丁從文,馮 群,李春煥

(1.桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析和污染控制重點(diǎn)試驗(yàn)室,廣西百色 533000; 2.百色學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,廣西百色 533000)

芒果營(yíng)養(yǎng)成分豐富,不僅富含膳食纖維和維生素C,還含有高含量的維生素A前體β-胡蘿卜素和和類胡蘿卜素[1]。芒果炭疽病是影響芒果營(yíng)養(yǎng)、品質(zhì)及市場(chǎng)價(jià)值的重要采后病害[2]。目前,芒果炭疽病控制仍然依賴于化學(xué)殺菌劑,但長(zhǎng)期使用會(huì)造成病原抗藥、環(huán)境污染和健康風(fēng)險(xiǎn)[3]。利用細(xì)菌、酵母菌等微生物防治作為可以替代化學(xué)殺菌劑防治的新手段已被廣泛研究[4-5]。

拮抗細(xì)菌已被發(fā)現(xiàn)可有效控制果蔬采后病害[6-9]。芽孢桿菌屬(Bacillus)是常見的拮抗細(xì)菌屬,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)是芽孢桿菌屬(Bacillus)的一個(gè)種,許多研究表明巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)對(duì)一些食品病原菌,如魔芋軟腐病菌,青枯雷爾氏菌,番茄灰霉病原菌,香蕉灰斑病菌,花生黃曲霉菌等均有一定抑制作用[10-14]。

本文將首次研究源于百色巖溶區(qū)的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01對(duì)采后芒果炭疽病菌的抑制作用,并著重闡明其對(duì)采后芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)的抑菌機(jī)制,為巨大芽孢桿菌菌株發(fā)酵液防治采后芒果炭疽病菌的作用機(jī)理的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)菌株 百色市凌云縣巖溶區(qū)芒果園根際土壤,分離鑒定后保存于桂西區(qū)域生態(tài)環(huán)境分析與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室芽孢桿菌菌株儲(chǔ)藏室(菌株編號(hào)為L(zhǎng)B01);炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides) 百色學(xué)院大型真菌研發(fā)中心提供;七至八成熟“金煌”芒果 百色市凌云縣巖溶區(qū)芒果實(shí)驗(yàn)果園;PI(碘化丙啶)、DCHF-DA(2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯)、MitoTracker? Orange CMTMRos生物染色劑(BS) 上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司;DMSO(二甲基亞砜)、TBA(硫代巴比妥酸) 分析純(AR)濟(jì)南恒化科技有限公司。

MF20-3微孔膜過濾器 海寧市中力過濾設(shè)備廠;Countess II FL全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司;FYL-YS-280L中型恒溫冷藏箱 北京福意電器有限公司;WDZX-300KC臥式壓力蒸汽滅菌鍋 廣州瑞豐實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;OLB-211B恒溫?fù)u床振蕩器 濟(jì)南來寶實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司;TGL-16M高速冷凍離心機(jī) 上海聚萊實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;Axioskop 40蔡司熒光顯微鏡、Axiocam MRC 10數(shù)碼相機(jī) 德國(guó)奧伯科興卡爾蔡司公司;V-1200分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 芒果果實(shí)的處理 芒果果實(shí)未受到任何損傷與感染,根據(jù)芒果果實(shí)的體積大小進(jìn)行分類,然后采用1%(v/v)的NaClO溶液對(duì)選擇好的芒果進(jìn)行表面消毒2 min,利用無菌蒸餾水進(jìn)行洗滌,使用前于通風(fēng)處進(jìn)行風(fēng)干。

1.2.2 培養(yǎng)基的配制 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基及溶菌酶肉湯(LB)培養(yǎng)基配方見《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[15]。

1.2.3 巨大芽孢桿菌LB01菌株發(fā)液的制備 菌株LB01經(jīng)活化后倒入LB液體培養(yǎng)基中,以180 r/min的轉(zhuǎn)速于搖床上36 ℃恒溫培養(yǎng)48 h,收集菌株發(fā)酵液,11000×g離心6 min后,取上清液經(jīng)孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌,收集無菌發(fā)酵濾液置于0～4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 炭疽病菌孢子懸浮液的制備 將炭疽病菌(C.gloeosporioides)于PDA培養(yǎng)基25 ℃培養(yǎng)7～14 d,采用無菌去離子水沖洗培養(yǎng)物,用無菌玻璃棒摩擦孢子,再經(jīng)雙層紗布過濾,孢子懸浮液用1～4 mL無菌去離子水稀釋并借助細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)節(jié)濃度至1.0×104conidia/mL。

1.2.5 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)采后芒果發(fā)病率及病斑擴(kuò)展的影響 參考李春玲等[16]報(bào)道的測(cè)定方法,采用一枚無菌針于芒果果實(shí)腰部產(chǎn)生直徑為4.0 mm、深度為2.5 mm的傷口,然后將其浸在1.5 L LB01菌株發(fā)酵濾液中,等體積的無菌蒸餾水代替LB01菌株發(fā)酵濾液作為對(duì)照。50 min后取出芒果,于通風(fēng)處自然風(fēng)干2 h后,于每個(gè)芒果果實(shí)的傷口中心注入3 μL炭疽病菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL),所有供試芒果均在25 ℃恒溫儲(chǔ)存。儲(chǔ)存0、7和10 d測(cè)定LB01菌株發(fā)酵濾液對(duì)芒果果實(shí)的發(fā)病率及病斑直徑的影響。每處理15個(gè)芒果果實(shí),重復(fù)3次,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 采用文獻(xiàn)[17]報(bào)道的測(cè)定方法,將3.0 μL LB01菌株發(fā)酵濾液加到80 mL熔化的PDA培養(yǎng)基中配成含藥培養(yǎng)基,用無菌打孔器(d=5 mm)在生長(zhǎng)8 d的菌落邊沿打孔,然后將菌餅接種于含藥培養(yǎng)基中央,用保鮮保濕膜密封并于25 ℃恒溫培育24、36、48、72、96和120 h。用無菌蒸餾水代替LB01菌株發(fā)酵濾液作為對(duì)照。測(cè)定LB01菌株發(fā)酵濾液對(duì)芒果炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用。每次處理重復(fù)3次,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.7 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)的影響 根據(jù)文獻(xiàn)[13]描述的測(cè)定方法,將100 μL孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)、1.2 mL PDB培養(yǎng)基和3.0 μL LB01菌株發(fā)酵濾液加到2.5 mL離心管中。取150 μL混合液均勻涂在載玻片上,然后將其置于底部鋪有圓形濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中,于25 ℃恒溫培育6、8、10和12 h。用無菌蒸餾水代替LB01菌株發(fā)酵濾液作為對(duì)照。測(cè)定LB01菌株發(fā)酵濾液對(duì)芒果炭疽病菌孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)的抑制作用。每次處理至少檢查300個(gè)孢子,每個(gè)處理均重復(fù)3次,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.8 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)活性氧(ROS)水平的影響 根據(jù)Shi等[18]報(bào)道的ROS水平的測(cè)定方法,采用氧化劑敏感探針2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCHF-DA)測(cè)定炭疽菌細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平。將300 μL炭疽菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到3 mL含有3.0 μL LB01菌株發(fā)酵濾液的PDB培養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床(25 ℃,200 r/min)振蕩培養(yǎng),用無菌蒸餾水代替B01菌株發(fā)酵濾液作為對(duì)照。分別于6、12和18 h后取出10 μL孢子液于0～4 ℃離心(5000 r/min)10 min,采用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)洗滌,并在含有10 μmol/L DCHF-DA(溶于二甲基亞砜)的相同緩沖液中避光孵育5 min。于蔡司熒光顯微鏡下觀察,并計(jì)算每次處理中被DCHF-DA染色的孢子細(xì)胞百分比(%)。每個(gè)處理重復(fù)兩次,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)丙二醛(MDA)含量的影響 根據(jù)Wang 等[19]報(bào)道的MDA含量的測(cè)定方法,將30 μL炭疽病菌的孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到100 mL PDB培養(yǎng)基中,混勻后于25 ℃以200 r/min的轉(zhuǎn)速在搖床上培養(yǎng)3 d后收集菌絲體。取2 g菌絲體置于含有100 mL PDB培養(yǎng)基的錐形瓶中,加入30 μL LB01菌株發(fā)酵濾液,混勻后于200 r/min 25 ℃恒溫?fù)u床離心培養(yǎng)0、6、12和18 h,吸取上清液1 mL加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,混勻后于95 ℃恒溫加熱20 min,迅速于冰浴上冷卻5 min,然后12000×g離心10 min,于600和532 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。等體積的無菌蒸餾水代替LB01菌株發(fā)酵濾液作對(duì)照。每個(gè)處理有3次重復(fù),整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。按照下列公式算出MDA濃度C(nmol/mL),再換算出單位質(zhì)量菌絲中MDA含量(nmol/mg)。

式中:C表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液摩爾濃度,nmol/mL;A532和A600分別表示樣品中MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532和600 nm波長(zhǎng)處的吸光度值;E表示樣品中MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物的消光系數(shù),mmol/cm;L表示比色皿厚度,cm。

1.2.10 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)線粒體分布的影響 采用Shi等[18]報(bào)道的線粒體分布的測(cè)定方法,檢測(cè)LB01菌株發(fā)酵濾液對(duì)炭疽病菌孢子中線粒體分布的影響。將300 μL炭疽病菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到3 mL含有3.0 μL LB01菌株發(fā)酵濾液的PDB培養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床(25 ℃,200 r/min)培養(yǎng),用等體積無菌蒸餾水代替LB01菌株發(fā)酵濾液作為對(duì)照。25 ℃培養(yǎng)2、6、12和18 h后取出15 μL孢子液,加入0.1 μL線粒體選擇性染色劑(MitoTracker? Orange CMTMRos),對(duì)孢子線粒體染色5 min,采用蔡司熒光顯微鏡觀察拍照,每次處理至少檢查20 個(gè)孢子,重復(fù)3次。

1.2.11 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響 采用黃云坡等[20]報(bào)道的細(xì)胞膜完整性的測(cè)定方法,將200 μL炭疽菌孢子懸浮液(1.0×104conidia/mL)加到2 mL含有3.0 μL LB01菌株發(fā)酵濾液的PDB培養(yǎng)基中,恒溫?fù)u床(27 ℃,190 r/min)振蕩培養(yǎng)(用等體積的無菌蒸餾水代替LB01菌株發(fā)酵濾液作為對(duì)照),分別于6、12和18 h后取出15 μL孢子液于4 ℃離心(5000 r/min)15 min,采用10 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=7.0)洗滌2 次,加入10 μmol/L碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色劑進(jìn)行染色,通過蔡司熒光顯微鏡觀察,采用數(shù)碼相機(jī)拍照。每個(gè)樣本隨機(jī)選取3個(gè)視野,并將亮場(chǎng)中的孢子數(shù)定義為總數(shù)。每個(gè)處理重復(fù)3次,整個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。膜完整性(Membrane integrity,MI)用以下公式計(jì)算。

式中:MI表示孢子細(xì)胞膜完整性,%;Fn表示熒光場(chǎng)中的孢子數(shù);Bn表示明亮場(chǎng)中的孢子數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件均使用SPSS 11.5版(SPSS公司,美國(guó)芝加哥)進(jìn)行,通過單因素方差(ANOVA)進(jìn)行分析。平均值偏離數(shù)由Duncan的多范圍測(cè)試進(jìn)行。相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定值的差異分別被界定為顯著性差異(P<0.05)與極顯著性差異(P<0.01)。

2 結(jié)果和分析

2.1 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)采后芒果發(fā)病率及病斑擴(kuò)展的影響

由圖1A可知,接種后儲(chǔ)存7和10 d,對(duì)照組芒果果實(shí)發(fā)病程度嚴(yán)重,而LB01菌株發(fā)酵濾液處理7和10 d后芒果果實(shí)發(fā)病程度輕微;由圖1B可知,接種后儲(chǔ)存7 d時(shí),對(duì)照組芒果果實(shí)已完全發(fā)病,而LB01菌株發(fā)酵濾液處理7 d后芒果果實(shí)發(fā)病率僅為46.8%;由圖1C可知,接種后儲(chǔ)存7、10 d時(shí),對(duì)照組芒果果實(shí)病斑直徑分別擴(kuò)展至28.33和66 mm,而LB01菌株發(fā)酵濾液處理7和10 d后芒果果實(shí)病斑直徑分別僅為5.67和15 mm,病斑直徑分別減少79.98%和77.12%。由此可見,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發(fā)酵濾液能顯著抑制采后芒果發(fā)病率及病斑擴(kuò)展。

圖1 B. megaterium LB01的體內(nèi)抑菌效應(yīng)Fig.1 Anti-fungal effect of B. megaterium LB01 against C. gloeosporioides in vivo注:A.芒果果實(shí)炭疽病的癥狀;B.芒果發(fā)病率隨處理時(shí)間的改變情況;C.芒果病斑直徑隨處理時(shí)間的改變狀況;**表示同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與處理組測(cè)定值存在極顯著差異(P<0.01)。

2.2 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)菌絲生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的影響

如圖2A所示,培養(yǎng)120 h,對(duì)照組炭病疽菌菌絲顏色仍然保持白色,而LB01菌株發(fā)酵濾液處理96 h后,菌絲顏色則已變灰;由圖2B可知,培養(yǎng)96 h,對(duì)照組菌落(colony diameter)直徑已達(dá)12.62 mm,而LB01菌株發(fā)酵濾液處理120 h后菌落直徑僅為8.56 mm。由此可見,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發(fā)酵濾液能顯著抑制采后芒果炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)。

圖2 B. megaterium LB01對(duì)炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of B. megaterium LB01 on mycelialgrowth of C. gloeosporioides in vitro注:A.炭疽病菌的體外癥狀;B.炭疽病菌的菌落直徑;**表示同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與處理組測(cè)定值具有極顯著差異(P<0.01)。

如圖3A所示,培養(yǎng)8 h,對(duì)照組已有93.31%的孢子萌發(fā)(conidial germination),而LB01菌株發(fā)酵濾液處理10 h后孢子僅有86.37%萌發(fā);由圖3B可知,培養(yǎng)6 h,對(duì)照組芽管長(zhǎng)度(germ tube length)已達(dá)121.22 μm,而LB01菌株發(fā)酵濾液處理8 h后芽管長(zhǎng)度僅為103.16 μm。由此說明,巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發(fā)酵濾液能顯著抑制采后芒果炭疽菌的孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)。

圖3 B. megaterium LB01對(duì)炭疽病菌孢子萌發(fā)及芽管長(zhǎng)度的影響Fig.3 Effects of B. megaterium LB01 on spore germinationand germ tube length of C. gloeosporioides in vitro注:A.孢子萌發(fā)率;B.芽管長(zhǎng)度;*表示同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與處理組測(cè)定值存在顯著差異(P<0.0 5)。

2.3 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)炭疽菌孢子ROS水平的影響

利用氧化劑敏感探針(DCFH-DA)對(duì)炭疽菌孢子細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)實(shí)行染色,染色率測(cè)定的結(jié)果如圖4顯示。在培養(yǎng)至第6和12 h后,處理組有73.24%和84.31%的孢子已被DCFH-DA染色劑染色,而對(duì)照組染色率分別僅為65.25%和72.23%,平均低于處理組測(cè)定值約10個(gè)百分點(diǎn)。這些數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果表明,巨大芽孢桿菌(B.megaterium)LB01菌株發(fā)酵濾液能顯著誘導(dǎo)炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生與積累。

圖4 B. megaterium LB01對(duì)炭疽病菌孢子活性氧產(chǎn)生的影響Fig.4 Effects of B. megaterium LB01 on the generation ofROS in spores of C. gloeosporioides注:*和**分別表示對(duì)照組與處理組測(cè)定值具有顯著性差異(P<0.05)和極顯著性差異(P<0.01)。

2.4 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)炭疽菌MDA含量的影響

由圖5可知,接種后培養(yǎng)6 h后,處理組MDA含量已經(jīng)高達(dá)0.78 nmol/mg,而對(duì)照組培養(yǎng)12 h后MDA含量?jī)H為0.62 nmol/mg;接種后培養(yǎng)0 h時(shí),對(duì)照組與處理組的MDA含量均為0.52 nmol/mg,但培養(yǎng)6 h時(shí),對(duì)照組MDA含量升高至0.61 nmol/mg,而處理組MDA含量卻加速升高至0.78 nmol/mg。處理組MDA 含量的顯著升高表明細(xì)胞內(nèi)部已受到ROS的嚴(yán)重氧化損傷。

圖5 B. megaterium LB01對(duì)炭疽病菌中MDA含量的影響Fig.5 Effects of B. megaterium LB01 on theMDA content of C. gloeosporioides注:*表示同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組與處理組病原菌測(cè)定值具有顯著性差異(P<0.05)。

2.5 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)炭疽菌孢子中線粒體分布的影響

采用線粒體選擇性染色劑(MitoTracker? Red CMTMRos)對(duì)病原菌孢子內(nèi)線粒體進(jìn)行染色,處理結(jié)果如圖6所示。對(duì)照組孢子中有大量的線粒體均勻出現(xiàn)在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)間隙中,發(fā)出一定強(qiáng)度的熒光,12、18 h后孢子熒光沒有顯著改變。但經(jīng)LB01菌株發(fā)酵濾液處理12 h后,孢子熒光強(qiáng)度變得微弱,孢子內(nèi)線粒體分布集中且不均勻,處理18 h后,處理組孢子內(nèi)的熒光已經(jīng)非常微弱,此刻大多數(shù)線粒體可能因降解而損壞。

圖6 B. megaterium LB01對(duì)炭疽病菌孢子中線粒體分布的影響Fig.6 Effect of B. megaterium LB01 on thedistribution of mitochondria in spores of C. gloeosporioides注:孢子于25 ℃培養(yǎng),棒子表示10 μm。

2.6 巨大芽孢桿菌LB01菌株對(duì)炭疽菌孢子膜完整性的影響

基于圖7A中的碘化丙啶(PI)對(duì)孢子的染色結(jié)果,可以斷定,經(jīng)B.megateriumLB01菌株發(fā)酵濾液處理的孢子細(xì)胞膜完整性(membrane integrity)受到嚴(yán)重破壞,PI染色率顯著高于對(duì)照組;由圖7B可知,培養(yǎng)6、12和18 h后,對(duì)照組孢子細(xì)胞膜完整性分別已達(dá)98.32%、84.23%和65.34%,而LB01菌株發(fā)酵濾液處理6、12和18 h后孢子細(xì)胞膜完整性分別僅為73.21%、68.31%和43.18%。由此說明,B.megateriumLB01對(duì)炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子細(xì)胞膜具有顯著的破壞作用。

圖7 B. megaterium LB01對(duì)炭疽病菌孢子細(xì)胞膜完整性的影響Fig.7 Effects of B. megaterium LB01 on the membrane integrity of spores of C. gloeosporioides注:*和**分別表示對(duì)照組與處理組測(cè)定值具有顯著性差異(P<0.05)和極顯著性差異(P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

近年來,國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)一些芽孢桿菌屬細(xì)菌,如解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)DGA14[21]、熒光假單胞桿菌(fluorescensMigula)A1[22]和芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)LB72[23]對(duì)采后芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)均具有一定的抑制作用。但是,關(guān)于巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)對(duì)芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)的抑制作用及其作用機(jī)理的報(bào)道,相關(guān)文獻(xiàn)極其甚少。本文研究了芽孢桿菌屬細(xì)菌巨大芽孢桿菌(B.megaterium)LB01菌株發(fā)酵濾液對(duì)采后芒果炭疽病菌的抑菌效果,并對(duì)其抑制作用機(jī)理進(jìn)行了初步探究。

與對(duì)照組相比,處理組B.megateriumLB01對(duì)芒果采后炭疽病的發(fā)病率和發(fā)病程度均有顯著的影響,表明LB01菌株發(fā)酵濾液對(duì)采后芒果果實(shí)炭疽病具有較強(qiáng)的抑制效果。體外培養(yǎng)的C.gloeosporioides經(jīng)巨大芽孢桿菌LB01的處理,C.gloeosporioides的菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)及芽管伸長(zhǎng)均均受到顯著抑制。C.gloeosporioides細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及線粒體分布狀況和降解程度均是影響炭疽病原菌生長(zhǎng)及孢子萌發(fā)的重要指標(biāo)。

活性氧(ROS)能對(duì)細(xì)胞中的化合物造成氧化損傷,并導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙甚至細(xì)胞死亡[24-25]。在所有細(xì)胞中,ROS的產(chǎn)生和清除之間存在著適當(dāng)?shù)募?xì)胞內(nèi)平衡。氧化還原動(dòng)態(tài)平衡要求不同細(xì)胞間反應(yīng)的有效協(xié)調(diào),并受復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)路徑控制[26]?；钚匝?ROS)是呼吸作用常見的產(chǎn)物之一,但其產(chǎn)生與積累至一定程度,除了可破壞細(xì)胞內(nèi)平衡,還可與細(xì)胞內(nèi)生物大分子(脂質(zhì)、蛋白質(zhì)及DNA)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[27-28]。本研究的炭疽菌經(jīng)LB01菌株發(fā)酵濾液處理6、12 h后,孢子內(nèi)活性氧(ROS)水平顯著升高,說明巨大芽孢桿菌LB01菌株發(fā)酵濾液能誘導(dǎo)孢子內(nèi)活性氧大量產(chǎn)生而對(duì)菌絲造成損傷直至死亡;丙二醛(MDA)是細(xì)胞內(nèi)部生物大分子(如脂質(zhì))過氧化的產(chǎn)物,它是細(xì)胞內(nèi)部生物大分子氧化損傷程度一個(gè)重要指標(biāo)[29],本研究采用巨大芽孢桿菌LB01菌株發(fā)酵濾液處理6 h后,MDA含量顯著升高,此時(shí)細(xì)胞內(nèi)部 MDA 的含量是對(duì)照值的1.5倍,MDA含量的顯著升高暗示病原菌菌絲細(xì)胞內(nèi)部已受到嚴(yán)重的氧化損傷,最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

因此,巨大芽孢桿菌LB01菌株發(fā)酵濾液能顯著誘導(dǎo)炭疽菌孢子內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生和積累及促進(jìn)菌絲中丙二醛(MDA)含量的升高,表明菌絲和孢子細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì)可能已經(jīng)受到嚴(yán)重的氧化損傷,從而抑制病原菌孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng),這可能是巨大芽孢桿菌LB01抑制采后芒果炭疽病菌生長(zhǎng)從而防治采后芒果炭疽病的機(jī)制之一。

眾所周知,線粒體是細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)的主要來源,在多種細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡等過程中起著核心作用[30-31],本研究顯示巨大芽孢桿菌LB01菌株發(fā)酵濾液處理后炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子內(nèi)線粒體熒光變暗,表明巨大芽孢桿菌LB01對(duì)線粒體具有一定的損傷作用,可能導(dǎo)致活性下降,對(duì)細(xì)胞正常的新陳代謝活動(dòng)造成一定的影響。同時(shí),線粒體呼吸活動(dòng)也是ROS的主要內(nèi)生源,ROS大量產(chǎn)生和積累不僅可引起線粒體DNA(mtDNA)突變、衰老和細(xì)胞凋亡[32-33],還可引起線粒體電子傳遞信息中斷,從而進(jìn)一步促使線粒體內(nèi)ROS的產(chǎn)生[34-35],二者交替進(jìn)行,最后造成細(xì)胞凋亡。本研究表明,炭疽菌孢子內(nèi)線粒體在經(jīng)B.megateriumLB01發(fā)酵濾液處理后,熒光微弱、分布集中且嚴(yán)重降解,從而導(dǎo)致C.gloeosporioides孢子線粒體的氧化損傷。因此,病原菌孢子的活性氧(ROS)積累和線粒體降解可能是B.megateriumLB01抑制C.gloeosporioides生長(zhǎng)的重要方式之一,從而抑制采后芒果果實(shí)炭疽病的發(fā)生。

在本研究中,芒果果實(shí)活體接種7和10 d后,經(jīng)巨大芽孢桿菌LB01發(fā)酵濾液處理的芒果果實(shí)顏色仍呈黃色,但對(duì)照組已變?yōu)槌壬?這表明巨大芽孢桿菌LB01在芒果采后衰老控制中起重要作用。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道芒果是一種對(duì)乙烯敏感的更年期水果,在衰老過程中呼吸作用與乙烯產(chǎn)生均顯著增加[36],乙烯在植物種子萌發(fā)、植物生長(zhǎng)、果實(shí)成熟、器官脫落和衰老以及抗病性等生理過程中起著重要作用[37]。本研究的巨大芽孢桿菌LB01菌株發(fā)酵濾液可能抑制了芒果果實(shí)中乙烯的產(chǎn)生或阻止乙烯與炭疽菌受體的結(jié)合,減少芒果腐爛,使芒果果實(shí)炭疽病的癥狀降低。而對(duì)照組芒果體內(nèi)乙烯自由釋放以致芒果后熟與衰老加快。因此,延緩芒果果實(shí)衰老也可能是巨大芽孢桿菌LB01抑制采后芒果炭疽病害的另一機(jī)制。

綜上所述可以得出,本研究證實(shí)了從廣西凌云縣巖溶區(qū)芒果根邊候選土壤中分離的巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株發(fā)酵濾液通過直接抑制C.gloeosporioides孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng),從而抑制芒果采后炭疽病的發(fā)生。本研究結(jié)果為B.megateriumLB01對(duì)病原菌的抑制作用提供了一個(gè)機(jī)制框架,為芒果采后貯藏病害防治提供了一個(gè)較有前景的有效策略,為研發(fā)巨大芽孢桿菌(B.megaterium)LB01菌株防治采后芒果炭疽病的深層次作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。