mL)于80 ℃水浴浸提3 h,離心后合并兩次上清液,低壓蒸發(fā)濃縮至200 mL后置于4 ℃冷藏備用。將無水乙醇以4∶1 (V∶V)比例濃縮后的上層溶液中(乙醇終濃度80%),邊加邊磁力攪拌30 min后,于4 ℃醇沉12 h,1000 r/min條件下離心20 min,收集沉淀,透析,冷凍真空干燥,Savage法去除蛋白,得到草莓多糖。

1.2.2 大孔樹脂脫色條件優(yōu)化

1.2.2.1 大孔樹脂預(yù)處理及篩選 將大孔樹脂(表1中的樹脂類型)置于95%乙醇中浸泡24 h,然后用蒸餾水洗至無乙醇味;再用1 mol/L HCl溶液浸泡8 h,用蒸餾水洗至流出水pH為中性;然后用1 mol/L NaOH 溶液浸泡8 h,用蒸餾水洗至流出水pH為中性,60 ℃真空干燥0.5 h,4 ℃冷藏備用。配制5 mg/mL草莓多糖10 mL溶液,加入2 g經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂。然后,120 r/min、25 ℃脫色12 h,測定不同大孔樹脂對草莓多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響。

1.2.2.2 多糖濃度對NKA-9大孔樹脂脫色效果的影響 配制不同初始濃度(5、10、20、30、40、50、70、80 mg/mL)草莓多糖,其他條件為多糖濃度30 mg/mL,時間60 min,pH8),比較靜態(tài)脫色試驗中多糖濃度對NKA-9大孔樹脂多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響。

1.2.2.3 時間對NKA-9大孔樹脂脫色效果的影響 配制30 mg/mL草莓多糖,在溫度50 ℃,pH8,不同時間(5、10、20、30、40、50、60、70、80 min)時,比較靜態(tài)脫色試驗中NKA-9大孔樹脂多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響。

1.2.2.4 溫度對于NKA-9大孔樹脂脫色效果的影響 配制30 mg/mL草莓多糖,在時間60 min,pH8,不同溫度(25、30、35、40、45、50、55、60、65 ℃)時,比較靜態(tài)脫色試驗中NKA-9大孔樹脂多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響。

1.2.2.5 pH對NKA-9大孔樹脂脫色效果的影響 配制30 mg/mL草莓多糖,在時間60 min,溫度50 ℃,不同pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)時,比較靜態(tài)脫色試驗中NKA-9大孔樹脂多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響。

1.2.2.6 上樣液體積和流速對NKA-9大孔樹脂脫色效果的影響 根據(jù)上述靜態(tài)吸附優(yōu)化試驗結(jié)果(多糖濃度30 mg/mL,時間60 min,溫度50 ℃,pH8.0)進行動態(tài)吸附試驗,稱取20 g預(yù)處理的NKA-9大孔樹脂濕法裝柱(Φ 3 cm×35 cm),探究不同上樣液體積(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 BV/h)及不同流速(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 BV/h)對NKA-9大孔樹脂的泄漏曲線影響。

1.2.3 多糖脫色率測定 配制5 mg/mL草莓多糖10 mL溶液,加入2 g經(jīng)過預(yù)處理的大孔樹脂。然后,120 r/min、25 ℃脫色12 h,離心取上清,在420 nm測定草莓多糖溶液脫色前后的吸光值,并計算脫色率(%)見公式(1)[22]。

多糖脫色率(%)=(脫色前吸光值-脫色后吸光值)/脫色前吸光值×100

式(1)

1.2.4 多糖保留率的測定 草莓多糖脫色處理方法與1.2.3相同,490 nm測定苯酚硫酸顯色后的草莓多糖溶液脫色前后的吸光值,并計算多糖保留率(%)見公式(2)[23]。

多糖保留率(%)=脫色后多糖含量/脫色前多糖含量×100

式(2)

1.2.5 大孔樹脂選擇系數(shù)測定 草莓多糖脫色處理方法與1.2.3相同,多糖對不同大孔樹脂選擇系數(shù)的測定見公式(3)[23]。

選擇系數(shù)=[(脫色前吸光值-脫色后吸光值)/脫色后吸光值]/[(脫色前多糖含量-脫色后多糖含量)/脫色后多糖含量]

式(3)

1.2.6 紫外光譜分析 配制5 mg/mL草莓多糖,在350～850 nm波長掃描。

1.2.7 紅外光譜分析 取5 mg草莓多糖樣品與160 mg KBr混合、研磨、壓片,在4000～400 cm-1下以32倍速度掃描,光譜的分辨率為4 cm-1。

1.2.8 化學(xué)成分分析 草莓多糖的總糖含量采用苯酚-硫酸法進行測定,以D-葡萄糖作為標準品[24];蛋白質(zhì)含量用Lowry法進行測定,以牛血清蛋白為標準品[25];將草莓多糖配制成1 mg/mL溶液,以半乳糖醛酸為對照,采用硫酸-咔唑法[26],在523 nm波長處測定吸光度,繪制標準曲線并計算多糖DPB中糖醛酸的含量。

草莓多糖的單糖和糖醛酸組成和含量采用高效陰離子交換色譜(High performance anion exchange chromatography,HPAEC)[27]。取10 mg 草莓多糖樣品,加入4 mol/L的三氟乙酸4 mL,充氮1 min排出管內(nèi)空氣,旋緊螺旋蓋,于120 ℃水解2 h,待冷卻后氮氣吹干水解液,除去過量的三氟乙酸,加超純水定容至5 mL。稀釋后,過0.22 μm微孔濾膜,待HPLC進樣分析。分別配制濃度為5 ppm的各單糖和糖醛酸標準品儲備液,用去離子水稀釋成不同濃度(0.01～5 ppm)的標準工作溶液,供離子色譜分析。HPAEC分析前4 ℃保存樣品。

色譜條件:Carbo PacTMPA20 3×150 mm色譜柱;流動相:A為水,B為250 mmol/L的NaOH,C為1 mol/L的NaAc,0～20 min:94% A,6% B,0% C;20～20.1 min:89% A,6% B,5% C;20.1～35 min:74% A,6% B,20% C;35.1～45 min:20% A,80% B;45.1～55 min:94% A,6% B。流速:0.5 mL/min;進樣體積:10 μL;柱溫:35 ℃;檢測器:脈沖安培檢測器,金電極。

1.2.9 酯化度測定 配制0.5 mol/L NaOH溶液、0.5 mol/L HCl溶液、0.05 mol/L NaOH溶液、0.5%的酚酞指示劑。用除CO2水配制1 mg/mL的草莓多糖溶液,取20 mL,用0.05 mol/L的氫氧化鈉標準溶液滴定至pH=8.1,記錄所消耗氫氧化鈉的毫升數(shù)V1即為原始滴定度。繼續(xù)加入5 mL 0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液,加塞后強烈震蕩15 min,加入0.5 mol/L鹽酸溶液中和,振搖至粉紅色消失為止。用0.05 mol/L氫氧化鈉溶液再次滴定至pH=8.1,記錄所消耗氫氧化鈉的毫升數(shù)V2,即為酯化度見公式(4)[28]。

多糖的酯化度=V2/(V1+V2)

式(4)

1.2.10 分子質(zhì)量測定 采用高效分子排阻色譜-多角度激光光散射檢測器-示差折光檢測器聯(lián)用(High perfomance size exclusion chromatography-multi-angle laser light scattering detector-differential refraction detector,HPSEC-MALLS-RID)測定脫色后草莓多糖樣品的分子質(zhì)量。取草莓多糖樣品2 mg,溶于2 mL質(zhì)量分數(shù)0.9% NaCl溶液,過0.45 mm膜,進樣。色譜柱:Shodex OHpak SB-806M HQ 300 mm×7.8 mm,13 mm);進樣量200 μL;檢測波長:658 nm;流動相:0.9% NaCl溶液;流速:0.5 mL/min。數(shù)據(jù)處理和分析采用激光光散射操作軟件。

1.2.11 抗氧化活性測定

1.2.11.1 ABTS+·清除能力測定 草莓多糖對ABTS+·清除活力測定參照Re等[29]的方法并稍作修改,配置ABTS工作液:將溶解于50 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH7.4)的ABTS(2 mmol/L)靜置過夜作為儲備液,與200 mL過硫酸鉀溶液(70 mmol/L)反應(yīng)獲得ABTS+·陽離子。試驗使用前,用磷酸鹽緩沖溶液溶解使ABTS溶液在734 nm的OD值為0.700±0.030。采用蒸餾水依次配制0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol/L Trolox標準溶液,96孔板的每個檢測孔中依次加入200 μL ABTS工作液,空白對照孔中加入10 μL蒸餾水,標準曲線檢測孔中分別加入10 μL各種濃度的Trolox標準溶液,樣品檢測孔中分別加入2.5、5、10 mg/mL草莓多糖溶液10 μL,室溫孵育5 min,在734 nm波長處測定吸光值,根據(jù)標準曲線并以Trolox標準溶液的濃度表示樣品的抗氧化能力。

1.2.11.2 FRAP法抗氧化活性測定 草莓多糖FRAP法抗氧化活性測定參照Benzie等[30]的方法并稍作修改,配制FRAP工作液:0.3 mol/L醋酸緩沖溶(pH=3.6)、10 mmol/L 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)鹽酸溶液和20 mmol/L FeCl3,溶液按10∶1∶1體積比配制,采用蒸餾水依次配制0.15、0.30、0.60、0.90、1.20和1.50 mmol/L FeSO4標準溶液,96孔板的每個檢測孔中依次加入180 μL FRAP工作液,空白對照孔中加入5 μL蒸餾水,標準曲線檢測孔中分別加入5 μL各種濃度的FeSO4標準溶液,樣品檢測孔中分別加入2.5、5、10 mg/mL草莓多糖溶液5 μL,37 ℃孵育5 min,在593 nm波長處測定吸光值,根據(jù)標準曲線計算并以FeSO4標準溶液的濃度表示樣品抗氧化能力。

1.2.12 降血糖活性測定

1.2.12.1α-葡萄糖苷酶抑制活性測定 草莓多糖對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性測定參照Chen等[31]的方法并稍作修改。50 μL不同濃度(0～20 mg/mL)草莓多糖溶液中分別加入100 μLα-葡萄糖苷酶(1 U/mL),37 ℃孵化10 min后加入50 μL對pPNG(5 mmol/L),然后37 ℃孵化20 min后加入100 μL Na2CO3溶液(1 M)終止酶解反應(yīng)。在405 nm測定反應(yīng)體系的吸光值變化,并計算草莓多糖溶液對α-葡萄糖苷酶體外抑制率(%)見公式(5)。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(樣品吸光值-對照組1吸光值)/對照組2吸光值]×100

式(5)

式中:對照組1為pPNG和草莓多糖混合溶液(不含α-葡萄糖苷酶);對照組2為pPNG和α-葡萄糖苷酶混合溶液(不含草莓多糖)。

1.2.12.2α-淀粉酶抑制活性測定 草莓多糖對α-淀粉酶體外抑制活性測定參照Meng等[32]的方法并稍作修改。50 μL不同濃度(2.5、5.0、10.0 mg/mL)草莓多糖溶液中分別加入100 μLα-淀粉酶(1.0 U/mL),25 ℃孵化10 min后加入50 μL 1%(W/V)淀粉溶液,25 ℃孵化10 min后加入0.1 mL二硝基水楊酸(10 mg/mL)終止酶解反應(yīng),并在沸水浴中加熱10 min。在540 nm測定反應(yīng)體系的吸光值變化,并計算草莓多糖對α-淀粉酶體外抑制率(%)見公式(6)。

α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(樣品吸光值-對照組1吸光值)/對照組2吸光值]×100

式(6)

式中:對照組1為淀粉和草莓多糖混合溶液(不含α-淀粉酶);對照組2位淀粉和α-淀粉酶混合溶液(不含草莓多糖)。

1.2.12.3α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制動力學(xué)測定 脫色后草莓多糖對α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)測定:取不同濃度草莓多糖(7.662、15.324 mg/mL),測定不同底物pPNG的濃度(0.75～6 mmol/L)條件下反應(yīng)體系的反應(yīng)速率,對照組為0.5 U/mLα-葡萄糖苷酶,以(1/V)為縱坐標,以(1/S)為橫坐標,繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,確定抑制類型。

1.2.12.4 脫色后草莓多糖對α-淀粉酶抑制動力學(xué)測定 取不同濃度草莓多糖(4.590、2.795 mg/mL),測定不同α-淀粉酶濃度(0.25%～1.25%)條件下反應(yīng)體系的反應(yīng)速率,對照組為1.0 U/mLα-淀粉酶,以(1/V)為縱坐標,以(1/S)為橫坐標,繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,確定抑制類型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗指標最少做三個平行試驗,最后測定數(shù)據(jù)用SPASS 17.0進行分析,P<0.05為差異顯著,統(tǒng)計值使用“平均值±標準差”表示。所得結(jié)果進一步用Origin 9.1做圖表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂脫色條件優(yōu)化

2.1.1 不同大孔樹脂對草莓多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響 大孔樹脂的吸附作用與其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、比表面積、粒徑、功能基團等有關(guān)[33]。圖1比較了不同大孔樹脂對草莓多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響,其中極性大孔樹脂對于草莓多糖的脫色率顯著高于其他類型大孔樹脂,脫色率均超過70%;4種極性大孔樹脂中NKA-9對于多糖的保留率最高,達到78%。因此,選擇NKA-9大孔樹脂用于后續(xù)試驗。

圖1 不同大孔樹脂對草莓多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響Fig.1 Effects of different macroporous resins on decolorationratios,recovery ratios and selectivity coefficients of SP

2.1.2 多糖濃度對于NKA-9大孔樹脂脫色作用的影響 圖2A表明隨著多糖濃度增加,脫色率逐漸減少,而保留率逐漸增加。大孔樹脂對于色素的吸附能力與功能基團的數(shù)量成正比,當大孔樹脂功能基團不變時,多糖濃度越低越利于色素吸附,但是也容易促使多糖吸附造成損失[34]。NKA-9大孔樹脂的選擇系數(shù)在多糖濃度為30 mg/mL時達到最高值,表明此時脫色效率最好。因此,選擇草莓多糖的初始濃度為30 mg/mL用于后續(xù)試驗。

圖2 靜態(tài)脫色試驗中草莓多糖濃度、時間、溫度和pH對于NKA-9大孔樹脂多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)的影響Fig.2 Effects of different SP concentration,time,temperature and pH on decoloration ratios,recovery ratiosand selectivity coefficients of NKA-9 resin in static decoloration experiments

2.1.3 時間對于NKA-9大孔樹脂脫色作用的影響 圖2B結(jié)果表明隨著脫色時間延長,多糖脫色率逐漸增加,60 min達到動態(tài)平衡。但是,多糖保留率隨著脫色時間增加而緩慢減少,可能部分多糖通過吸附作用逐漸進入到大孔樹脂內(nèi)部孔隙,60 min后多糖保留率的降低趨勢顯著增加(P<0.05)。NKA-9大孔樹脂的選擇系數(shù)呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,60 min達到最大值,表明其脫色效率最高。因此,選擇60 min用于后續(xù)試驗。

2.1.4 溫度對于NKA-9大孔樹脂脫色作用的影響 圖2C結(jié)果表明隨著溫度增加,多糖脫色率也逐漸增加,50 ℃左右達到動態(tài)平衡。超過50 ℃時多糖脫色率沒有顯著性變化(P>0.05),而多糖保留率隨著溫度增加而減少。多糖黏度隨著溫度增加而逐漸降低,從而導(dǎo)致色素分子更容易靠近、吸附在大孔樹脂的表面和內(nèi)部,多糖的吸附量也隨著溫度的增加而增加。NKA-9大孔樹脂的選擇系數(shù)在50 ℃達到最大值,表明其脫色效率最高。因此,選擇50 ℃用于后續(xù)試驗。

2.1.5 pH對于NKA-9大孔樹脂脫色作用的影響 圖2D表明隨著pH增加,多糖脫色率也逐漸增加,pH8.0時達到動態(tài)平衡。在堿性溶液中多糖脫色率比中性或酸性溶液中更高,可能是由于色素苯環(huán)上的酚羥基在堿性環(huán)境中容易被解離為陰離子而吸附[35]。但是,多糖保留率隨著pH增加而減少。NKA-9大孔樹脂的選擇系數(shù)在pH8.0達到最大值,表明其脫色效率最高。因此,選擇pH8.0用于后續(xù)試驗。

2.1.6 上樣液體積和流速對于NKA-9大孔樹脂脫色作用的影響 如圖3所示,上樣液流速越低,越有利于多糖色素與大孔樹脂充分接觸,提高多糖脫色率。隨著上樣液流速增加,多糖脫色率和保留率均降低,當上樣液體積和流速分別為4.5 BV、3.0 BV/h時,選擇系數(shù)達到最大值8.24±0.21,多糖脫色率和保留率分別為91.24%±1.32%和78.86%±1.21%。

圖3 動態(tài)脫色試驗中草莓多糖溶液對于NKA-9大孔樹脂的泄漏曲線Fig.3 Dynamic decoloration leakage curves ofSP solution on NKA-9 resin

2.2 紫外光譜和紅外光譜掃描分析

圖4中紫外光譜掃描圖表明草莓多糖色素的吸收峰350～850 nm,經(jīng)過NKA-9大孔樹脂脫色后吸收峰消失。樣品圖中暗紅色的草莓多糖溶液經(jīng)過脫色處理變?yōu)槿榘咨?表明草莓多糖色素被NKA-9大孔樹脂充分吸附。紅外光譜掃描圖表明草莓多糖經(jīng)過NKA-9大孔樹脂脫色處理前后的特征吸收峰沒有明顯的差異。草莓多糖在3394.33 cm-1處為O-H伸縮振動的強吸收峰[36],在2933.35、1416.92 cm-1處為C-H的不對稱伸縮振動和變角振動的吸收峰,為多糖類物質(zhì)特征吸收峰[37]。在1610.89 cm-1處為酰胺基C=O的伸縮振動的吸收峰,1746.91 cm-1處為羧基的特征吸收峰。1021.44～1147.39 cm-1范圍內(nèi)為C-O-C和C-O-H的反對稱伸縮振動峰,表明草莓多糖主要為吡喃糖結(jié)構(gòu)。在1235.55 cm-1處為C-N和N-H伸縮振動的吸收峰,918.16 cm-1處為D-吡喃糖環(huán)非對稱伸縮振動的特征吸收峰,在832.51 cm-1處的吸收峰表面草莓多糖主要以α-構(gòu)型的糖苷鍵為主[38]。

圖4 草莓多糖溶液脫色前后全波長掃描圖譜(A)、紅外光譜掃描圖(B)及樣品圖Fig.4 UV-Vis spectrum(A),infrared spectrum(B)ofSP solution before and after decoloration

2.3 化學(xué)成分組成分析

如表2所示,脫色后草莓多糖中各組分含量分別為糖78.23%(w/w)、蛋白6.14%(w/w)、糖醛酸8.56%(w/w)、水分5.96%(w/w)。如圖5A所示,6種單糖和2種糖醛酸PMP衍生物在離子色譜中得到較好的分離,混合標準液中各PMP衍生物的流出順序及保留時間依次為巖藻糖2.90 min、鼠李糖4.88 min、阿拉伯糖5.40 min、半乳糖6.66 min、葡萄糖7.27 min、果糖9.52 min、半乳糖醛酸29.68 min、葡萄糖醛酸31.04 min。如圖5B所示,草莓多糖中單糖的保留時間與標準品鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸的保留時間吻合,表明草莓多糖由這5種單糖和2種糖醛酸組成,物質(zhì)的量比為1.00∶0.67∶0.69∶0.80∶0.65∶0.29∶0.69,由此推測草莓多糖為一種果膠類酸性雜多糖。通過滴定法測定草莓多糖的酯化度為DE=85.96%,為一種高甲氧基果膠多糖。

圖5 單糖、醛酸標準品(A)和脫色后草莓多糖(B)的PMP衍生物離子色譜圖Fig.5 Ion chromatogram of the PMP derivatives ofmonosaccharides,uronic acid standards(A)and SP(B)注:峰1:巖藻糖;峰2:鼠李糖;峰3:阿拉伯糖;峰4:半乳糖;峰5:葡萄糖;峰6:果糖;峰7:半乳糖醛酸;峰8:葡萄糖醛酸。

表2 脫色后草莓多糖化學(xué)成分組成Table 2 Chemical composition of SP

2.4 分子量測定

采用HPSEC-MALLS-RID聯(lián)用測定脫色后草莓多糖分子質(zhì)量,如圖6所示,草莓多糖經(jīng)過高效分子排阻色譜分離獲得3個色譜峰,表明草莓多糖為非均一多糖。如表3所示,色譜峰Ⅰ(15.12 min)的相對含量為61.0239%,為草莓多糖主要成分,重均分子質(zhì)量為393.9 kD。色譜峰Ⅱ(18.75 min)和色譜峰Ⅲ(19.94 min)的相對含量分別為17.4620%和21.5141%,重均分子質(zhì)量分別為29.49、19.27 kD。

圖6 脫色后草莓多糖高效分子排阻色譜Fig.6 HPSEC chromatogram of SP after decoloration

表3 脫色后草莓多糖分子質(zhì)量及分布Table 3 Molecular weights and distributionof SP after decoloration

2.5 抗氧化活性測定

不同濃度草莓多糖對ABTS+·清除能力和FRAP法抗氧化活性測試結(jié)果分別如圖7所示。圖7A所示,以ABTS+·清除能力為例,隨著草莓多糖質(zhì)量濃度增加,其對于ABTS+·的清除能力逐漸提高,脫色前草莓多糖濃度從2.5 mg/mL上升至10 mg/mL時,抗氧化能力從0.15 Trolox mmol/L增加至0.79 Trolox mmol/L。草莓多糖經(jīng)過NKA-9大孔樹脂脫色處理后隨著樣液濃度的升高其抗氧化能力相應(yīng)也呈線性上升趨勢,但是,同樣濃度條件下,脫色后的草莓多糖要比脫色前抗氧化能力顯著減少,表明草莓多糖色素同樣具有清除ABTS+·的活力。圖7B所示,FRAP法抗氧化活性測試結(jié)果的作用趨勢與草莓多糖清除ABTS+·大致相同,進一步驗證了NKA-9大孔樹脂可以有效吸附草莓多糖色素,而草莓多糖的抗氧化能力也隨之降低。

圖7 草莓多糖溶液脫色前后抗氧化活性測定Fig.7 Antioxidant activities of SP before and after decoloration注:A:ABTS+·清除能力;B:FRAP法抗氧化能性。

2.6 降血糖活性測定

草莓多糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性測試如圖8所示。圖8A表明草莓多糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性呈量效關(guān)系,隨著草莓多糖濃度增加(1～20 mg/mL),α-葡萄糖苷酶的抑制率也逐漸升高。同等濃度條件下脫色后的草莓多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率較脫色前顯著增強(P<0.05),脫色前半抑制濃度(IC50)為9.798 mg/mL,脫色后為7.662 mg/mL,略高于阿卡波糖(IC504.452 mg/mL，圖8B)。表明NKA-9大孔樹脂脫色處理不僅能夠吸附草莓多糖色素,而且提高了草莓多糖的純度。按照Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線作圖法,分別作出草莓多糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制動力學(xué)擬合曲線。草莓多糖對α-葡萄糖苷酶動力學(xué)曲線如圖8C所示,不同濃度草莓多糖和對照組抑制動力學(xué)曲線均相交于X軸負軸,隨著草莓多糖濃度增加米氏常數(shù)Km和Vmax逐漸減少,呈現(xiàn)為混合型抑制特征。圖8D表明草莓多糖對α-淀粉酶抑制活性作用趨勢與其對α-葡萄糖苷酶抑制活性大致相同,隨著草莓多糖濃度(0.5～10 mg/mL)逐漸增加,α-淀粉酶的抑制率也逐漸升高。同等濃度條件下脫色后的草莓多糖對α-淀粉酶的抑制率較脫色前顯著增強(P<0.05),脫色前半抑制濃度(IC50)為4.184 mg/mL,脫色后為2.795 mg/mL,均顯著高于阿卡波糖(IC5021.578 μg/mL,圖8E，P<0.05)。草莓多糖對α-淀粉酶抑制動力學(xué)擬合曲線如圖8F所示,隨著草莓多糖濃度增加,Km和Vmax逐漸減少。不同濃度草莓多糖和對照組抑制動力學(xué)曲線的斜率(Km/Vmax)幾乎保持不變,呈現(xiàn)出非競爭性抑制的特征,可能由于草莓多糖與底物結(jié)構(gòu)不相似,不與底物競爭結(jié)合α-葡萄糖苷酶的活性位點。草莓多糖通過與酶的活性位點以外的部位結(jié)合,使酶分子形狀發(fā)生變化,從而降低酶的活性[32]。

圖8 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性Fig.8 Inhibitory effect on α-glucosidase and α-amylase activity 注:A:草莓多糖α-葡萄糖苷酶抑制活性;B:阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶抑制活性;C:脫色后草莓多糖對α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué);D:草莓多糖對α-淀粉酶抑制活性;E:阿卡波糖對α-淀粉酶抑制活性;F:脫色后草莓多糖對α-淀粉酶抑制動力學(xué)。

3 結(jié)論

本實驗以草莓為原料,通過水提醇沉、冷凍真空干燥得到草莓多糖,以多糖脫色率、保留率和選擇系數(shù)為指標,比較了不同大孔樹脂的脫色效果,結(jié)果表明NKA-9大孔樹脂效率最高。采用單因素試驗優(yōu)化了KNA-9大孔樹脂脫色工藝參數(shù):樣品初始濃度30 mg/mL,時間60 min,溫度50 ℃,pH8.0,上樣液體積為4.5 BV,上樣液流速3.0 BV/h。草莓多糖具有良好的ABTS+·自由基清除能力、亞鐵還原能力,草莓多糖經(jīng)過脫色處理后抗氧化能力降低。草莓多糖是一種酸性雜多糖,由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成。草莓多糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶在體外均具有較好的活性抑制作用,作為一種天然活性組分在降糖食品、保健品、藥品方面具有良好的潛力,草莓多糖在體內(nèi)的降糖作用和機制需要進一步深入研究。