徐文秀,劉 俊

(運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系,山西運(yùn)城 044000)

紫槐,又名紅花洋槐(RobiniapseudoacaciaL.),屬豆科蝶形花亞科刺槐屬植物,為刺槐變種,因其花穗碩大,花期長而艷麗,是園林常用的觀賞樹種之一。紫槐有一定的抗旱能力,對土壤適應(yīng)性強(qiáng),廣泛分布于我國南北各地[1-2]。紫槐苗木主要依靠刺槐砧嫁接繁育而來,研究主要集中在嫁接技術(shù)[3-4]、組織培養(yǎng)及快速繁殖[5]方面。目前,對紫槐利用研究報(bào)道主要集中在紫槐葉營養(yǎng)成分分析及紫槐花色素提取及穩(wěn)定性研究方面[6-7]。通過過前期查閱資料及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測紫槐花色素屬于花青素類物質(zhì)。

花青素(Anthocyanidin),又稱花色素,是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,屬類黃酮化合物?；ㄇ嗨厥且环N強(qiáng)有力的抗氧化劑,它能夠保護(hù)人體免受自由基的損傷。花青素還能夠增強(qiáng)血管彈性,改善循環(huán)系統(tǒng)和增進(jìn)皮膚的光滑度,抑制炎癥和過敏,改善關(guān)節(jié)的柔韌性。目前,花青素含量測定方法有以下四種:單一pH法、差減法、pH示差法[8-10]和高效液相色譜法。單一pH法和差減法雖然操作簡便,但是其準(zhǔn)確度卻比較低,目前較少使用[11-12]。高效液相色譜法適用于分析樣品中不同種類花青素的含量,準(zhǔn)確率較高,但需要有標(biāo)物才能定性樣品,而且設(shè)備和標(biāo)品成本較為昂貴,限制了本方法應(yīng)用[13]。同前三種方法相比,pH示差法所需設(shè)備相對簡單,準(zhǔn)確性好,適用于對未知結(jié)構(gòu)花青素類物質(zhì)含量測定[14-16]。目前pH示差法已測定黑枸杞[12,14]、茄子皮[17]、紅菊苣[18]、藍(lán)莓[19]、各種顏色的花[20]、無花果皮[21]、紫蘇葉[22]等原料中花青素含量。但還未見運(yùn)用pH示差法對紫槐花花青素進(jìn)行測定的相關(guān)報(bào)道。

同傳統(tǒng)溶液提取法相比,利用超聲波技術(shù)輔助提取可以強(qiáng)化提取分離過程,可有效提高提取分離率,縮短提取時(shí)間、節(jié)約成本、甚至還可以提高產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量。本研究采用超聲波輔助提取,利用pH示差法對紅花刺槐色素產(chǎn)量進(jìn)行測定。研究紫槐花中提取色素最佳工藝,以期為紫槐花色素的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫槐花 采自運(yùn)城學(xué)院校區(qū),花苞飽滿未開放時(shí)采摘,干燥后密封包裝置于避光處保存,待用;檸檬酸 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;KCl 天津市瑞金特化學(xué)品有限公司;鹽酸 洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司;NaAc 天津市大茂化學(xué)試劑廠;以上試劑均為分析純。

UV6000PC紫外可見分光光度計(jì) 西安比諾儀器設(shè)備有限公司;TP213電子天平 海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫槐花色素提取工藝優(yōu)化

1.2.1.1 紫槐花色素最大吸收波長的確定 準(zhǔn)確稱取1.00 g干燥紫槐花,加入50 mL 0.1%檸檬酸溶液,60 ℃,300 W超聲波提取20 min,抽濾得濾液。用紫外可見分光光度計(jì),在波長220～760 nm掃描,確定紫槐花色素液最大吸收波長。

1.2.1.2 最佳提取劑的確定 稱取1.0 g紫槐花6份,分別加入100 mL 0.1%檸檬酸、0.1%鹽酸、0.1%硫酸、95%酸乙醇、乙醚、石油醚,于60 ℃,300 W超聲提取20 min,抽濾得濾液,取2 mL濾液用pH=1、4.5的緩沖液分別定容至20 mL,避光靜置1 h后兩組待測液,用紫外可見分光光度計(jì)分別測其波長在在520 nm及700 nm處吸光值,計(jì)算其中色素含量,確定最佳提取溶劑。

1.2.1.3 提取溶劑最佳pH確定 精確稱取6份1 g樣品,分別加入50 mL pH=1、2、3、4、5、6的檸檬酸水溶液,用保鮮膜封口,60 ℃,300 W超聲提取20 min,抽濾得濾液,取4 mL濾液用pH=1、4.5的緩沖液分別定容至20 mL,避光靜置1 h后兩組待測液用紫外可見分光光度計(jì)分別測其波長在在520 nm及700 nm處吸光值,計(jì)算其中色素含量,確定提取溶劑最佳pH。

1.2.1.4 紫槐花色素提取單因素實(shí)驗(yàn) 稱取一定量紫槐花干燥品,固定液料比50∶1 mL/g,超聲功率300 W,提取時(shí)間30 min,考察不同溫度(30、40、50、60、70、80 ℃)對紫槐花提取液中色素含量的影響;固定液料比50∶1 mL/g、超聲功率300 W,提取溫度60 ℃,考察不同提取時(shí)間(5、10、15、20、25、30 min)對紫槐花提取液中色素含量的影響;固定提取時(shí)間30 min、提取溫度60 ℃,超聲功率300 W,考察不同液料比(30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1 mL/g)對紫槐花提取液中色素含量的影響;固定提取時(shí)間30 min、提取溫度60 ℃,液料比50∶1 g/mL,考察超聲功率(200、250、300、350、400、450 W)對紫槐花提取液中色素含量的影響。

1.2.1.5 紫槐花色素提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取料液比、超聲時(shí)間和超聲功率3個(gè)因素采用Box-Behnken中心試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,以提取液中色素含量為指標(biāo),優(yōu)化提取工藝參數(shù),實(shí)驗(yàn)因素水平表如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Design of factors and levles

1.2.2 提取次數(shù)對色素提取的影響 稱取一定量新鮮樣品,按上述方法得到的最佳提取工藝參數(shù)超聲提取色素,提取完成后分離濾渣和提取液,濾渣再按相同條件提取,再次抽濾分離濾渣及濾液,反復(fù)4次。每次所得提取液,用pH示差法測其色素含量,確定最佳提取次數(shù)。

1.3 色素含量測定方法

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[20-22],色素含量采用pH示差法進(jìn)行測定。具體操作如下:

pH1.0 緩沖液:配制濃度為0.2 mol/L KCl溶液;配制0.2 mol/L鹽酸溶液;以25∶76的體積比混合,再用KCl溶液調(diào)pH至1.0±0.1。

pH4.5緩沖液:配制濃度為0.2 mol/L NaAc溶液,用鹽酸調(diào)pH至4.5±0.1。

從濾液中移取2 mL待測液于20 mL比色瓶中,分別用pH=1.0、pH=4.5的緩沖溶液定容,在30 ℃水浴中反應(yīng)平衡30 min。以蒸餾水作為空白對照,用紫外分光光度計(jì)測定花青素在520和700 nm處的吸光值,以矢車菊-3-葡萄糖苷計(jì),利用Fuleki公式對待測液中花青素含量進(jìn)行測定[23]。

ΔA=(A520 nm-A700 nm)pH=1.0-(A520 nm-A700 nm)pH=4.5

式(1)

式中,ΔA-紫槐花色素總吸光值;A520 nm-紫槐花色素在520 nm處的吸光值;A700 nm-紫槐花色素在700 nm處的吸光值;c-紫槐花色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/100 g);V-提取液總體積(mL);DF-稀釋倍數(shù);M-Cy-3-Glu(矢車菊-3-葡萄糖苷)的相對分子質(zhì)量(449.2 g/mol);ε-Cy-3-Glu(矢車菊-3-葡萄糖苷)的消光系數(shù)(29600 L·mol-1·cm-1);m-樣品質(zhì)量(g);L-光程,數(shù)值為1 cm。

1.4 紫槐花色素紅外光譜特征

色素紅外光譜特征分析采用溴化鉀壓片法。先稱取150 mg溴化鉀,將其放入瑪瑙缽中研成細(xì)粉末。再稱取1.5 mg紫槐色素純品粉末加入其中研磨,使二者充分混勻磨細(xì),從而進(jìn)行壓片。在400～3600 cm-1范圍內(nèi)測其紅外吸收光譜,并進(jìn)行分析[24]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

為了保證實(shí)驗(yàn)精確度,每個(gè)水平進(jìn)行三組平行實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值。采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖,采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Benhnken中心組合響應(yīng)面設(shè)計(jì)及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫槐花色素提取液最大波長確定

根據(jù)圖1可得知,紫槐花色素液在220～760 nm波長范圍掃描時(shí),有三個(gè)峰,分別為280、340、538 nm,其中280、538 nm峰符合花青素特征波長[24];所以可以用pH示差法對其含量進(jìn)行測定。

圖1 紫槐花色素最大波長的確定Fig.1 Determination of the maximum wavelength of pigment

2.2 紫槐花色素最佳溶劑的確定

根據(jù)圖2可知,0.1%檸檬酸提取紫槐花效果最好,其次是0.1%鹽酸、95%酸乙醇、0.1%硫酸,乙醚很少溶出、石油醚基本不溶,從圖中可知用檸檬酸提取效果更好,所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用檸檬酸溶液做提取溶劑。

圖2 紫槐花色素最佳溶劑的確定Fig.2 Determination of the best solvent of pigment

2.3 提取溶劑最佳pH確定

根據(jù)圖3可得:檸檬酸溶劑pH對于紫槐花色素量的影響:pH<2之前呈上升狀態(tài),pH=2時(shí)色素提取量達(dá)最大值。pH>2后色素提取量急劇下降,最后趨于平穩(wěn)。由此紫槐花色素提取時(shí),提取溶劑pH=2最佳。

圖3 紫槐花提取色素溶劑最佳pH的確定Fig.3 Determination of the best pH vaule of extraction solvent

2.4 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 提取溫度對提取液中色素含量的影響 由圖4可知:溫度低于60 ℃時(shí),色素含量隨溫度的升高而上升,因?yàn)闇囟壬?物質(zhì)分子溶解和擴(kuò)散的速度都會(huì)加快;溫度高于60 ℃,色素含量就會(huì)下降。這可能是溫度過高使色素降解所致[24]。

圖4 提取溫度對紫槐色素提取的影響Fig.4 Effect of temperature on pigment extraction

2.4.2 提取時(shí)間對提取液中色素含量的影響 由圖5可知,隨著提取時(shí)間的延長,色素含量上升,當(dāng)提取時(shí)間為20 min時(shí),色素含量最高,繼續(xù)延長提取時(shí)間,色素含量下降明顯;原因可能是色素在該溫度下時(shí)間過長,導(dǎo)致色素結(jié)構(gòu)變化,失去原來的理化性質(zhì),從而使色素含量下降[24]。

圖5 提取時(shí)間對紫槐色素提取的影響Fig.5 Effect of time on pigment extraction

2.4.3 液料比對提取液中色素含量的影響 由圖6可知,色素含量會(huì)隨提取液用量增大而上升,當(dāng)液料比達(dá)到50∶1 g/mL時(shí),色素提取量最高。隨后,提取溶劑用量增加,色素提取量下降,但下降幅度不大,曲線趨于平穩(wěn),原因可能是隨著液料比的增加,紫槐花與提取溶劑的接觸面增加,色素類物質(zhì)向溶劑溶出的阻力減小,使得提取液中溶解的色素含量增加;當(dāng)液料比達(dá)到一定值時(shí),色素中的有效成分基本溶出,傳質(zhì)推動(dòng)力減小,提取量有所降低[25]。

圖6 液料比對紫槐色素提取的影響Fig.6 Effect of liquid to materialratio on pigment extraction

2.4.4 超聲功率對提取液中色素含量的影響 由圖7可知,功率在200～300 W內(nèi),色素含量隨功率提高逐漸增大。這是因?yàn)槌暡ㄔ诿劫|(zhì)中傳播時(shí)可產(chǎn)生空化現(xiàn)象,空化中產(chǎn)生的極大壓力造成被破碎物在瞬間破碎,同時(shí),超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了被破碎物的擴(kuò)散及溶解。功率加大,空化及機(jī)械作用以增大物分子運(yùn)動(dòng)頻率和速率,從而增加溶劑穿透力,提高紫槐花色素的溶出[19]。功率大于300 W,色素含量降低。可能原因是:超聲波頻率過大,作用過程中媒質(zhì)升溫過高,導(dǎo)致色素發(fā)生降解[22]。由此可得,超聲波提取紫槐花色素溫度最佳功率為300 W。

圖7 超聲功率對紫槐色素提取的影響Fig.7 Effect of ultrasonic wavepower on pigment extraction

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-behnken組合原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of tests

2.5.1 模型建立與顯著性分析 利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到的紫槐花色素提取量(Y,mg/100 g)對自變量料液比,超聲時(shí)間,超聲功率的二次多項(xiàng)回歸方程如下:

Y=118.25-0.47A+3.84B-14.07C+1.95AB+2.30AC-0.43BC-18.88A2-25.5B2-22.78C2

各因素方差分析如表3所示。由表可知:模型P<0.0001,表明該程模型達(dá)到極顯著水平,失擬項(xiàng)P=0.0739>0.05,表明該回歸模型與實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合度高。所以,此回歸模型成立。可以分析和預(yù)測提取紫槐花色素含量的結(jié)果。超聲功率P<0.01,表明超聲功率對提取液中色素含量影響極顯著,而液料比、提取時(shí)間P>0.05,說明這兩因素對提取液中色素含量影響不顯著。各因素對紫槐色素提取影響大小依次為:超聲波功率(C)>超聲波時(shí)間(B)>液料比(A)。二次項(xiàng)A2、B2、C2影響極顯著。交互項(xiàng)影響不顯著。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment

2.5.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 由圖8可得,當(dāng)料液比固定時(shí),紫槐花提取液中色素含量會(huì)隨超聲波時(shí)間的延長而不斷升高,直到20 min后色素含量開始下降;當(dāng)超聲波時(shí)間固定時(shí),在液料比<50∶1 mL/g時(shí)色素含量不斷增大,料液比>50∶1 mL/g后色素含量降低。

圖8 液料比與提取時(shí)間對紫槐花色素含量的影響Fig.8 The effect of ratio of liquid to material and extraction time on the pigment yield

通過響應(yīng)面及等高線圖可以直觀的看到3個(gè)變量(液料比、提取時(shí)間、提取功率)對色素含量的影響及3個(gè)變量之間的交互作用。3個(gè)變量之間的交互作用均不顯著。通過圖8～圖10等高線圖確定液料比的最佳水平范圍為45～55 mL/g,提取時(shí)間最佳水平范圍為19～21 min提取功率最佳水平范圍為275～300 W。對回歸方程求解,得到當(dāng)液料比49.72∶1 mL/g,提取時(shí)間為20.38 min,超聲功率為284.44 W時(shí),紫槐花提取液中色素含量預(yù)測值為120.594 mg/100 g。

圖9 液料比與提取功率對紫槐花色素含量的影響Fig.9 The effect of ratio of liquid to material and ultrasonic wave power on the pigment yield

圖10 提取時(shí)間與超聲功率對紫槐花色素含量的影響Fig.10 The effect of extraction time and ultrasonic wave power on the pigment yield

2.5.3 最佳工藝平行驗(yàn)證試驗(yàn) 利用Design-expert軟件Box-Behnken設(shè)計(jì)原理對紫槐花色素提取條件進(jìn)行正交設(shè)計(jì),響應(yīng)面法預(yù)測最佳紫槐花色素提取方案為:采用溶劑為pH=2的檸檬酸溶液,提取溫度為60 ℃,理論液料比49.72∶1 mL/g,理論提取時(shí)間為20.38 min,理論超聲功率為284.44 W。在以上條件下,紫槐花提取液中色素含量預(yù)測值為120.594 mg/100 g。采取以上理論預(yù)測的紫槐花色素提取最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,考慮到實(shí)際情況,將紫槐花色素提取最優(yōu)條件改為液料比50∶1 mL/g,提取功率為300 W,提取時(shí)間為20 min。以上相同條件下進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn),測出紫槐花提取液中色素含量值,取三組平均值,為118.77 mg/100 g。結(jié)果表明:實(shí)際值與響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)的預(yù)測值相差很小,此響應(yīng)面法優(yōu)化紫槐花色素提取工藝條件是可行的。

2.6 提取次數(shù)對色素得率影響結(jié)果分析

根據(jù)圖11可知:隨著提取次數(shù)的增加色素提取越來越完全。經(jīng)測定得出:兩次提取后,濾渣中剩余的色素含量已經(jīng)較低。三次提取后,濾渣之中的色素含量已經(jīng)非常少,濾渣顏色呈透明色;四次提取后,提取液中色素含量接近為0。綜上所述選取提取次數(shù)為三次最為合理。

圖11 提取次數(shù)對紫槐色素提取的影響Fig.11 Effect of extraction times on pigment

2.7 紫槐花色素紅外光譜特征分析

如圖12所示,紫槐色素紅外光譜主要波數(shù)有1143、1705、1756、3289、3496 cm-1。其中,1143 cm-1為C-O-C伸縮吸收峰,這可能是花青素結(jié)構(gòu)中吡喃環(huán)的結(jié)構(gòu)。1705、1756 cm-1為雜環(huán)中羰基C=O的振動(dòng)吸收峰,是判斷羰基C=O(酮類、酸類、酯類、酸酐等)伸縮的特征頻率。3248、3496 cm-1為羥基O-H伸縮振動(dòng)吸收峰,說明結(jié)構(gòu)有醇類、酚類或者有機(jī)酸。紫槐色素主要吸收有羰基、含氧雜環(huán)、羥基等結(jié)構(gòu),因此,推測屬于花青素類物質(zhì)[24]。

圖12 紅外光譜圖Fig.12 Infrared spectra of pigment

3 結(jié)論

響應(yīng)面試驗(yàn)確定提取紫槐花色素的最佳工藝條件:最佳提取劑為pH=2檸檬酸水溶液,液料比為50∶1 mL/g,提取溫度60 ℃,提取時(shí)間20 min,超聲功率300 W,在此條件下,提取液中色素含量為118.77 mg/100 g。影響色素提取因素的大小依次為:超聲功率>超聲時(shí)間>液料比。提取三次基本上可以將紫槐花中色素提取完全。經(jīng)紫外可見光掃描最大吸收波長及紅外光譜分析,推測紫槐色素主要成分為花青素類物質(zhì)。但掃描結(jié)果顯示提取物中存在黃酮類成分。深入研究紫槐花色素穩(wěn)定性時(shí)需要將其中黃酮類成分去除。本研究測定色素含量時(shí)是以常見的矢車菊-3-葡萄糖苷計(jì)的,下一步研究應(yīng)對紫槐花中花青素種類及糖苷中糖的種類進(jìn)行深入分析,為今后更好利用紫槐花資源提供理論依據(jù)。