黃茂坤，林志杰

食源性海洋生物資源是當下食品科學界研究開發(fā)的熱門對象.藍圓鲹，俗稱“巴浪魚”，是東南沿海常見的低值漁獲產(chǎn)品，捕撈量大，但由于易腐爛、不耐貯藏，鮮銷少，常加工為魚干［1］，甚至直接制作成飼料，加工水平有待提升.據(jù)研究［2］，藍圓鲹魚肉中含有人體必需的氨基酸，包括嬰兒必需的組氨酸，是一種優(yōu)質(zhì)的海洋生物資源.生物酶解技術具有反應條件溫和、高效、環(huán)保、便于操作等優(yōu)點，可作為藍圓鲹高值化開發(fā)利用的主要技術手段，比如利用某些蛋白酶對藍圓鲹進行酶解處理后，可將藍圓鲹蛋白水解成小分子多肽或徹底水解成氨基酸，水解液可以進一步開發(fā)為海鮮風味飲料、抗氧化活性肽等高附加值產(chǎn)品，特別是抗氧化活性肽產(chǎn)品，是當前的研究熱點，蔣海萍等［3］的研究表明，藍圓鲹多肽具有較強的抗氧化活性.本試驗從高值化加工的角度出發(fā)，采用風味蛋白酶對藍圓鲹進行水解處理，在優(yōu)化pH、水解溫度、酶添加量、料液比等工藝條件的基礎上，初步探究了藍圓鲹風味蛋白酶水解液的體外抗氧化活性.

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

藍圓鲹，市售；風味蛋白酶（食品級，江蘇銳陽生物科技有限公司）；氫氧化鈉（AR，西隴科學股份有限公司）；甲醛（AR，西隴科學股份有限公司）；硼酸（AR，西隴科學股份有限公司）；鹽酸（AR，西隴科學股份有限公司）；乙醇（AR，西隴科學股份有限公司）；甲基紅（IND，西隴科學股份有限公司）；亞甲基藍（IND，西隴科學股份有限公司）；過氧化氫（AR，西隴科學股份有限公司）；硫酸銅（AR，西隴科學股份有限公司）；硫酸（AR，西隴科學股份有限公司）；硫酸鉀（AR，西隴科學股份有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（98%，上海源葉生物科技有限公司）；水楊酸（AR，西隴科學股份有限公司）；硫酸亞鐵（AR，西隴科學股份有限公司）；雙氧水30%（AR，西隴科學股份有限公司）.

1.2 儀器與設備

J330 型絞肉機（奧克斯集團）；JYL-C012型多功能料理機（九陽股份有限公司）；HYP-308 型消化爐（上海纖檢儀器有限公司）；KDN-103F 型自動凱氏定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；AL104-IC 型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；TG16-WS型臺式高速離心機（湖南湘儀實驗儀器制造有限公司）；PE20 型PH 計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；SHB-Ⅲ磁力攪拌水浴鍋（金壇市良友儀器有限公司）；78HW-1 型恒溫磁力攪拌器（金壇市憶通電子有限公司）；T6 新世紀紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）.

1.3 試驗方法

（1）原料處理.將藍圓鲹內(nèi)臟去除，清洗后瀝干，絞碎拌勻，按一定質(zhì)量分裝好并置于-18 ℃冰箱中保存.

（2）工藝流程.取預先分裝好的原料一份→解凍后加入原料質(zhì)量1 倍的蒸餾水，置于料理機中勻漿→稱取一定質(zhì)量勻漿后的原料→按酶解工藝的料液比要求補齊蒸餾水→按酶解工藝要求調(diào)節(jié)pH→按工藝要求的添加量加入風味蛋白酶（本試驗風味蛋白酶添加量均以解凍后的藍圓鲹原料質(zhì)量為基數(shù)）→置于預先設置好溫度的磁力攪拌水浴鍋中恒溫酶解一段時間→于95 ℃水浴中加熱處理10 min進行滅酶→冷卻后離心處理→按規(guī)范獲取上清液，進行相關指標的測定.

（3）風味蛋白酶水解藍圓鲹工藝的單因素試驗設計.本試驗以藍圓鲹蛋白水解度作為優(yōu)化酶解工藝條件的考察指標，將風味蛋白酶水解時間固定為4 h，分別考察pH、水解溫度、酶添加量、料液比四個因素對酶解效果的影響，每組試驗平行做三次，試驗結果取平均值，具體設計如下：

①將風味蛋白酶添加量、水解溫度、料液比分別固定設置為3.5%、55 ℃、1∶6，考察pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 時風味蛋白酶對藍圓鲹蛋白的水解效果.

②將風味蛋白酶添加量、pH、料液比分別固定設置為3.5%、6.0、1∶6，考察風味蛋白酶水解溫度為40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃時風味蛋白酶對藍圓鲹蛋白的水解效果.

③將風味蛋白酶水解溫度、pH、料液比分別固定設置為55 ℃、6.0、1∶6，考察風味蛋白酶添加量為0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%時風味蛋白酶對藍圓鲹蛋白的水解效果.

④將風味蛋白酶添加量、水解溫度、pH 分別固定設置為3.5%、55 ℃、6.0，考察水解體系料液比為1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 時風味蛋白酶對藍圓鲹蛋白的水解效果.

（4）風味蛋白酶水解藍圓鲹工藝的正交試驗設計.本試驗不考慮工藝條件的交互作用，以藍圓鲹蛋白水解度為考察指標，在上述單因素試驗的基礎上，確定出pH（A）、水解溫度（B）、酶添加量（C）、料液比（D）四個因素的水平范圍（見表1），采用L16（45）設計正交試驗，于水解時間為4 h 的條件下進一步優(yōu)化風味蛋白酶水解藍圓鲹蛋白的工藝條件.

表1 L16（45）正交試驗因素水平表

（5）藍圓鲹蛋白酶解液體外抗氧化活性試驗設計.本試驗在上述酶解工藝條件優(yōu)化的基礎上，將風味蛋白酶水解工藝的pH、水解溫度、酶添加量、料液比分別固定設置為6.0、55 ℃、3.5%、1∶6，以DPPH 自由基清除率為指標，考察不同酶解時間1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 處理藍圓鲹蛋白后其酶解液體外抗氧化活性的變化情況.

1.4 指標測定方法

（1）總氮含量的測定.采用GB5009.5-2016 凱式定氮法測定總氮含量.

（2）氨基態(tài)氮含量的測定.采用甲醛電位滴定法［4］測定氨基態(tài)氮含量.

（3）水解度的計算公式［5］.

（4）DPPH 自由基清除率的測定［6］.以95%乙醇溶解DPPH，配成濃度為10 mmol/L 的溶液.在分光光度計上以2 mL 樣品液與2 mL 95%乙醇混勻后的溶液調(diào)零，取2 mL 樣液與2 mL DPPH 溶液混合搖勻，室溫下避光放置30 min 后測517 nm 處的吸光度，記為A樣.空白管以95%乙醇代替樣品，測定吸光度，記為A空.每個樣品重復測定3 次，取平均值.

2 結果

2.1 風味蛋白酶水解工藝試驗結果

（1）單因素試驗結果分析.

①pH 對藍圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍圓鲹蛋白水解度為縱坐標，以風味蛋白酶水解體系的pH 為橫坐標，繪制水解度與pH 的關系曲線，如圖1 所示，隨著pH 的增長，風味蛋白酶對藍圓鲹蛋白的水解效果呈先升高后降低的趨勢，水解效果最佳時pH 為6.0.從試驗結果可知，pH 對風味蛋白酶催化活性的發(fā)揮具有一定的影響，因為風味蛋白酶本身是一種蛋白質(zhì)，具有兩性性質(zhì)，其所處溶液的酸堿性（即pH 高低）會使其解離情況發(fā)生變化，從而影響其催化活性.

圖1 pH 對藍圓鲹蛋白水解度的影響

②水解溫度對藍圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍圓鲹蛋白水解度為縱坐標，風味蛋白酶水解溫度為橫坐標，繪制水解溫度與水解度的關系曲線，如圖2 所示，在40～55 ℃的溫度范圍內(nèi)，風味蛋白酶對藍圓鲹蛋白的水解度隨著溫度的升高而升高，超過55 ℃開始呈下降趨勢，說明在催化水解藍圓鲹蛋白的過程中，55 ℃左右是風味蛋白酶發(fā)揮催化活性的適合溫度條件，偏離這個溫度太遠，會影響風味蛋白酶催化活性的發(fā)揮，降低水解效果.

圖2 水解溫度對藍圓鲹蛋白水解度的影響

③酶添加量對藍圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍圓鲹蛋白水解度為縱坐標，風味蛋白酶添加量為橫坐標，繪制酶添加量與水解度的關系曲線，如圖3 所示，風味蛋白酶的水解效果隨著酶添加量的增加而呈現(xiàn)逐步升高的趨勢，當酶添加量為3.5%時，藍圓鲹蛋白水解度達到峰值，當酶添加量超過3.5%以后，藍圓鲹蛋白水解度變化開始趨緩甚至略有下降，說明在其他酶解條件固定的情況下，改變風味蛋白酶添加量可以改變其對藍圓鲹蛋白的水解效果，并且存在一個最佳值，超過最佳值，風味蛋白酶反而會抑制自身對藍圓鲹蛋白的催化水解作用，導致水解度降低.

圖3 酶添加量對藍圓鲹蛋白水解度的影響

④料液比對藍圓鲹蛋白水解效果的影響.以測得的藍圓鲹蛋白水解度為縱坐標，風味蛋白酶水解體系料液比為橫坐標，繪制料液比與水解度的關系曲線，如圖4 所示，隨著反應體系加液量的升高，藍圓鲹蛋白水解度呈先升高后降低的趨勢，當料液比為1∶6 時，風味蛋白酶對藍圓鲹蛋白的水解效果最好，原因可能是：在磁力攪拌作用下的液體反應體系中，風味蛋白酶與藍圓鲹原料顆粒要碰觸在一起才能發(fā)生水解反應，反應體系的液體量過多或過少都不利于他們充分接觸，從而影響水解效果.

圖4 料液比對藍圓鲹蛋白水解度的影響

（2）正交試驗結果分析.風味蛋白酶水解藍圓鲹蛋白的正交試驗結果見表2，對試驗結果進行極差分析（見表3）可知，風味蛋白酶水解藍圓鲹蛋白的4 個工藝條件的最佳組合為A2B3C2D3，即pH=6.0、水解溫度為55 ℃、酶添加量為3.5%、料液比為1∶6.對試驗結果進行方差分析（見表4）可知，四個試驗因素均對試驗結果的影響顯著，對試驗結果的影響大小為：A（pH）＞D（料液比）＞C（酶添加量）＞B（水解溫度）.在酶解時間為4 h 的條件下，采用上述最佳工藝水解藍圓鲹樣品進行驗證試驗，測得藍圓鲹蛋白水解度為38.71%.

2.2 藍圓鲹蛋白酶解液體外抗氧化活性試驗結果

表2 正交試驗結果

表3 極差分析結果

表4 方差分析結果

表5 不同水解時間對藍圓鲹蛋白水解度及酶解液抗氧化活性的影響

DPPH 自由基是一種很穩(wěn)定的氮中心自由基，常用于抗氧化成分的體外抗氧化性評價，DPPH 自由基清除率越大表明抗氧化能力越強［7］.從表5 可知，隨著水解時間的延長，藍圓鲹蛋白水解度逐漸升高，但4 h 以后變化開始趨緩，為此，本試驗只選取水解時間為1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 的酶解液測定DPPH 自由基清除率.結果表明，水解時間為3 h 的藍圓鲹蛋白酶解液的DPPH 自由基清除率最大，DPPH 自由基清除率與水解度之間并無明顯作用規(guī)律，這可能是因為酶解液抗氧化活性與其中所含小分子多肽上的基團有關，隨著水解時間的推進，在提高藍圓鲹蛋白水解度的同時，其蛋白質(zhì)分子被分解為小分子多肽的情況也在發(fā)生變化，因此呈現(xiàn)出抗氧化活性不同的現(xiàn)象.

3 討論與結論

近年來，國內(nèi)外諸多學者研究利用蛋白酶酶解海洋低值魚，實現(xiàn)海洋低值蛋白資源高值化，積累了一些技術經(jīng)驗［8］.在借鑒相關經(jīng)驗的基礎上，本試驗在水解時間為4 h 的條件下，對風味蛋白酶水解藍圓鲹蛋白的工藝條件進行優(yōu)化，得出最佳組合：pH=6.0、水解溫度為55 ℃、酶添加量為3.5%、料液比為1∶6，采用該工藝條件水解處理藍圓鲹蛋白，水解度為38.71%.研究表明，許多生物活性肽在母體蛋白中不一定具有活性，但在體外采用生物酶解等方法處理后，一些具有抗氧化活性的肽片段就會被釋放［9］.本試驗固定pH=6.0、水解溫度55 ℃、酶添加量3.5%、料液比1∶6，考察了不同水解時間條件下藍圓鲹蛋白水解度與酶解液DPPH 自由基清除率的變化情況，發(fā)現(xiàn)DPPH 自由基清除率的變化與水解度的變化無明顯的相關性，但藍圓鲹風味蛋白酶水解液具有一定的體外抗氧化活性，其DPPH 自由基清除率的最大值為80.19%.試驗初步證明，采用風味蛋白酶水解處理藍圓鲹，其產(chǎn)物可作為開發(fā)抗氧化活性肽產(chǎn)品的潛在資源，未來可對該酶解產(chǎn)物的其他體外抗氧化活性指標和體內(nèi)抗氧化活性進行深入研究，以期為藍圓鲹高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供技術參考.