李 莎,曾習(xí)文,李亦蔚,易守福,董 艷

(1.長沙縣食品安全檢測中心,湖南長沙 410100; 2.湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院,湖南長沙 410017)

枸杞(Lyciumbarbarum)為茄科類灌木,是我國傳統(tǒng)的藥食同源植物。枸杞主要含有胡蘿卜素、核黃素、酸漿果紅素、抗壞血酸、煙酸、甜菜堿及微量元素等化學(xué)成分,具有補(bǔ)腎養(yǎng)肝、潤肺明目、降血糖、降血脂等多種功效[1-2],其豐富的營養(yǎng)價值和保健功效倍受人們的青睞。由于枸杞含糖量高,易發(fā)生木虱、實蠅、癭螨、蚜蟲等蟲害,且防治難度大[3-4]。目前大部分市售枸杞來源于人工栽培,規(guī)模化種植使得大面積病蟲害的發(fā)生較為頻繁和嚴(yán)重。為了提高產(chǎn)量,大量使用多種農(nóng)藥進(jìn)行防治,造成枸杞農(nóng)藥殘留嚴(yán)重,影響枸杞質(zhì)量安全[5-6]。近年來,隨著國際貿(mào)易競爭的不斷加劇以及各國對食品安全要求的提高,歐盟、美國、日本等國家都對枸杞產(chǎn)品制定了嚴(yán)格的農(nóng)藥殘留限量,然而我國出口枸杞中農(nóng)藥殘留超標(biāo)被官方通報的情況時有發(fā)生。農(nóng)藥殘留問題已經(jīng)成為我國枸杞出口所遭遇的主要技術(shù)性貿(mào)易壁壘。因此,建立枸杞中快速、準(zhǔn)確、高效的多農(nóng)藥殘留檢測方法對于控制枸杞農(nóng)藥殘留污染、促進(jìn)枸杞產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展至關(guān)重要。

目前對于枸杞中農(nóng)藥殘留量的主要檢測方法有氣相色譜法(GC)[7-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10-12]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[13-15]及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[16-17]。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法兼具氣相色譜高分離效能和質(zhì)譜準(zhǔn)確鑒定化合物結(jié)構(gòu)的特點,可達(dá)到同時定性定量的檢測目的。但單級質(zhì)譜靈敏度和選擇性不理想,易受基質(zhì)成分干擾,GC-MS/MS相對于傳統(tǒng)的GC-MS而言,在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域具有高效、穩(wěn)定、基質(zhì)干擾小等突出優(yōu)點。目前,將GC-MS/MS檢測技術(shù)用于枸杞中農(nóng)藥殘留檢測的研究報道較少,方翠芬等[18]采用乙酸乙酯提取濃縮枸杞樣品,建立了測定枸杞中23種農(nóng)藥殘留量的GC-MS/MS方法。由于枸杞中含有大量色素及多糖類物質(zhì),基質(zhì)復(fù)雜,在質(zhì)譜分析中可能帶來嚴(yán)重的基體效應(yīng)和干擾,在進(jìn)行儀器分析前,需采取適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ㄈコ|(zhì)中的干擾物?，F(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報道方法[14,19]多采用固相萃取法(SPE)進(jìn)行凈化,SPE柱凈化效果雖好,但價格較昂貴,且操作繁瑣。QuEChERS方法具有操作簡便、快速、凈化效率高、消耗有機(jī)溶劑少、成本低等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中多農(nóng)藥殘留的檢測[20]。

本研究將GC-MS/MS檢測系統(tǒng)與QuEChERS前處理方法結(jié)合,用于枸杞中多種農(nóng)藥殘留快速提取檢測。樣品經(jīng)乙腈提取,提取液通過QuEChERS法凈化排除復(fù)雜基體的測定干擾,利用GC-MS/MS在MRM模式下直接測定,建立了同時測定枸杞中46種農(nóng)藥殘留的方法。該方法高效、快速、靈敏、準(zhǔn)確,能滿足枸杞中農(nóng)藥殘留的檢測要求,可為枸杞的質(zhì)量控制提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞樣品 購自超市和藥店;46種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(46種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品名稱見表1,1000 μg/mL) 北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司;乙腈、正己烷、丙酮 色譜純,德國默克公司;無水硫酸鎂、氯化鈉 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;凈化管1號(含150 mg MgSO4填料) 自制;凈化管2號(含150 mg MgSO4,50 mg N-丙基乙二胺(N-propyl ethylenediamine,PSA)填料)、凈化管3號(含150 mg MgSO4,50 mg PSA,50 mg C18填料)、凈化管4號(含150 mg MgSO4,50 mg PSA,50 mg C18,7.5 mg石墨化碳黑(Graphitized carbon black,GCB)填料) 安捷倫科技有限公司。

Agilent 7890B-7000C氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜儀 美國Agilent公司;TD5K臺式離心機(jī) 長沙東旺實驗儀器有限公司;XY-100高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市松青五金廠;MS3 digital旋渦混勻器 IKA儀器設(shè)備有限公司;KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;AL204電子天平 梅特勒托利多有限公司;HN132樣品濃縮儀 濟(jì)南海能儀器有限公司;SMART-NE超純水儀 上?？道追治鰞x器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 提取:稱取經(jīng)粉碎均勻枸杞試樣5.00 g(精確至0.01 g)于50 mL離心管中,加10 mL超純水渦旋混勻,靜置30 min。精密加入10 mL乙腈,劇烈振蕩渦旋2 min,加入2 g NaCl后劇烈振蕩渦旋2 min,再以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min,上清液待凈化。

凈化:準(zhǔn)確移取上清液2 mL,置于預(yù)先裝有加入150 mg MgSO4,50 mg PSA的凈化管中,劇烈振蕩渦旋2 min,再以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心3 min,精密移取清液1 mL,氮吹干后用丙酮溶劑定容至0.5 mL,過0.22 μm有機(jī)濾膜,供GC-MS/MS分析檢測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 混合標(biāo)準(zhǔn)中間液:分別吸取0.10 mL 1000 μg/mL各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液置于10 mL容量瓶中,用丙酮定容,得到10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于-18 ℃下避光、密封保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:精確吸取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,逐級用丙酮釋成質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:取6份1 mL按1.2.1制備的空白基質(zhì)溶液氮氣吹干,分別加入1 mL上述相應(yīng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液復(fù)溶,配制成系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。以46種農(nóng)藥的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)使用液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),各物質(zhì)的定量離子對峰面積為縱坐標(biāo),繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美國Agilent公司);載氣:高純氦氣(99.999%);碰撞氣:高純氮氣(99.999%);恒流模式流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣,進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣口溫度:280 ℃;柱溫:初始溫度40 ℃保持1 min,以40 ℃/min升溫至120 ℃,再以5 ℃/min升溫至240 ℃,最后以12 ℃/min升溫至300 ℃,保持6 min。

1.2.4 質(zhì)譜條件 電離方式:電子轟擊離子源(EI);電離能量:70 eV;離子源溫度:280 ℃;四級桿溫度:150 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;掃描模式:多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM),46種農(nóng)藥殘留的保留時間、定量離子對、定性離子對、碰撞能量條件見表1。

表1 46種農(nóng)藥化合物的保留時間及質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Retention time and mass spectrometric parameters of 46 pesticide compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Agilent MassHunter軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

分別對46種農(nóng)藥化合物進(jìn)行全掃描,選擇2～3個特征且豐度高的離子作為母離子。再分別對每個母離子進(jìn)行子離子掃描,設(shè)定碰撞電壓在5～35 eV之間,每隔5 eV進(jìn)行1次碰撞優(yōu)化碰撞能量,擇優(yōu)選取強(qiáng)度和信噪比兼顧的離子對分別作為定量和定性離子對。本文選用Agilent HP-5MS柱,在分離過程中采用程序升溫可有效地改善峰形,通過分段離子掃描可有效提高儀器檢測靈敏度。經(jīng)過優(yōu)化,46種農(nóng)藥殘留組分多反應(yīng)監(jiān)測模式條件及保留時間如表1所示。

氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測100 ng/mL氧樂果等46種農(nóng)藥化合物基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,所得總離子流圖如圖1所示。

圖1 46種農(nóng)藥混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流圖Fig.1 TIC of 46 pesticide mixed matrix standard solutions 注:峰形上方的編號與表1中各組分編號代表的農(nóng)藥名稱一一對應(yīng)。

2.2 樣品前處理方法的考察

2.2.1 提取溶劑的選擇 以加入100 μg/kg農(nóng)藥混標(biāo)的枸杞樣品為研究對象,考察了丙酮、乙腈、正己烷三種不同溶劑對各農(nóng)藥組分的提取效果。結(jié)果表明46種農(nóng)藥組分在丙酮、乙腈、正己烷三種溶劑中的平均回收率分別為86.62%、89.75%和67.53%。正己烷極性相對較弱,不利于提取極性較大的農(nóng)藥組分;使用丙酮提取液中色素等雜質(zhì)較多,容易造成儀器污染并影響檢測結(jié)果;乙腈提取效果最好,農(nóng)藥回收率高,由于乙腈適宜于萃取極性范圍較寬的多種農(nóng)藥,且不易提取色素和脂肪等非極性成分[21],使凈化更簡便且提取效果最好,所以本實驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化劑的選擇 本實驗以2 mL離心后的100 μg/kg加標(biāo)樣品提取液為研究對象,對MgSO4、PSA、GCB、C18的種類和用量進(jìn)行優(yōu)化。對比4種凈化管(填料配比詳見1.1)的凈化效果,結(jié)果表明,隨著填料種類的增加,凈化液越來越澄清(圖2),說明凈化效果越好,表明PSA、C18和GCB在枸杞前處理過程中都發(fā)揮了相應(yīng)的除雜效果。同時,對4組填料下46種農(nóng)藥的回收率進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)含150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA的凈化劑(2號凈化管)不僅可以將枸杞樣品中的雜質(zhì)凈化,且對目標(biāo)農(nóng)藥的吸附少,各農(nóng)藥組分的平均回收率最高,均在80%～100%范圍內(nèi)。這是因為枸杞中主要含多糖類、胡蘿卜素、纖維素等營養(yǎng)成分,PSA可將其有效吸附;C18和GCB的加入雖對色素去除更徹底,但也對極性較弱和平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥有較強(qiáng)的吸附作用,使目標(biāo)組分的回收率降低[20,22]。因此,本方法優(yōu)先采用2號凈化管(含150 mg MgSO4,50 mg填料)對枸杞提取樣液進(jìn)行凈化處理。

圖2 4組混合填料的凈化效果Fig.2 Purification effects of thefour groups of mixed adsorbents

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是樣品中其他組分對待測物離子化的影響,導(dǎo)致在進(jìn)行儀器分析時待測組分的響應(yīng)出現(xiàn)增強(qiáng)或抑制。基質(zhì)效應(yīng)用ME表示,ME(%)=(B-A)/A×100(A和B分別為溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程斜率),︱ME︱<10%提示基質(zhì)效應(yīng)較小,可用溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量;10%<|ME|<50%提示基質(zhì)效應(yīng)較大,需要用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量以消除基質(zhì)效應(yīng)對結(jié)果的影響;︱ME︱>50%提示基質(zhì)效應(yīng)很強(qiáng),嚴(yán)重影響定量,需要重新優(yōu)化樣品前處理方法[23]。

本研究分別采用空白基質(zhì)提取液和丙酮溶劑配制成0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,在相同條件下進(jìn)行檢測,最后分別建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過上述公式計算ME值,判斷基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各農(nóng)藥組分的ME值均在10%～50%之間(見表2),表明存在明顯的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng),在本研究中使用基質(zhì)匹配外標(biāo)法對46種農(nóng)藥的殘留量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

2.4 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢出限

將46種農(nóng)藥配制成6個不同質(zhì)量濃度的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別為0.01、0 02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL。如表2所示,各組分在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,線性相關(guān)系數(shù)r在0.9941～0.9999之間。以信噪比S/N=3和S/N=10所對應(yīng)的濃度,分別計算各農(nóng)藥組分的檢出限和定量限,方法檢出限為0.02～3.90 μg/kg,定量限為0.05～12.99 μg/kg(見表2)。

2.5 方法的回收率和精密度

在空白枸杞樣品中添加濃度分別為10、50、100 μg/kg的46種農(nóng)藥標(biāo)液,渦旋2 min,靜置2 h,按上述所選擇的最優(yōu)條件進(jìn)行測定,每個添加水平做6次平行實驗,計算平均加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。測得平均回收率為71.5%～99.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～8.9%,實驗結(jié)果見表2。枸杞樣品檢測結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度均達(dá)到GB/T 27404-2008中農(nóng)藥殘留檢測的要求。

表2 枸杞中46種農(nóng)藥的線性方程、相關(guān)系數(shù)、基質(zhì)效應(yīng)、檢出限、定量限、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients,matrixeffects(MEs),limit of detection(LOD),limit ofquantification(LOQ),recoveries and standard deviations of 46 pesticide residues in Lycium barbarum(n=6)

2.6 實際樣品測定

采用本方法對10批次枸杞樣品中46種農(nóng)藥殘留量進(jìn)行測定,結(jié)果4批樣品檢出農(nóng)藥殘留,其余樣品均未檢出。其中有2批樣品檢出克百威,且含量超出GB 2763-2016規(guī)定的限量值20 μg/kg,含量分別為66.7和40.2 μg/kg;另有2批樣品檢出毒死蜱分別為39.2、26.3 μg/kg,1批樣品檢出腐霉利19.4 μg/kg,2批樣品檢出氯氟氰菊酯分別為135、130 μg/kg,1批樣品檢出氟氯氰菊酯262 μg/kg,含量均未超過國家限量值,測定結(jié)果見表3,部分陽性樣品的色譜圖見圖3。

表3 4批枸杞農(nóng)藥殘留測定結(jié)果(μg/kg)Table 3 Determination results of pesticide residuesin the 4 batches of Lycium barbarum(μg/kg)

圖3 枸杞樣品-3的MRM譜圖Fig.3 MRM chromatogram of Lycium barbarum-3 sample

3 結(jié)論

本文首次將QuEChERS前處理方法結(jié)合GC-MS/MS檢測技術(shù)用于枸杞中多種農(nóng)藥殘留的快速分析檢測。用此方法檢測枸杞中46種農(nóng)藥殘留時,在0.01～0.20 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢出限和定量限分別為0.02～3.90和0.05～12.99 μg/kg;3個不同濃度添加水平的平均回收率為71.5%～99.8%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%～8.9%,均能滿足檢測要求。10批次枸杞樣品中4批次檢出農(nóng)藥殘留,部分枸杞中存在農(nóng)藥殘留超標(biāo)的情況,提示枸杞生產(chǎn)過程中存在不規(guī)范使用農(nóng)藥的情形,因此,對枸杞農(nóng)藥殘留進(jìn)行有效監(jiān)控非常必要。該方法簡單、快速、選擇性好、靈敏度高,能夠滿足枸杞中多種農(nóng)藥殘留的定性及定量檢測,可為枸杞的質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。