劉延波,程莉莉,趙志軍,候文靜,潘春梅,*,孫西玉

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院(酒業(yè)學(xué)院),河南鄭州 450046; 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院河南省白酒風(fēng)格工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450046; 3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院鄭州市白酒釀造微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450046; 4.張弓老酒酒業(yè)有限公司,河南寧陵 476733)

大曲是釀制傳統(tǒng)白酒的糖化劑、發(fā)酵劑和增香劑,含有多種微生物,在釀造過程中起著重要的糖化、發(fā)酵和生香的作用,直接或間接影響白酒的產(chǎn)量、質(zhì)量和風(fēng)格[1]。濃香型白酒大曲的制作工藝為自然發(fā)酵,富集了原材料和環(huán)境中的微生物,微生物區(qū)系十分復(fù)雜[2]。酵母菌是白酒釀造微生物家族中不可或缺的一類微生物,從白酒制曲到釀造過程一直可以檢測出,直接關(guān)系到產(chǎn)酒率[3]。

酵母菌種特性的要求是在高溫、高滲、高糖、高pH、高酒精度等極端條件下仍具有較高的發(fā)酵能力。傳統(tǒng)釀酒的酵母最適發(fā)酵溫度為28～33 ℃[4],一般不超過36 ℃,但夏季生產(chǎn)時(shí),室溫在35～40 ℃之間,此時(shí)酵母菌的生長、繁殖、代謝均受到抑制,有些酵母菌甚至因不耐高溫,出現(xiàn)死亡現(xiàn)象,這嚴(yán)重影響了夏季白酒生產(chǎn)的產(chǎn)量[5]。許多酒廠選擇壓排度夏,給生產(chǎn)帶來極大的不便,更大大降低了設(shè)備和廠房等的利用率[6]。目前,耐高溫酵母研究較多,但大都篩選自土壤[7-8],從大曲中篩選耐高溫酵母的研究少有報(bào)道;因此,研究耐高溫酵母菌株對白酒釀造和發(fā)酵工業(yè)具有重要的理論及實(shí)際意義。

本研究從張弓老酒中高溫大曲中篩選出耐高溫的酵母菌,并對該菌進(jìn)行耐高溫和耐乙醇性以及發(fā)酵性能測試和響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵條件,以期得到一株耐高溫耐乙醇且高產(chǎn)酒精的酵母菌,為建立和開發(fā)中原濃香型白酒酵母菌菌種資源庫提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中高溫大曲曲樣 張弓老酒酒業(yè)有限公司;葡萄糖 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;酵母粉、蛋白胨 英國Oxoid公司;KH2PO4、(NH)2SO4、MgSO4天津大學(xué)科威公司。

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái) 浙江孚夏醫(yī)療科技有限公司;DNP-9272BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;LQZ-211恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司;LDZX-50KBS立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;721分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;H1850R高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 富集培養(yǎng)基(豆芽汁培養(yǎng)基):稱取新鮮黃豆芽100 g,置于燒杯中,再加入1000 mL水,小火煮沸30 min,用紗布過濾,補(bǔ)足失水,制成10%豆芽汁,再按每100 mL豆芽汁加入5 g葡萄糖,繼續(xù)加熱至葡萄糖溶化,補(bǔ)足失水,pH自然。分裝、包扎,121 ℃滅菌20 min。

分離培養(yǎng)基(YEPD):蛋白胨20 g,酵母浸粉10 g,葡萄糖20 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH自然,121 ℃下滅菌20 min。配制YEPD固體培養(yǎng)基時(shí)加入20 g/L的瓊脂粉[9]。

發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨20 g,酵母浸粉10 g,葡萄糖100 g,硫酸鎂1 g,硫酸銨1 g,磷酸二氫鉀1 g,蒸餾水定容至1000 mL,pH自然,121 ℃下滅菌20 min[9]。

1.2.2 張弓老酒大曲中酵母菌的分離純化 取大曲樣品5 g,以無菌操作加入到195 mL富集培養(yǎng)基中加滅菌玻璃珠,于28 ℃,150 r/min,恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h。取富集菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋,依次得到10-1～10-7的7個(gè)梯度稀釋液。吸取10-5、10-6、10-7梯度稀釋液各200 μL,均勻涂布于YEPD固體培養(yǎng)基平皿上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,選取形態(tài)適宜的菌落通過美藍(lán)染色法進(jìn)行鏡檢,根據(jù)菌落特征及鏡檢確認(rèn)為酵母菌后,挑取單菌落在YEPD固體培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行平板劃線,得到單菌落后,與20%滅菌甘油按1∶1體積注入凍存管混勻,在-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 耐高溫酵母菌的篩選 將每株保藏的菌種以相同接種量接種至裝有10 mL YEPD液體培養(yǎng)基的試管中,于28 ℃,150 r/min,恒溫?fù)u床培養(yǎng)24 h。在超凈工作臺(tái)內(nèi),用接種環(huán)蘸取富集菌液一環(huán)在YEPD固體培養(yǎng)基平皿上進(jìn)行平板劃線,于45 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng),有菌落長出的平板對應(yīng)菌株為耐高溫酵母菌。

1.2.4 耐高溫酵母菌的鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將篩出的耐高溫酵母菌在YEPD固體培養(yǎng)基上進(jìn)行涂布,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,記錄耐高溫酵母菌的基本形態(tài)特征,并通過美藍(lán)染色法進(jìn)行制片,然后進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.2.4.2 分子生物學(xué)鑒定 26S rDNA序列分析:采用Ezup柱式酵母基因組DNA提取試劑盒提取分離菌株基因組DNA作為PCR反應(yīng)的模板。基因擴(kuò)增采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGG AAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′),反應(yīng)體系為50 μL(SanTaqPCRMix預(yù)混液25 μL,引物各2 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 19 μL)。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,53 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序,將測序所得到的特定序列,在NCBI上通過BLAST程序進(jìn)行菌株同源性比對[10];最后用MEGA X 10.0.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 耐高溫酵母菌的耐高溫性研究 菌種活化后,吸取200 μL接種于9.8 mL的YEPD液體培養(yǎng)基,分別在溫度為33、35、37、40、42、45、48 ℃的條件下靜置培養(yǎng)24 h,通過OD660 nm值反映生長情況[11]。

1.2.6 耐高溫酵母菌的耐乙醇性研究 菌種活化后,吸取200 μL分別接種于乙醇濃度為0、3%、6%、9%、12%的9.8 mL YEPD液體培養(yǎng)基試管中,在37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,通過OD660 nm值反映生長情況。

1.2.7 耐高溫酵母發(fā)酵力測定 菌種活化后,吸取2 mL接種于98 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在40 ℃下靜置培養(yǎng),每隔2 h測一次CO2失重量,記錄發(fā)酵終止時(shí)間,并使用蒸餾-酒精計(jì)法測定發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液的酒精度[12]。

1.2.8 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.8.1 溫度 菌種活化后,吸取2 mL接種于pH自然、糖濃度為100 g/L的98 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,分別在溫度為28、31、34、37、40、43 ℃的條件下靜置培養(yǎng)72 h,通過CO2失重量反映發(fā)酵情況[13]。

1.2.8.2 pH 菌種活化后,吸取2 mL分別接種于糖濃度為100 g/L、pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的98 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在最適發(fā)酵溫度下靜置培養(yǎng)72 h,通過CO2失重量反映發(fā)酵情況。

1.2.8.3 葡萄糖濃度 菌種活化后,吸取2 mL分別接種于最適pH、葡萄糖濃度為80、100、120、140、160、180 g/L的98 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中,在最適發(fā)酵溫度下靜置培養(yǎng)72 h,通過CO2失重量反映發(fā)酵情況。

1.2.8.4 接種量 菌種活化后,分別吸取含有8%、10%、12%、14%、16%的上述菌液2 mL接種于在最適糖濃度和最適pH的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在最適發(fā)酵溫度下靜置培養(yǎng)72 h,通過CO2失重量反映發(fā)酵情況。

1.2.9 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,進(jìn)行方差分析選出三個(gè)顯著性比較明顯的三個(gè)因素[14];以發(fā)酵溫度(A)、初始pH(B)、葡萄糖濃度(C)3個(gè)因素為自變量,將各自最優(yōu)條件的范圍編碼為-1、0、1,響應(yīng)面分析法的因素與水平表見表1,利用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn),確定耐高溫酵母菌株的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)組合并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證[15]。

表1 響應(yīng)面分析法的因素與水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素試驗(yàn)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,利用Design Expert 8.0.6軟件方差分析和設(shè)計(jì)BoxBehnken試驗(yàn),建立模型并進(jìn)行多元回歸分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理以及顯著性分析采用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲中耐高溫酵母菌的分離純化

通過豆芽汁培養(yǎng)基富集培養(yǎng),YEPD固體培養(yǎng)基劃線分離,從大曲中篩出了100株酵母菌,又經(jīng)45 ℃耐高溫培養(yǎng)最終篩選出一株菌落形態(tài)較好的耐高溫酵母菌,編號為ZG-3,如圖1所示。菌株ZG-3呈白色,菌落為圓形,邊緣整齊,表面光滑。

圖1 ZG-3菌落圖Fig.1 ZG-3 colony map

2.2 耐高溫酵母菌的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 制作美藍(lán)染色涂片在顯微鏡下觀察菌株ZG-3,結(jié)果如圖2所示,菌體多呈卵圓形或圓形,并以芽殖的方式進(jìn)行繁殖,存在單個(gè)或多個(gè)連接成串的菌體,結(jié)合菌落特征,可知ZG-3符合酵母菌形態(tài)[16]。

圖2 ZG-3鏡檢圖(100×)Fig.2 ZG-3 Microscopic view(100×)

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將菌株ZG-3進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖3所示。

圖3 酵母菌26 S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Yeast 26 S rDNA PCR amplification results注:M為DNA Marker,ZG-3為菌株。

經(jīng)檢測ZG-3長度在600 bp,這與酵母菌的D1/D2區(qū)域序列長度相符合,說明擴(kuò)增正常。將測序所得到的特定序列,在NCBI上通過Blast程序進(jìn)行同源性比較與分析,采用MEGA X 10.0.2軟件中的鄰接(neighbor joining,NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,結(jié)果見圖4,確定其與庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)相似性達(dá)100%,因此確定菌株ZG-3為庫德里阿茲威畢赤酵母。

圖4 基于26S rDNA序列菌株ZG-3的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain ZG-3 based on 26S rDNA sequence

2.3 耐高溫酵母菌的性質(zhì)研究

溫度在酵母的生長及發(fā)酵過程中起至關(guān)重要的作用。從圖5可得菌株ZG-3在YEPD液體培養(yǎng)基中33～37 ℃時(shí)對應(yīng)的OD值呈上升趨勢,在37～48 ℃時(shí)呈下降趨勢,在37 ℃條件培養(yǎng)下菌體生長量最高,45 ℃時(shí)仍有菌體生長,而48 ℃時(shí)無菌體生長,因此菌株ZG-3的最適生長溫度為37 ℃,最高生長溫度為45 ℃。卜文靜等篩選出耐高溫釀酒酵母L-9a最高生長溫度40 ℃[17];譚才鄧等[18]篩選出一株耐高溫高鹽生香酵母菌PX-8,最高生長溫度40 ℃;李王強(qiáng)等[19]篩選的馬克思克魯維酵母菌A2-13、庫德畢赤酵母菌A2-1最高耐受溫度42 ℃;本實(shí)驗(yàn)比他們所篩的耐高溫酵母菌耐高溫能力高;與石嬌嬌等[20]從自然發(fā)酵的甜面醬中篩選得到6株耐45 ℃高溫的生香酵母相比,耐高溫能力相當(dāng)。

圖5 溫度對酵母菌ZG-3生長的影響Fig.5 Effect of temperature on ZG-3 growth of yeast

2.4 耐高溫酵母菌的耐乙醇性研究

由圖6可知,菌株ZG-3隨著乙醇濃度的增加,OD值不斷降低,當(dāng)乙醇濃度高于6%時(shí)菌體生長明顯受到抑制,乙醇濃度12%時(shí)仍有菌體生長,而乙醇濃度達(dá)15%時(shí),菌株ZG-3不再生長,因此,菌株ZG-3耐乙醇濃度可達(dá)12%;高于姚曉瑞寧[21]等篩選的菌株D4、13耐乙醇濃度的9%,以及劉超帝等[7]篩選的馬克斯克魯維酵母KMBM2-5的6%;與譚才鄧等[18]篩選的庫德畢赤酵母菌A2-1耐乙醇濃度12%能力相當(dāng)。由此可見ZG-3是一株很有應(yīng)用開發(fā)潛力的耐高溫耐乙醇的酵母菌。

圖6 初始乙醇濃度對酵母菌的影響Fig.6 Effect of initial ethanol concentration on yeast

2.5 酵母菌的發(fā)酵力測定

在40 ℃下用含糖10%的發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株ZG-3,每隔2 h測定二氧化碳失重量,至CO2失重量不再減少,記錄發(fā)酵時(shí)間為72 h,測得CO2失重量為7.40 g,酒精度為4.7%vol。

2.6 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 溫度對酵母菌發(fā)酵性的影響 由圖7可知,菌株ZG-3在發(fā)酵培養(yǎng)基中28～40 ℃下CO2失重量不斷增加,在40～43 ℃下CO2失重量不斷減少,表明菌株ZG-3的最適發(fā)酵溫度為40 ℃。

圖7 溫度對酵母菌發(fā)酵性的影響Fig.7 Effect of temperature on yeast fermentability

2.6.2 pH對酵母菌發(fā)酵性的影響 由圖8可知,當(dāng)發(fā)酵pH為5.0時(shí),CO2失重量達(dá)到最高為7.59 g。表明pH=5.0是菌株ZG-3在發(fā)酵培養(yǎng)基中最適發(fā)酵pH。酵母細(xì)胞的生長和胞內(nèi)酶促反應(yīng)都需要在一定的pH環(huán)境中進(jìn)行,pH過高或過低都會(huì)影響酵母細(xì)胞膜所帶電荷狀態(tài),使酵母生長代謝受阻[22]。

圖8 初始pH對菌株ZG-3的發(fā)酵力影響Fig.8 Effect of initial pH on the fermenting power of strain ZG-3

2.6.3 葡萄糖濃度對酵母菌發(fā)酵性的影響 初始碳源的濃度對發(fā)酵也會(huì)產(chǎn)生影響,在工業(yè)化生產(chǎn)中,糖濃度一般不超過20%[22]。由圖9可知,當(dāng)初始葡萄糖濃度為140 g/L時(shí),CO2失重量達(dá)到最高為8.11 g。表明在發(fā)酵培養(yǎng)基中140 g/L是菌株ZG-3的最適葡萄糖濃度。

圖9 葡萄糖濃度對菌株ZG-3的發(fā)酵力影響Fig.9 Effect of glucose concentration on thefermentation capacity of strain ZG-3

2.6.4 接種量對酵母菌發(fā)酵性的影響 向pH為5、初始糖濃度140 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基接入不同量的菌液后在40 ℃培養(yǎng)菌株ZG-3,待發(fā)酵結(jié)束后測定CO2失重量,結(jié)果如圖10所示。當(dāng)接種量為12%時(shí),CO2失重量達(dá)到最高為8.17 g。表明菌株ZG-3的最適接種量是12%。

圖10 接種量對酵母菌發(fā)酵性的影響Fig.10 Effect of inoculation amount on yeast fermentability

2.7 重要因素篩選

根據(jù)表2～表5的方差分析結(jié)果可知,接種量的P值相對于發(fā)酵溫度、初始pH和葡萄糖濃度大,所以響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中選取發(fā)酵溫度、初始pH、葡萄糖濃度三個(gè)具有顯著影響的因素作為自變量。

表2 溫度對酵母發(fā)酵性的影響方差分析Table 2 Analysis of the effect of temperature on yeast fermentability

表3 pH對酵母菌發(fā)酵性的影響方差分析Table 3 Analysis of the effect of pH on the fermentability of yeast

表4 葡萄糖濃度對酵母菌發(fā)酵性的影響方差分析Table 4 Analysis of the effect of glucose concentration on yeast fermentability

表5 接種量對酵母菌發(fā)酵性的影響方差分析Table 5 Analysis of the effect of inoculum size on yeast fermentability

2.8 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

2.8.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)了17個(gè)試驗(yàn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn),以菌株的發(fā)酵結(jié)束后CO2失重量作為響應(yīng)值,選取發(fā)酵溫度、初始pH、葡萄糖濃度三個(gè)具有顯著影響的因素作為自變量,試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。

表6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 6 Box-Behnken test design and results

采用Design Expert 8.0.6軟件對表6數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合,得到CO2失重量對A:發(fā)酵溫度(℃)、B:初始pH、C:葡萄糖濃度(g/L)的多元回歸方程為:Y=8.96+5.0×10-3A-0.097B+0.28C-0.13AB-0.043AC+0.072BC-1.46A2-1.00B2-0.90C2?；貧w方程決定系數(shù)R2=94.36%,表明94.36%的CO2失重量變化量可由此模型解釋,且實(shí)際值與預(yù)測值之間的擬合度和可信度良好。

回歸方程的方差分析結(jié)果見表7,整個(gè)模型極顯著,回歸模型F值為13.00,顯著性檢驗(yàn)為極顯著(P=0.0014<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P=0.0646>0.05),說明該模型余實(shí)際情況擬合良好。發(fā)酵溫度、pH、葡萄糖濃度三個(gè)因素及其之間的交互作用都不顯著,A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01)。該方程為ZG-3菌株發(fā)酵產(chǎn)酒精提供了一個(gè)合適的模型,因此可用上述模型代替實(shí)際實(shí)驗(yàn)對ZG-3菌株酒精發(fā)酵情況進(jìn)行分析和預(yù)測。

表7 響應(yīng)面回歸方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of response surface regression equation

2.8.2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖 利用Design-Expert 8.0.6軟件對二次響應(yīng)面回歸模型做出相應(yīng)的響應(yīng)曲面,結(jié)果如圖11所示。

2.8.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 由回歸模型繪制的響應(yīng)面圖所示,回歸模型存在最大點(diǎn),為A=40.004,B=4.978,C=143.091,在此條件下理論預(yù)測CO2失重量為8.988 g,根據(jù)實(shí)際情況將參數(shù)修改為:A=40,B=5,C=140。即得最佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度40 ℃,pH為5,葡萄糖濃度140 g/L,實(shí)驗(yàn)的實(shí)際值8.48 g,與預(yù)測值基本接近,說明所建模型擬合良好且可靠。采用蒸餾-酒精計(jì)法測得優(yōu)化后的ZG-3的酒精產(chǎn)量為5.2%vol。

3 結(jié)論

經(jīng)富集、純化、耐高溫篩選等操作從大曲中分離得到一株耐高溫酵母菌,編號為ZG-3,經(jīng)分子生物學(xué)鑒定,確定菌株ZG-3為庫德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii)。其最高生長溫度為45 ℃,耐乙醇能力可達(dá)12%。菌株ZG-3在40 ℃下發(fā)酵72 h,酒精產(chǎn)量為4.7%vol;通過響應(yīng)面法優(yōu)化,當(dāng)接種量12%、發(fā)酵溫度40 ℃、發(fā)酵pH為5和初始葡萄糖濃度140 g/L時(shí),菌株ZG-3的酒精產(chǎn)量可以達(dá)到5.2%vol,由此可見ZG-3是一株很有應(yīng)用開發(fā)潛力的耐高溫耐乙醇的酵母菌。