張明菲,范瑤婕,楊 培,王 祥,周玲玲

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210023)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)在臨床實(shí)踐中是一種寶貴的中草藥[1],微苦、藥性溫和,具有止血、消除疲勞、消腫止痛等功效。隨著醫(yī)學(xué)模式從治療醫(yī)學(xué)向預(yù)防醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)變,三七越來(lái)越多的生物活性功效被人們所知曉,因此頻繁地被應(yīng)用于保健食品領(lǐng)域[2]。1994年美國(guó)膳食補(bǔ)充劑健康與教育法將三七列為膳食補(bǔ)充劑[3]。在中國(guó),三七被列入到衛(wèi)生部“可用于保健食品的物品名單”中,從2002年起開(kāi)始應(yīng)用于保健食品[4]。

目前,國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局公布的保健食品中含有三七的產(chǎn)品有60多種,涉及多種保健功能,現(xiàn)代研究表明,三七在血液系統(tǒng),心血管系統(tǒng),神經(jīng)系統(tǒng),免疫系統(tǒng)等多方面具有生物活性[5-7]。現(xiàn)代藥理研究表明,自身免疫病、糖尿病等多種疾病均與免疫因素相關(guān)。CD4+輔助性T細(xì)胞(T helper,Th)是機(jī)體適應(yīng)性免疫細(xì)胞,其可分化成Th1、Th2、Treg、Th17等不同的亞群,調(diào)控細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答過(guò)程[8]。其中Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、IL-12、IL-18和其他細(xì)胞因子[8-9],可以有效地刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH),與多種原因所致的炎癥反應(yīng)密切相關(guān),被稱(chēng)為炎癥性T細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn),三七的主要活性組分三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins,PNS)可以抑制類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ[10-12],因此三七對(duì)Th1細(xì)胞分化和活性的影響值得進(jìn)一步研究。

本研究體外培養(yǎng)小鼠CD4+T細(xì)胞,將三七制備成三七凍干粉(Sanqi,SQ)用于細(xì)胞給藥,同時(shí)采用三七中主要活性組分PNS,觀察兩者對(duì)Th1分泌的IFN-γ表達(dá)水平及Th1特征性因子T-bet表達(dá)的影響,明確其對(duì)Th1細(xì)胞分化和活性的影響。為進(jìn)一步明確三七調(diào)節(jié)免疫的作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù),指導(dǎo)其作為藥品和保健食品的科學(xué)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小鼠 C57BL/6雄性小鼠15只,SPF級(jí),6～8周齡,來(lái)自南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng),動(dòng)物合格證:SYXK(蘇)2017-0001;三七生藥 安徽亳州中藥飲片廠,經(jīng)鑒定都符合2015版《中國(guó)藥典》一部中的相關(guān)規(guī)定;三七總皂苷(PNS) 南京景竹生物科技有限公司(貨號(hào):JZ15101407,純度85%);刀豆蛋白A(ConA) Sigma公司;紅細(xì)胞裂解液 碧云天(批號(hào)20190215);Trizol 美國(guó)Life Technologies公司(批號(hào)79403);CD4+T細(xì)胞分選磁珠 美國(guó)BD公司(批號(hào)8129931);IFN-γELISA試劑盒 聯(lián)科生物(批號(hào)A280H90242)。

超微量紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) Thermo ScientificTMNanoDropTMOne;倒置顯微鏡 日本尼康公司;7500型熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司;5417R型低溫離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;SyneRgy 2型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司;提取機(jī)組 山東青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司;真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三七凍干粉的制備 取三七生藥1000.00 g,加入10 L水浸泡4 h。將三七浸泡液加入提取機(jī)組(80 ℃,負(fù)壓)提取,計(jì)量冷凝水體積,直至只剩1 L水液,取出。將水提液倒入冷凍盤(pán),放入-80 ℃冰箱冷凍過(guò)夜。將冷凍盤(pán)放入真空冷凍干燥機(jī),干燥48 h直至呈粉末狀。收集凍干粉133.56 g(產(chǎn)率為13.36%),密封保存,放入干燥劑,置于干燥處備用。

1.2.2 細(xì)胞分組及給藥 脫頸處死C57BL/6小鼠,浸泡于含有75%乙醇的燒杯中15 min,在無(wú)菌條件下,取出脾臟,研磨并使用紅細(xì)胞裂解液獲得白細(xì)胞,磁珠分選出CD4+T細(xì)胞。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CD4+T細(xì)胞,每孔加入1×105個(gè)細(xì)胞,設(shè)置空白對(duì)照組(RPMI-1640完全培養(yǎng)基和細(xì)胞)以及不同濃度的給藥組:三七凍干粉組(80、160、320、640 μg/mL)和三七總皂苷組(5、10、20、40 μg/mL)。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將不同濃度的SQ和PNS分別作用于細(xì)胞,并設(shè)置空白組(僅RPMI-1640完全培養(yǎng)基)和對(duì)照組(RPMI-1640完全培養(yǎng)基和細(xì)胞)以及分別設(shè)置5組平行對(duì)照(n=5),培養(yǎng)48 h后每孔加入20 μL增強(qiáng)型CCK-8溶液,繼續(xù)于37 ℃孵育1 h,用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度(A),并計(jì)算細(xì)胞活力,篩選出合適的給藥濃度。

1.2.4 上清中IFN-γ檢測(cè) 按“1.2.2”項(xiàng)下分組給藥將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,分離出上清液,使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定上清液中IFN-γ的水平,嚴(yán)格按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,并分別于450和570 nm處測(cè)OD值,計(jì)算出對(duì)應(yīng)的IFN-γ濃度。

1.2.5 q-PCR檢測(cè)IFN-γmRNA、T-bet mRNA表達(dá)水平 按“1.2.2”項(xiàng)下分組給藥將細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,使用Trizol法提取細(xì)胞RNA,嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)應(yīng)用q-PCR法檢測(cè)IFN-γ和T-bet mRNA的相對(duì)表達(dá)量,結(jié)果用2-ΔΔCt表示。以GAPDH為內(nèi)參。引物根據(jù)Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì),再由生工生物工程(上海)有限公司合成,引物序列如下表1。

表1 q-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR detection

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 8.0 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖,采用方差分析比較差異,若P<0.05,則表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七凍干粉和PNS對(duì)CD4+T細(xì)胞活力的影響

CCK8法是一種基于WST-8而廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖的快速、高靈敏度檢測(cè)的方法[13-15]。本研究選用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性,篩選出最佳給藥濃度。結(jié)果如圖1所示,不同濃度的SQ和PNS對(duì)CD4+T細(xì)胞作用48 h后,與對(duì)照組比較,發(fā)現(xiàn)SQ的質(zhì)量濃度為160、320、640 μg/mL時(shí),其對(duì)CD4+T細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(圖1A),CD4+T細(xì)胞分為多種亞群[8],本研究主要觀察藥物對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞方向分化的影響,因此采用CCK8方法篩選出對(duì)CD4+T細(xì)胞活力無(wú)明顯影響的濃度進(jìn)行后續(xù)的研究。而當(dāng)SQ濃度為80 μg/mL時(shí),其對(duì)CD4+T細(xì)胞有顯著抑制作用,故而不選擇該濃度而選擇160、320、640 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度。當(dāng)PNS的質(zhì)量濃度為5、10、20、40 μg/mL對(duì)CD4+T細(xì)胞活力均無(wú)明顯影響,結(jié)合PNS在三七中的比例,因此在本實(shí)驗(yàn)中選擇5、10、20 μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度(圖1B)。

圖1 SQ和PNS對(duì)CD4+T細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of SQ and PNS on viability of CD4+T cell注:與對(duì)照組比較:*P<0.05。

2.2 SQ和PNS對(duì)細(xì)胞上清中IFN-γ水平的影響

Th1細(xì)胞能夠分泌大量的細(xì)胞因子IFN-γ[16],通過(guò)IFN-γ的含量可以反應(yīng)Th1細(xì)胞的分泌活性。結(jié)果如圖2所示,與對(duì)照組比較,SQ和PNS都能顯著降低IFN-γ表達(dá)的水平(P<0.05)。IFN-γ主要由Th1細(xì)胞分泌,大量的研究均使用細(xì)胞上清中IFN-γ水平變化來(lái)表明Th1細(xì)胞分化的變化[17-18],提示SQ和PNS均能顯著抑制Th1細(xì)胞分泌IFN-γ的功能從而調(diào)節(jié)免疫平衡。

圖2 SQ和PNS對(duì)IFN-γ水平的影響Fig.2 Effect of SQ and PNS on expression of IFN-γ注:與對(duì)照組比較:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

2.3 SQ和PNS對(duì)IFN-γ mRNA、T-bet mRNA表達(dá)水平的影響

T-bet是Th1細(xì)胞的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[19],故通過(guò)測(cè)定T-bet的表達(dá)可反映分化為T(mén)h1細(xì)胞亞群的比例。結(jié)果如圖3所示,與對(duì)照組比較,SQ和PNS均能夠顯著降低與Th1細(xì)胞相關(guān)的T-bet mRNA表達(dá)水平。T-bet是驅(qū)動(dòng)Th1細(xì)胞分化的主轉(zhuǎn)錄因子[20],本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示T-bet表達(dá)水平的下降提示SQ和PNS可明顯抑制CD4+T細(xì)胞向Th1分化的比例。

Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ的mRNA水平變化反映Th1細(xì)胞活性的變化[21],結(jié)果如圖3所示,SQ和PNS可明顯抑制IFN-γ的mRNA水平,Th1細(xì)胞中IFN-γmRNA經(jīng)翻譯過(guò)程可形成IFN-γ并分泌到胞外,提示二者均可抑制Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的活性。

圖3 SQ和PNS對(duì)T-bet和IFN-γ mRNA表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SQ and PNS on expression ofIFN-γ mRNA and T-bet mRNA注:與對(duì)照組比較:*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001。

3 討論與結(jié)論

Th1細(xì)胞是一種效應(yīng)T細(xì)胞,具有免疫調(diào)節(jié)作用,Th1細(xì)胞與其他Th細(xì)胞亞型處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),該狀態(tài)一旦失衡可引起免疫調(diào)節(jié)紊亂,Th1細(xì)胞異?；罨梢鸶腥?自身免疫性疾病等[22-23]。類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是目前常見(jiàn)的自身免疫性疾病,大量研究表明Th1細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子過(guò)量是重要的致病因素[24-26]。本實(shí)驗(yàn)使用CCK8法篩選出不影響CD4+T細(xì)胞活性的最佳藥物濃度,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中探討SQ和PNS對(duì)CD4+T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的影響。T-bet是Th1細(xì)胞特征性轉(zhuǎn)錄因子,IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子,因此二者可以分別反映CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1亞群的比例和Th1細(xì)胞的分泌活性。本研究結(jié)果顯示:不同濃度的SQ及其活性組分PNS可抑制IFN-γ水平和IFN-γmRNA與T-bet mRNA,提示二者均可抑制Th1細(xì)胞的分化和活性。隨著SQ濃度升高,Th1細(xì)胞分泌IFN-γ的活性以及該細(xì)胞中IFN-γmRNA的表達(dá)水平均被顯著抑制,但二者呈現(xiàn)出相反的趨勢(shì),前者抑制作用表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性減弱,而后者表現(xiàn)為劑量依賴(lài)性增強(qiáng),這可能是翻譯和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中某一環(huán)節(jié)受到影響,其潛在的機(jī)制有待探討。Wei等[11]發(fā)現(xiàn)經(jīng)PNS處理后,細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)水平顯著下降。本研究結(jié)果與其一致,但本實(shí)驗(yàn)是根據(jù)PNS在三七中的含量設(shè)置的濃度,相比較Wei等[11]的研究濃度范圍更窄。隨著PNS的濃度升高,Th1細(xì)胞分泌IFN-γ的活性以及該細(xì)胞中IFN-γmRNA的表達(dá)水平均呈劑量依賴(lài)性的被抑制,且二者趨勢(shì)一致。Th1細(xì)胞為促炎細(xì)胞,其主要分泌IFN-γ,本研究恰好說(shuō)明了三七能夠抑制Th1細(xì)胞分泌IFN-γ的活性來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫的作用,提示其在RA中抑制異?；罨腡h1細(xì)胞,有助于機(jī)體恢復(fù)免疫平衡。

目前已經(jīng)有大量文獻(xiàn)證明轉(zhuǎn)錄因子是某些細(xì)胞發(fā)育和功能作用的關(guān)鍵因子。T-bet被認(rèn)為是Th1細(xì)胞分化的主轉(zhuǎn)錄因子,因此也被認(rèn)為是Th1細(xì)胞的標(biāo)記物。它是由Szabo等[27]于2000年最初發(fā)現(xiàn)其可以推動(dòng)Th0前體細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化發(fā)育,并可顯著地提高細(xì)胞IFN-γ的表達(dá)水平。T-bet的表達(dá)依賴(lài)于STAT1信號(hào)(signal transducer and activator of transcription,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子),并可由正反饋周期介導(dǎo)(取決于其下游主要靶分子IFN-γ的直接作用),迅速增強(qiáng)其表達(dá)[28]。除了IFN-γ之外,其他蛋白質(zhì)也在Th1細(xì)胞的免疫生物學(xué)中具有重要作用,包括STAT1,IL-12Rβ2,CC-趨化因子配體3(CCL3)和CXC-趨化因子受體3(CXCR3),而T-bet可以與編碼這些蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合干預(yù)轉(zhuǎn)錄過(guò)程[29]。因此,T-bet在Th1細(xì)胞的發(fā)育分化過(guò)程中起著重要的作用。本研究結(jié)果表明SQ和PNS均能顯著的抑制T-bet mRNA的水平,并且該抑制效果呈劑量依賴(lài)性,因此三七能夠有效抑制Th1細(xì)胞分化過(guò)程中重要的轉(zhuǎn)錄因子,從而抑制CD4+T細(xì)胞向Th1方向的分化,該作用可能與三七調(diào)節(jié)免疫平衡有關(guān)。

綜上所述,為了進(jìn)一步明確三七調(diào)節(jié)免疫的機(jī)制,鑒于Th1細(xì)胞在免疫調(diào)節(jié)中的重要作用,本實(shí)驗(yàn)觀察了三七和其主要活性組分PNS對(duì)Th1細(xì)胞活力、IFN-γ水平、IFN-γmRNA、T-bet mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明,一定濃度的SQ及PNS可明顯抑制Th1特征性因子T-bet的表達(dá),抑制CD4+T細(xì)胞向Th1方向的分化;其可抑制細(xì)胞IFN-γmRNA的表達(dá),降低上清中IFN-γ的水平,提示其可抑制Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的活性,從而對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。上述研究結(jié)果表明,三七及其活性組分可以抑制CD4+T細(xì)胞向Th1方向的分化和Th1細(xì)胞的分泌活性,這可能是其調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡的機(jī)制之一,從而防治炎癥免疫相關(guān)性疾病和亞健康狀態(tài),這可為三七在日常保健和治療疾病中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。