彭 鑫,黃燕燕,趙 珊,孫麗娜,陳思敏,肖弘毅,劉冬梅

(華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640)

亞硝酸鹽(Nitrite,NIT)主要存在于蔬菜[1]、加工肉制品[2-3]和生活飲用水中。高亞硝酸鹽攝入量易導(dǎo)致高鐵血紅蛋白癥,增加癌癥風(fēng)險(xiǎn)[4]。目前,降低亞硝酸鹽的方法有物理法、化學(xué)法、生物法,其中生物法因其高效、綠色而成為研究熱點(diǎn)。

大多數(shù)反硝化細(xì)菌中亞硝酸鹽還原酶(Nitrite reductase,NiR)表達(dá)量較低,而且經(jīng)天然產(chǎn)物純化得到NiR的工序繁雜,不可避免地出現(xiàn)蛋白質(zhì)損失和回收率低的問(wèn)題。目前大多數(shù)研究者都無(wú)法直接從破碎天然菌體后的粗酶液中提取大量的天然NiR。Ichiki 等[5]從含有6710 mg總蛋白質(zhì)的Haloarculamarismortui粗酶液中僅純化得到1.43 mg的NiR。Inatomi等[6]從含有1060 mg總蛋白質(zhì)的Haloferaxdenitrificans粗酶液中僅純化得到0.08 mg NiR。

本課題組發(fā)現(xiàn)蠟樣芽胞桿菌LJ01[7]、植物乳桿菌DMDL 9010[8]及鼠李糖乳桿菌LCR 6013[9]能夠分泌NiR,降解培養(yǎng)基中高濃度的NaNO2,但是其N(xiāo)iR表達(dá)量低。利用大腸桿菌作為外源基因的表達(dá)系統(tǒng),所需投入的成本較低,但目前難以克服的問(wèn)題是目的蛋白的表達(dá)往往是以難溶性的包涵體形式存在于裂解液的沉淀中[10],因此對(duì)基因工程菌的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的,以便在提高菌體生物量的同時(shí)還可以獲得濃度較高的目的基因體外表達(dá)產(chǎn)物[11]。韓倩等[12]對(duì)Bacillussp. C產(chǎn)NiR的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化后,發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后目標(biāo)蛋白NiR的酶活力較優(yōu)化前提高了67.89%。梅旭旭等[13]優(yōu)化基因工程菌表達(dá)海棲熱袍菌磷酸戊糖變位酶的發(fā)酵條件,以裂解液上清中的重組蛋白在SDS-PAGE上對(duì)應(yīng)條帶的積分光密度來(lái)分析其可溶性表達(dá)水平,優(yōu)化后磷酸戊糖變位酶表達(dá)量得到大幅度的提高。魏娜等[14]對(duì)基因改造運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳條件為溫度28 ℃、葡萄糖濃度為24%(w/V)、pH7.4,此時(shí)重組工程菌的乙醇產(chǎn)量比原始菌株乙醇產(chǎn)量提高16.4%。

為了降低投入的成本和提高目的蛋白的產(chǎn)量,不少學(xué)者選擇基因工程菌株作為研究對(duì)象,本文在前期研究中從豆瓣醬中篩選出一株具有強(qiáng)降解NIT能力的蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusLJ01,獲得了B.cereusLJ01中編碼NiR(nir)的全長(zhǎng)基因序列。將B.cereusLJ01中nir基因克隆至相應(yīng)的表達(dá)載體上,構(gòu)建了重組菌pET-28a(+)-nir-BL21,為提高基因工程菌pET-28a(+)-nir-BL21的產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶(NiR)水平,從培養(yǎng)基成分出發(fā),優(yōu)化了異源表達(dá)NiR的培養(yǎng)基條件,為食品來(lái)源的蠟樣芽孢桿菌及其N(xiāo)iR用于食品中NIT的控制提供理論基礎(chǔ)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟樣芽孢桿菌BacilluscereusLJ01 本課題組從豆瓣醬中篩選得到,已于2014年6月19日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏號(hào)CGMCC NO.9360;原核載體質(zhì)粒pET-28a(+)、克隆宿主E.coliDH5α、表達(dá)宿主E.coliBL21(DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存于-80 ℃冰箱中;LB培養(yǎng)基(生化試劑)、技術(shù)瓊脂粉、亞硝酸鈉、葡萄糖、甘油、酵母浸粉、大豆蛋白肽、細(xì)菌學(xué)蛋白胨、無(wú)水氯化鈣、磷酸二氫鉀、結(jié)晶硫酸鎂、氫氧化鈉、氯化鎂等 廣州卯林試劑有限公司。

Cyto FLEX流式細(xì)胞儀 貝克曼庫(kù)爾特公司;SW-CJ-2F潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;Scientz-IID型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;5415R、5810R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf;LRH-70型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技;QYC-200型恒溫?fù)u床 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;YXQ-LS100SII型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21的構(gòu)建 以B.cereusLJ01全基因組DNA為模板進(jìn)行NiR的PCR擴(kuò)增(上游引物:5′-CGGCATATGCCAGCT AGCATGAGTTATGAAAAAGTATG-3′,下游引物:5′-CGGCTCGAGTGGCTCGAGCTAAGACGCTATTACTTC-3′,下劃線(xiàn)為保護(hù)性堿基,分別從其中引入NdeI和XhoI的酶切位點(diǎn))。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后,進(jìn)行純化和回收。將純化回收的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒pET-28a(+)進(jìn)行NdeI和XhoI雙酶切,16 ℃連接3 h以上[15-16]。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α,單菌落PCR驗(yàn)證成功后送至廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序成功的質(zhì)粒pET-28a(+)-nir轉(zhuǎn)入到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,分別涂布在含有25 μg/mL Kan的固體LB培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。

1.2.2 菌量的測(cè)定 向LB液體培養(yǎng)基中加入濃度為25 μg/mL卡那霉素溶液,按接種量10%(V/V)接種重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21,在37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)12 h后,用未接種的無(wú)菌液體LB培養(yǎng)基稀釋至OD600小于0.1后,用流式細(xì)胞儀測(cè)定稀釋液中活菌數(shù)濃度(CFU/μL),并計(jì)算原液中的活菌數(shù)濃度(CFU/mL)?？瞻捉M使用無(wú)菌的LB培養(yǎng)基進(jìn)行校準(zhǔn),控制流式細(xì)胞儀對(duì)空白組的顆粒數(shù)進(jìn)行記錄范圍在“0～10個(gè)/s”。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以液體LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加不同濃度不同種類(lèi)的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 碳源的選擇 分別向基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中添加濃度為0、2、4、6、8、10、12、14、16 g·L-1的葡萄糖或添加濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5、20.0、22.5 g·L-1的甘油,加入25 μg/mL卡那霉素溶液,接種3%(V/V)2次活化后的重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21,于37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)12 h后,測(cè)定重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21活菌數(shù)。

1.2.3.2 氮源的選擇 分別向基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中添加濃度為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 g·L-1的酵母浸粉,或添加濃度分別為0、5、10、15、20、25、30 g·L-1的細(xì)菌學(xué)蛋白胨,或添加濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 g·L-1的大豆蛋白肽,加入25 μg/mL卡那霉素溶液,接種3%(V/V)2次活化后的重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21,于37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)12 h后,測(cè)定重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21活菌數(shù)。

1.2.3.3 無(wú)機(jī)鹽的確定 分別向基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基中添加濃度為0、1、2、3、4、5、6 g·L-1的磷酸二氫鉀,或添加濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 g·L-1的結(jié)晶硫酸鎂,或添加濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g·L-1的氯化鈣,加入25 μg/mL卡那霉素溶液,接種3%(V/V)2次活化后的重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21,于37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)12 h后,測(cè)定重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21活菌數(shù)。

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用Minitab 17軟件通過(guò)設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法,對(duì)上述影響因素進(jìn)行篩選。每個(gè)因素分別取低(-1)和高(+1)兩個(gè)水平(表1),共12個(gè)試驗(yàn)組合。每個(gè)處理重復(fù)3次,取平均值即為試驗(yàn)結(jié)果。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman design

1.2.5 Box-Behnken試驗(yàn) 在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上,得出葡萄糖、甘油、細(xì)菌學(xué)蛋白胨這三個(gè)因素對(duì)重組菌的生長(zhǎng)影響最顯著。利用響應(yīng)面分析法對(duì)重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化,利用Design-Expert 8.0.6軟件,用Box-Behnken模型(試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表2)建立三因素三水平數(shù)學(xué)模型[13],以活菌數(shù)為指標(biāo)優(yōu)化培養(yǎng)基成分。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of Box-Behnken experiment

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。Plackett-Burman試驗(yàn)采用Minitab 17軟件進(jìn)行設(shè)計(jì),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)。利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,數(shù)據(jù)間的分析采用單因素方差分析和Duncan多重比較法,顯著性水平均設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 NiR的編碼基因擴(kuò)增與測(cè)序結(jié)果

將B.cereusLJ01中nir序列上傳至NCBI中,獲得登錄號(hào)為MG839504,用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,從圖1可以看出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶單一,大小約1600 bp,由此可判斷B.cereusLJ01中nir擴(kuò)增成功。

圖1 NiR編碼基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Gel electrophoresis of PCR-amplifiednir from B. cereus LJ01注:M:Marker;1、2、3:表示PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的3個(gè)平行。

2.2 培養(yǎng)基成分的單因素優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)重組菌生長(zhǎng)的影響 如圖2所示,當(dāng)在LB培養(yǎng)基中添加不同量的葡萄糖和甘油時(shí),呈現(xiàn)出菌量先增后減的趨勢(shì)。圖2A可以看出,隨著葡萄糖的添加量由2 g·L-1提高到4 g·L-1,重組菌pET28a-nir-BL21活菌數(shù)達(dá)到最大值(2.85±0.0017)×108CFU·mL-1,繼續(xù)添加葡萄糖含量至6 g·L-1,重組菌pET-28a(+)-nir-BL21活菌數(shù)下降至(2.05±0.0028)×108CFU·mL-1,隨后變化趨于平穩(wěn)。葡萄糖含量較低時(shí),重組菌pET-28a(+)-nir-BL21活菌數(shù)隨著葡萄糖含量的提高而增多;當(dāng)達(dá)到一定階段時(shí),又隨著葡萄糖含量的提高而下降。葡萄糖的含量較高時(shí)可以抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。這種現(xiàn)象可能是由于重組菌pET28a-nir-BL21具有反饋抑制體系,不同菌株存在不同單糖轉(zhuǎn)運(yùn)與轉(zhuǎn)化系統(tǒng)有關(guān)[12]。圖2B可以看出,在甘油濃度為2.5 g·L-1時(shí),菌量達(dá)到最大值2.22×108CFU·mL-1,黏稠狀的甘油可能對(duì)B.cereusLJ01生長(zhǎng)具有一定的影響。兩種碳源對(duì)重組菌的促進(jìn)作用差異不大,葡萄糖略好于甘油。故選用兩種碳源進(jìn)行接下來(lái)的試驗(yàn),選取葡萄糖濃度為2～6 g·L-1,甘油濃度為0～5 g·L-1。

圖2 不同碳源濃度對(duì)重組菌pET-28a(+)-nir-BL21生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of different carbon sources concentrations on thegrowth of the recombinant bacteria pET-28a(+)-nir-BL21注:A:葡糖糖;B:甘油;不同小寫(xiě)字母表示同一組數(shù)據(jù)之間具有顯著性差異;圖3～圖4同。

2.2.2 氮源對(duì)重組菌生長(zhǎng)的影響 由圖3A可知,重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21的活菌數(shù)隨著酵母浸粉加入量濃度的增大而增大,當(dāng)酵母浸粉濃度達(dá)到12.5 g·L-1時(shí),重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21的活菌數(shù)達(dá)到最大值(4.15±0.028)×108CFU·mL-1。由圖3B可知,重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21的活菌數(shù)呈現(xiàn)出先增長(zhǎng)后減少的趨勢(shì),說(shuō)明過(guò)多的氮源會(huì)對(duì)產(chǎn)生底物抑制作用,不利于其生長(zhǎng)。在細(xì)菌學(xué)蛋白胨濃度達(dá)到10 g·L-1時(shí),菌量達(dá)到最大值(3.83±0.068)×108CFU·mL-1。由圖3C可知,一定濃度的大豆蛋白肽對(duì)重組菌的生長(zhǎng)有著促進(jìn)作用,當(dāng)大豆多肽濃度達(dá)到2.5 g·L-1時(shí),菌量有最大值(3.74±0.011)×108CFU·mL-1。這是因?yàn)榇蠖苟嚯氖谴蠖沟鞍捉?jīng)過(guò)蛋白酶水解制得的短肽類(lèi)混合物,重組菌pET-28a(+)-nir-BL21可以直接利用小分子或氨基酸進(jìn)行生長(zhǎng)代謝,促進(jìn)生長(zhǎng)繁殖[17]。三種氮源對(duì)重組菌的生長(zhǎng)促進(jìn)生長(zhǎng)作用顯著,故選取三種濃度分別為10～15 g·L-1的酵母浸粉,5～15 g·L-1的細(xì)菌學(xué)蛋白胨,0～5 g·L-1的大豆蛋白肽進(jìn)行接下來(lái)實(shí)驗(yàn)。

圖3 不同氮源濃度對(duì)重組菌pET-28a(+)-nir-BL21生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources concentrations on thegrowth of the recombinant bacteria pET-28a(+)-nir-BL21注:A:酵母浸粉;B:細(xì)菌學(xué)蛋白胨;C:大豆多肽。

2.2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)重組菌生長(zhǎng)的影響 無(wú)機(jī)鹽主要為生物體提供各種重要的生命元素,具有維持細(xì)胞穩(wěn)定性、內(nèi)環(huán)境pH穩(wěn)定、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓和作為酶的激活劑等[12]。圖4A可以看出重組菌pET-28a(+)-nir-BL21的活菌數(shù)隨著KH2PO4濃度的增大而增大,當(dāng)KH2PO4濃度為4～5 g·L-1達(dá)到最大值。這與張媛媛等[18]的結(jié)論一致。磷酸鹽中的磷是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸不可缺少的元素,磷濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)有很大影響。重組菌菌落總數(shù)隨著結(jié)晶硫酸鎂和CaCl2濃度的增加有先增加后減少的趨勢(shì),當(dāng)結(jié)晶硫酸鎂濃度為0.2 g·L-1,CaCl2濃度為0.2 g·L-1達(dá)到最高的菌落總數(shù)。這說(shuō)明過(guò)量的Ca2+、Mg2+對(duì)重組菌株pET-28a(+)-nir-BL21的生長(zhǎng)有抑制作用。整體來(lái)說(shuō),無(wú)機(jī)鹽對(duì)重組菌的促進(jìn)作用較碳源和氮源來(lái)說(shuō)并不顯著,故只選取其中影響程度較大的濃度為3～6 g·L-1KH2PO4進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同無(wú)機(jī)鹽濃度對(duì)重組菌pET-28a(+)-nir-BL21生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of different inorganic salts concentrations on thegrowth of the recombinant bacteria pET-28a(+)-nir-BL21注:A:KH2PO4;B:結(jié)晶硫酸鎂;C:CaCl2。

2.3 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

在前期單因素的基礎(chǔ)上,選取其中六個(gè)對(duì)重組菌生長(zhǎng)具有顯著促進(jìn)作用的因素,運(yùn)用Minitab 17軟件設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn),以發(fā)酵液中菌落總數(shù)為響應(yīng)目標(biāo)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3,各因子效應(yīng)及顯著性見(jiàn)表4。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Plackett-Burma experiments

表4 Plackett-Burman試驗(yàn)因子顯著性分析Table 4 Significance analysis of terms in Plackett-Burma experiment

由表4可知,在促進(jìn)重組菌pET28a-nir-BL21生長(zhǎng)方面,葡萄糖、甘油、細(xì)菌學(xué)蛋白胨的貢獻(xiàn)度較高,分別為25.90%、11.66%和11.09%,其他幾個(gè)因素的貢獻(xiàn)值均不高于3%。結(jié)果表明,在這六種促進(jìn)因子中,加入葡萄糖、甘油、細(xì)菌學(xué)蛋白胨,對(duì)重組菌pET28a-nir-BL21生長(zhǎng)起促進(jìn)作用,且葡萄糖、甘油、細(xì)菌學(xué)蛋白胨的貢獻(xiàn)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他的因素,因此選擇葡萄糖、甘油、細(xì)菌學(xué)蛋白胨作為研究對(duì)象,進(jìn)行Box-Behnken優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

表4 對(duì)重組菌生長(zhǎng)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Designs and results of response surface experimentson the growth of the recombinant bacteria

2.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析

2.5 響應(yīng)面因子交互作用結(jié)果

將葡萄糖、甘油、細(xì)菌學(xué)蛋白胨添加量3個(gè)參數(shù)分別固定,通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件繪制該模型的各影響因子兩兩交互作用的響應(yīng)曲面及其等高線(xiàn)圖,如圖5～圖7所示。兩變量交互作用的大小可通過(guò)等高線(xiàn)的線(xiàn)間疏密程度和曲面形狀來(lái)判斷。曲面呈橢圓形、線(xiàn)間距密,則說(shuō)明兩因子之間的交互作用對(duì)響應(yīng)值影響顯著,反之,則不顯著。而響應(yīng)曲面傾斜度大也說(shuō)明兩因子之間的交互作用大。根據(jù)回歸方程的一次項(xiàng)系數(shù)及表5分析,各因素對(duì)重組菌的影響程度為細(xì)菌學(xué)蛋白胨>葡萄糖>甘油。根據(jù)回歸方程的二次項(xiàng)系數(shù)以及圖5～圖7所示,AC、AB交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響較BC大,但三種因素間的兩兩交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響均不顯著,這與表5分析一致[20-21]。

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of the regression model

圖5 葡萄糖和甘油對(duì)重組菌pET28a-nir-BL21 活菌數(shù)的影響Fig.5 Effect of glucose and glycerin on the active bacteria number of the recombinant bacteria pET28a-nir-BL21

圖6 葡萄糖和細(xì)菌學(xué)蛋白胨對(duì)重組菌pET28a-nir-BL21活菌數(shù)的影響Fig.6 Effect of glucose and bacterial protein on the active bacteria number of the recombinant bacteria pET28a-nir-BL21

圖7 甘油和細(xì)菌學(xué)蛋白胨對(duì)重組菌pET28a-nir-BL21活菌數(shù)的影響Fig.7 Effect of glycerin and bacterial protein on the active bacteria number of the recombinant bacteria pET28a-nir-BL21

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面建立的數(shù)學(xué)模型,對(duì)回歸方程求一階偏導(dǎo),得到對(duì)于重組菌菌量達(dá)到最大值的最佳培養(yǎng)條件為:以液體LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加葡萄糖3.72 g·L-1,甘油2.63 g·L-1,細(xì)菌學(xué)蛋白胨8.70 g·L-1,在此條件下的預(yù)測(cè)的菌量能達(dá)到3.14×108CFU·mL-1。為進(jìn)一步加以驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,采用得到的培養(yǎng)基優(yōu)化最佳配方進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn),計(jì)算得到重組菌的菌量為3.02×108CFU·mL-1,與預(yù)測(cè)值相差不大,擬合率達(dá)96.17%,說(shuō)明通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立的數(shù)學(xué)模型是準(zhǔn)確可靠的。

3 結(jié)論

在基礎(chǔ)LB培養(yǎng)基成分上,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)和Box-Behnken Design(BBD)設(shè)計(jì)試驗(yàn),利用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,從培養(yǎng)基成分角度對(duì)重組菌pET-28a(+)-nir-BL21活菌數(shù)進(jìn)行初步優(yōu)化,取得了良好的效果,獲得了最佳培養(yǎng)基成分配方為:以L(fǎng)B 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,添加葡萄糖 3.72 g·L-1、甘油2.63 g·L-1和細(xì)菌學(xué)蛋白胨 8.70 g·L-1。在此條件下,獲得的重組菌的活菌數(shù)為 3.02×108CFU·mL-1,此結(jié)果為工業(yè)化生產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶提供了理論依據(jù)。