趙志東，郇金亮，湯文俊，秦賢舉

·論著·

hsa-miR-21-5p/ZNF367分子軸通過PI3K/Akt通路影響胃癌細(xì)胞的增殖和遷移

趙志東，郇金亮，湯文俊，秦賢舉

200235 上海市第八人民醫(yī)院普外科

探討ZNF367 通過 PI3K/Akt 通路抑制胃癌（GC）細(xì)胞的增殖和遷移，并初步探討其作用分子機(jī)制。

收集 2015 年 8 月– 2018 年 10 月上海市第八人民醫(yī)院普外科手術(shù)切除的 GC 組織（非壞死部分）和相鄰癌旁組織（距腫瘤組織 > 3 cm）標(biāo)本 46 例，同時(shí)選取正常人胃黏膜上皮細(xì)胞 GES1 及 GC 細(xì)胞系 MGC-803 和MKN-45。采用 qRT-PCR、Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) ZNF367 和 hsa-miR-21-5p（miR-21-5p）在組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況，進(jìn)行 Kaplan-Meier 生存分析得出總生存期；利用脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染寡核苷酸片段 miRNA-NC、miR-21-5p mimic 和 miR-21-5p inhibitor 至 MGC-803 細(xì)胞，通過 CCK8 法和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖和遷移能力；采用雙熒光素酶報(bào)告載體系統(tǒng)驗(yàn)證 ZNF367 和 miR-21-5p 的作用靶點(diǎn)，采用 qRT-PCR、Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miR-21-5p mimic 和 miR-21-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染 MGC-803 細(xì)胞中 ZNF367、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 以及 PI3K/Akt 通路中 p-PI3K 和 p-Akt 的表達(dá)情況。

ZNF367 在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平分別顯著低于癌旁組織和 GES-1 細(xì)胞（< 0.01），且在 MGC-803 細(xì)胞中表達(dá)水平最低，而 miR-21-5p 的表達(dá)正相反；在 MGC-803 細(xì)胞中，OE-ZNF367 和miR-21-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖和遷移能力顯著低于對(duì)照組，而 siRNA-ZNF367 和 miR-21-5p mimic 轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞增殖和遷移能力顯著高于對(duì)照組；生物信息學(xué)和熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明 ZNF367與 miR-21-5p 具有直接靶向關(guān)系；qRT-PCR、Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在 miR-21-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染組中，E-cadherin 的表達(dá)是顯著提高的（< 0.01），而 N-cadherin、Vimentin、p-PI3K 和 p-Akt 的表達(dá)是顯著下降的（< 0.01）；在 miR-21-5p mimic 轉(zhuǎn)染組中，結(jié)果相反（< 0.01）。

hsa-miR-21-5p/ZNF367 分子軸通過調(diào)控 PI3K/Akt 通路抑制 EMT 過程，從而影響胃癌細(xì)胞MGC-803 的增殖和遷移。

胃癌； ZNF367； miR-21-5p； PI3K/Akt； 增殖； 遷移

胃癌（gastric cancer，GC）是世界范圍內(nèi)第五大最常見的惡性腫瘤類型，是導(dǎo)致患者死亡的第三大原因，胃癌的預(yù)防和治療是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題[1-2]。近幾十年來，雖然全球胃癌發(fā)病率呈穩(wěn)步下降趨勢(shì)，但胃癌仍是一種常見的惡性腫瘤，有效治療手段有限，5 年生存率僅為30% 左右[3-4]。因此，研究胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高臨床治療效果具有重要意義。鋅指蛋白 367（ZNF367）是鋅指蛋白家族中的一員，在胚胎或胎兒紅細(xì)胞組織中表達(dá)，而在正常成人組織中不表達(dá)。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，ZNF367 可以抑制肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀腺癌等的發(fā)生和發(fā)展[5-6]。但是在胃癌研究中還沒有被報(bào)道過。microRNAs（miRNAs）是一種內(nèi)源性表達(dá)的單鏈非編碼小 RNA，一般為 18 ~ 23 nt，可調(diào)控?cái)?shù)以百計(jì)的靶 mRNA 進(jìn)行翻譯抑制或降解[7]。miRNAs 在調(diào)節(jié)許多腫瘤細(xì)胞過程中起著關(guān)鍵作用，它們可以調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路，包括癌基因和抑癌基因的信號(hào)通路，如PI3K/Akt，從而影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為[8-9]。本研究旨在探究 ZNF367 對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，分析 miR-21-5p 與 ZNF367 的相關(guān)性，進(jìn)一步探討miR-21-5p/ZNF367 分子軸調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖和遷移能力的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本 采集 2015 年 8 月– 2018 年 10 月上海市第八人民醫(yī)院普外科手術(shù)切除 46 例胃癌患者癌組織及配對(duì)的癌旁組織標(biāo)本（距腫瘤組織 > 3 cm），所有標(biāo)本取出后立即放入液氮中，并于–80 ℃長(zhǎng)期保存。手術(shù)前未進(jìn)行過任何放療或化療等治療。組織樣本的收集和使用征得患者同意并簽署知情同意書，并獲得上海市第八人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.1.2 細(xì)胞系及主要試劑 胃癌細(xì)胞（MKN-45、MGC-803）以及人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）細(xì)胞購(gòu)自中科院昆明細(xì)胞庫(kù)；RPMI1640、DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；Trizol 和 LipofectamineTM2000 試劑盒購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；RNA 提取試劑盒和熒光定量 PCR 試劑盒 SYBR premix Ex TaqTM購(gòu)自日本 Takara 公司；CCK8 試劑盒購(gòu)自江蘇晶美生物科技有限公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；抗 ZNF367、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K、p-Akt 和 GAPDH 抗體以及二抗均購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司；ECL 化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自北京索萊寶公司。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor、pcDNA 空載體、pcDNA-ZNF367和 siRNA-ZNF367 質(zhì)粒由上海聚公生物科技有限公司構(gòu)建。

GES-1 和 MGC-803 細(xì)胞株用含 10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 mg/ml 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基于 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞按 2 × 105個(gè)/孔接種于 6 孔板中，使用 LipofectamineTM2000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒分別將pcDNA-ZNF367、siRNA-ZNF367、miR-21-5p mimic、miR-135a inhibitor、pcDNA 空載體轉(zhuǎn)染至 MGC-803 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 ~ 72 h。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè)基因表達(dá)水平 使用 Trizol 試劑盒提取 GC 組織及細(xì)胞株中的總RNA，NanoDrop2000 分光光度計(jì)檢測(cè) RNA 濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) RNA 的完整性。在PCR 儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為 37 ℃，20 min；85 ℃，5 s；4 ℃，5 min。在 LightCycler?96 System Realtime PCR 儀上進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。使用SuperReal PreMix（Probe）試劑盒進(jìn)行 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)程序：2 × SuperReal PreMix 10 μl、正向引物 0.8 μl、反向引物 0.8 μl、cDNA 模板 3 μl、ddH2O 補(bǔ)足到20 μl。使用作為內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果，相對(duì)表達(dá)水平參照文獻(xiàn)[10]來計(jì)算。引物由上海鉑尚生物科技有限公司合成。引物序列見表 1。

表 1 引物序列

1.2.3 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 分別收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞 5 × 106個(gè)，使用 RAPI 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒檢測(cè)蛋白濃度及純度。蛋白質(zhì)定量后進(jìn)行 10% SDS-PAGE分離蛋白，電泳后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜、5% 脫脂乳粉中封閉 2 h，一抗 4 ℃過夜孵育。次日，PBST 漂洗 3 次，每次 5 min，加入二抗，室溫孵育 2 h，再 PBST 漂洗 3 次，每次 5 min，用 ECL 顯影液使底物顯色，并于凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影，然后采用 Image J 軟件進(jìn)行灰度值分析。每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 3 次平行重復(fù)。

1.2.4 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 細(xì)胞增殖能力采用 CCK8 試劑盒檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)前 1 天將質(zhì)粒（pcDNA-ZNF367、siRNA-ZNF367、miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor、pcDNA 空載體）轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 MGC-803 細(xì)胞，隨后接種于 96 孔板，每孔 100 μl，置于 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 ~ 6 h 至細(xì)胞完全貼壁，每孔加入 10 μl 10% CCK8 溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育 2 h，然后使用酶標(biāo)儀檢測(cè) 450 nm 處的光密度（）值，每組 3 個(gè)重復(fù)孔。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 將質(zhì)粒（pcDNA-ZNF367、siRNA-ZNF367、miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor、pcDNA 空載體）轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的 MGC-803 細(xì)胞，隨后接種于 6 孔板上，形成融合的單層細(xì)胞。然后用 200 μl 移液槍槍頭將單層細(xì)胞劃成一條直線，用 PBS 沖洗一遍，加入全營(yíng)養(yǎng) DMEM 培養(yǎng)基，分別在 0 h 和24 h 進(jìn)行拍照。

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) 構(gòu)建 pLuc-ZNF367 和 pLuc-ZNF367-MUT 質(zhì)粒，分別與 miR-NC 和 miR-21-5p 共轉(zhuǎn)染 MGC-803 細(xì)胞。培養(yǎng) 48 h 后，收集細(xì)胞后使用 PBS 清洗，用 PLB 裂解細(xì)胞，取上清液 10 μl 于 96 孔板，每孔加入 10 μl Luciferase Assay Reagent II，隨后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行螢火蟲和海腎熒光素酶活性檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，采用 Graphpad Prism 8.0 軟件繪圖。所有實(shí)驗(yàn)平行獨(dú)立重復(fù) 3 次。計(jì)量資料如果數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布及方差齊，兩組間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，非正態(tài)分布或非方差齊性資料采用 U 檢驗(yàn)。以*< 0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZNF367 在胃癌組織和細(xì)胞系中呈低表達(dá)

qPCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果表明，胃癌組織中 ZNF367 的基因表達(dá)顯著低于癌旁組織（< 0.01，圖 1A）；而 miR-21-5p 的表達(dá)顯著高于癌旁組織（< 0.01，圖 1B）。ZNF367 在胃癌細(xì)胞系（MGC-803 和 MKN-45）中的表達(dá)水平顯著低于正常胃上皮黏膜細(xì)胞（GES-1）（< 0.01，圖 1C），而 miR-21-5p 的表達(dá)顯著高于胃癌細(xì)胞系（< 0.01，圖 1D）。在 MGC-803 細(xì)胞中的表達(dá)水平趨勢(shì)更明顯，故選擇該細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過數(shù)據(jù)庫(kù)（http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service）分析表明，ZNF367 低表達(dá)組的總存活率顯著低于高表達(dá)組（= 6e-05，圖 1E）。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ZNF367 在 MGC-803 和 MKN-45 細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平顯著低于 GES-1 細(xì)胞株（< 0.05，圖 1F）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ZNF367 是胃癌發(fā)生發(fā)展的抑制基因，并且 ZNF367 低表達(dá)時(shí)具有不良的預(yù)后。此外，其還可能是 miR-21-5p 的潛在靶基因。

圖 1 ZNF367 與miR-21-5p 在GC 組織和細(xì)胞中的表達(dá)及預(yù)后分析（A ~ B：ZNF-367 和miR-21-5p 在癌旁組織和胃癌組織中的表達(dá)分析，**P < 0.01；C ~ D：ZNF367 和miR-21-5p 在對(duì)照細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)分析，**P < 0.01；E：胃癌病人總生存率分析；F：胃癌細(xì)胞中 ZNF367 蛋白表達(dá)分析）

Figure 1 Expressions of ZNF367 and miR-21-5p in GC tissues and cell lines and survival analysis (**< 0.01 vs non-GC tissues or GES-1 group; A - B: Relative expression of ZNF367 and miR-21-5p in non-GC tissues and GC tissues by qRT-PCR; C - D: Relative expression of ZNF367 and miR-21-5p in GC cell lines by qRT-PCR; E: The correlation between ZNF367 and survival rate of GC patients; F: ZNF367 protein expression in GC cell lines)

2.2 ZNF367 可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移

CCK8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：過量表達(dá) ZNF367 的細(xì)胞的增殖能力顯著低于對(duì)照組。而抑制ZNF367 表達(dá)的細(xì)胞的增殖能力顯著高于對(duì)照組（**< 0.01，圖 2A）。由圖 2B 可以看出 miR-21-5p 對(duì)于胃癌細(xì)胞增殖的影響與 ZNF367 是相反的（**< 0.01、*< 0.05）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖 2C）顯示：過量表達(dá) ZNF367 的細(xì)胞的遷移能力顯著低于對(duì)照組。而抑制 ZNF367 表達(dá)的細(xì)胞的遷移能力顯著高于對(duì)照組。miR-21-5p 對(duì)于胃癌細(xì)胞增殖和遷移的影響與 ZNF367 是相反的。由此可以看出：ZNF367 可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，進(jìn)一步表明 ZNF367 可能是 miR-21-5p 的潛在靶基因。

2.3 ZNF367 的 3'UTR 是 miR-21-5p 的直接作用靶點(diǎn)

通過靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站（http://www.targetscan. org/vert_72/）尋找 ZNF367 靶基因，結(jié)果顯示 ZNF367 的 3′UTR 區(qū)域確實(shí)包含 miR-21-5p 的結(jié)合位點(diǎn)（圖 3A）。miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染 MGC-803 細(xì)胞后，qRT-PCR 結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染 miR-21-5p mimic 的細(xì)胞中，ZNF367 的基因和蛋白表達(dá)量都顯著低于對(duì)照組（**< 0.01，圖 3B，3C），而在轉(zhuǎn)染 miR-21-5p inhibitor 的細(xì)胞中，ZNF367 的基因和蛋白表達(dá)量都顯著高于對(duì)照組（**< 0.01，圖 3B，3C）。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-21 可以顯著抑制 ZNF367-WT的活性，而不能抑制 ZNF367-MUT 的活性（**< 0.01，圖 3D）。表明 ZNF367 的 3′UTR 是miR-21-5p 的直接作用靶點(diǎn)。此外，過量表達(dá) miR-21-5p 還可以促進(jìn) EMT 過程，而干擾 miR-21-5p 抑制 EMT 過程（**< 0.01，圖 3E、3F）。以上結(jié)果表明 miR-21-5p 可能通過 ZNF367 來影響細(xì)胞的 EMT 過程。

圖 2 ZNF367 與miR-21-5p 對(duì)MGC-803 細(xì)胞增殖和遷移能力影響分析（A：轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF367 和OE-ZNF367 的MGC-803 細(xì)胞增殖能力分析，**P < 0.01；B：轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic 和miR-21-5p inhibitor 的MGC-803 細(xì)胞增殖能力分析，**P < 0.01, *P < 0.05；C：轉(zhuǎn)染siRNA-ZNF367、OE-ZNF367、miR-21-5p mimic 和miR-21-5p inhibitor 的MGC-803 細(xì)胞遷移能力分析，標(biāo)尺：100 μm）

Figure 2 Effects of ZNF367 and miR-21-5p on proliferation and migration of MGC-803 cells (A: Cell proliferation viability of siRNA-ZNF367 and OE-ZNF367 MGC-803 cells; B: Cell proliferation viability of miR-21-5p mimic and miR-21-5p inhibitor MGC-803 cells; C: MGC-803 cell migration ability analysis in siRNA-ZNF367, OE-ZNF367, miR-21-5p mimic, and miR-21-5p inhibitor;**< 0.01,*< 0.05 vs non-GC tissues or control group. Bar: 100 μm)

圖 3 ZNF367 靶向結(jié)合miR-21-5p 并影響EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)（A：ZNF367 的3'UTR 區(qū)域包含miR-21-5p 結(jié)合位點(diǎn)；B：轉(zhuǎn)染control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor 的MGC-803 細(xì)胞中 ZNF367 的基因表達(dá)分析，**P < 0.01；C：轉(zhuǎn)染control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor 的MGC-803 細(xì)胞中 ZNF367 的蛋白表達(dá)分析，**P < 0.01；D：相對(duì)熒光素酶活性分析，**P< 0.01；E：EMT 信號(hào)通路基因表達(dá)分析，**P < 0.01；F：EMT 信號(hào)通路蛋白表達(dá)分析）

Figure 3 ZNF367 targeted by miR-21-5p and affected EMT-related protein expression (A: The 3'UTR of ZNF367 mRNA contains the binding sequences of miR-21-5p; B: Relative expression of ZNF367 in MGC-803 cells transfected with control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor; C: ZNF367 protein expression in MGC-803 cells transfected with control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor; D: Relative luciferase activity was analyzed in MGC-803 cells; E: Relative expression of EMT related genes in MGC-803 cells transfected with control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor,**< 0.01; F: EMT related proteins expression in MGC-803 cells transfected with control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor)

2.4 miR-21-5p/ZNF367 分子軸通過 PI3K/Akt 通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移

Western blot和 qRT-PCR 結(jié)果顯示：在 miR-21-5p inhibitor 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，ZNF367 的表達(dá)顯著提高，而 p-Akt、p-PI3K 的表達(dá)顯著降低；而在 miR-21-5p mimic 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，ZNF367 的表達(dá)顯著降低，而 p-Akt、p-PI3K 的表達(dá)顯著提高（**< 0.01，圖 4A、4B）。結(jié)果表明：miR-21-5p/ZNF367 分子軸通過 PI3K/Akt 通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。

圖 4 miR-21-5p/ZNF367 分子軸通過PI3K/Akt 通路影響胃癌細(xì)胞的增殖和遷移（A：轉(zhuǎn)染control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor 的MGC-803 細(xì)胞中PI3K/Akt 通路相關(guān)基因表達(dá)分析，**P < 0.01；B：轉(zhuǎn)染control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor 的MGC-803 細(xì)胞中PI3K/Akt 通路相關(guān)蛋白表達(dá)分析）

Figure 4 miR-21-5p/ZNF367 axis affects the proliferation and migration of gastric cancer cells via the PI3K/Akt pathway (A: The expression level of PI3K/Akt pathway related genes in MGC-803 cells transfected with control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor; B: PI3K/Akt pathway related proteins expression in MGC-803 cells transfected with control/miR-21-5p mimic/miR-21-5p inhibitor;**< 0.01 vs control group)

3 討論

鋅指蛋白是自然界一大類轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合靶基因從而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[11]。Cys2/His2 型鋅指蛋白是其中較大的一類，其中一些已被發(fā)現(xiàn)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[12-13]。研究發(fā)現(xiàn) ZNF382位于 19 號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，在調(diào)節(jié)結(jié)腸癌和鼻咽癌細(xì)胞的增殖和凋亡等多種細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用[14-15]。Western blot 和 qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)表明 ZNF268 在人卵巢癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，ZNF268 基因敲除和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)表明，ZNF268 基因可能通過促進(jìn)細(xì)胞周期來增加 SKOV-3 細(xì)胞的生長(zhǎng)[16]。ZNF367 可以影響肺癌、腎上腺皮質(zhì)癌、甲狀腺癌等的發(fā)生和發(fā)展[5-6]。但是關(guān)于 ZNF367 是否影響胃癌的發(fā)生和發(fā)展目前還不清楚，本研究克隆了胃癌細(xì)胞中的 ZNF367，其在胃癌組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明其是胃癌細(xì)胞發(fā)展的抑制因子。與鋅指蛋白其他成員不同，ZNF367 在胃癌的發(fā)展過程中起到抑制作用。

miRNAs 是一類進(jìn)化上十分保守、長(zhǎng)度為 20 ~ 23 nt 的核苷酸非編碼單鏈小分子 RNA，是目前的研究重點(diǎn)[17]。miR-21 在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[18]。研究表明 miR-21 可以通過結(jié)合 PTEN 的 3'UTR 區(qū)域來抑制胃癌和非小細(xì)胞肺癌的增殖和侵襲[19-20]。miRNA-21 還被證明可以同時(shí)結(jié)合 PTEN 和 PDCD4 蛋白進(jìn)而抑制膽管癌細(xì)胞的增殖[21]。然而，miR-21-5p 能夠結(jié)合鋅指蛋白家族的報(bào)道還比較少。本研究的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)和qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)表明 ZNF367 的 3'UTR 是 miR-21-5p 的直接作用靶點(diǎn)。由此可見，miR-21-5p 可以參與多種途徑來調(diào)控癌癥的發(fā)生和發(fā)展。本研究進(jìn)一步豐富了 miR-21-5p 在腫瘤進(jìn)展方面的功能。

PI3K/Akt 信號(hào)通路是具有酶活性的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究發(fā)現(xiàn)人類的多種腫瘤如胃癌、大腸癌、乳腺癌、肝癌、腎癌等均與 PI3K/Akt 信號(hào)通路密切相關(guān)，且 PI3K/Akt 信號(hào)通路中多種上下游分子的表達(dá)量改變均可影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，ZNF407可以通過 PI3K/Akt 信號(hào)通路來影響腸胃癌的發(fā)生和進(jìn)展[22]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中，過量表達(dá) ZNF703 可以通過 PI3K/Akt/GSK-3β 信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[24]。本研究通過 qRT-PCR 和Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了 miR-21-5p/ZNF367 分子軸通過PI3K/Akt 通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。

總之，本研究探究了胃癌發(fā)展過程中的新的機(jī)制，也為胃癌的診斷和治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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The hsa-miR-21-5p/ZNF367 molecular axis affects the proliferation and migration of gastric cancer cells through the PI3K/Akt pathway

ZHAO Zhi-dong, HUAN Jin-liang, TANG Wen-jun, QIN Xian-ju

General Surgery, Shanghai Eighth People's Hospital, Shanghai 200235, China

To investigate effect of miR-21-5p/ZNF367 axis on the proliferation and migration of gastric cancer (GC) cells.

GC and corresponding para-cancer normal tissues were obtained from 46 gastric cancer patients undergoing surgery in General Surgery Department of Shanghai Eighth People's Hospital. Meanwhile, GES-1 and GC cell lines MGC-803 and MKN-45 were selected to perform the assays. We used qRT-PCR and Western blot (WB) to detect the expression level of ZNF367 and hsa-miR-21-5p (miR-21-5p) in the tissues and cell lines, and kaplan-meier survival analysis was performed to obtain total survival period. The LipofectamineTM2000 was used to transfect oligonucleotide fragments, including miRNA-NC, miR-21-5p mimic and miR-21-5p inhibitor, into MGC-803 cells. The proliferation and migration of the cells were detected by CCK8 and wound healing assay, respectively. Dual luciferase reporter gene assays were used to validate the relationship between ZNF367 and miR-21-5p. The expression level of ZNF367, E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, p-PI3K and p-Akt in MGC-803 cells transfected with miR-21-5p mimic and miR-21-5p inhibitor were detected by qRT-PCR and WB experiments.

The expression level of ZNF367 in GC tissues and cell lines was significantly lower than that in para-cancer tissues and GES-1 cells (< 0.01), and the expression level was the lowest in MGC-803 cells, while the expression level of miR-21-5p was found in an opposite way (< 0.01). In MGC-803 cells, the proliferation and migration abilities of cells transfected with over-expressed ZNF367 and miR-21-5p inhibitor were significantly lower than those of the control group, while the proliferation and migration abilities of cells transfected with siRNA-ZNF367 and miR-21-5p mimic were significantly higher than those of the control group. Bioinformatics and luciferase activity assays showed that ZNF367 had a direct targeting relationship with miR-21-5p. The results of qRT-PCR and WB experiments demonstrated that the expression of E-cadherin was significantly increased in the miR-21-5p inhibitor transfection group (< 0.01), while the expression of N-cadherin, Vimentin, p-PI3K and p-Akt significantly was decreased. In the transfection group of miR-21-5p mimic, opposite results were observed (< 0.01).

ZNF367 was a negative regulator in the proliferation and migration of GC cell MGC-803. The miR-21-5p/ZNF367 molecular axis affects EMT process by regulating PI3K/Akt pathway.

Gastric cancer, ZNF367, miR-21-5p, PI3K/Akt, Proliferation; Migration

QIN Xian-ju, Email: qinxj@hotmail.com

·協(xié)會(huì)之窗·

協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理學(xué)分會(huì)正式啟動(dòng)《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全與管理學(xué)》教材編寫工作

日前，《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全與管理學(xué)》教材第一次編委會(huì)召開，啟動(dòng)了教材的編寫序幕。編委會(huì)由協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理學(xué)分會(huì)主任委員吳炳義教授擔(dān)任主持，參會(huì)人員包括大連醫(yī)科大學(xué)朱亮教授、中南大學(xué)湘雅醫(yī)院申竑教授、四川大學(xué)華西醫(yī)院黃強(qiáng)科長(zhǎng)、安徽醫(yī)科大學(xué)肖風(fēng)麗教授、大連醫(yī)科大學(xué)吳云紅教授等十余位專家。吳炳義主委首先向大家宣布《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全與管理學(xué)》教材獲人衛(wèi)社批準(zhǔn)編寫，接著由副主任委員朱亮教授就編寫思路和具體要求進(jìn)行詳細(xì)講解。會(huì)議還針對(duì)具體章節(jié)的編寫和分工情況進(jìn)行了討論，對(duì)教材的內(nèi)容、章節(jié)增補(bǔ)和修改提出了建議并達(dá)成共識(shí)。

2019 年年底，協(xié)會(huì)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理分會(huì)和大連醫(yī)科大學(xué)向人民衛(wèi)生出版社提出《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全與管理學(xué)》教材的編寫申請(qǐng)并進(jìn)行聯(lián)合申報(bào)。經(jīng)人民衛(wèi)生出版社嚴(yán)謹(jǐn)?shù)恼{(diào)研后，于 2020 年 2 月正式批準(zhǔn)。該教材由朱亮、吳炳義任主編，申竑、黃強(qiáng)、肖風(fēng)麗、吳云紅任副主編。教材貫徹習(xí)近平總書記“把生物安全納入國(guó)家安全體系，系統(tǒng)規(guī)劃國(guó)家生物安全風(fēng)險(xiǎn)防控和治理體系建設(shè)，全面提高國(guó)家生物安全治理能力”的精神，把生物安全上升到國(guó)家安全的高度。

近年來，高校實(shí)驗(yàn)室事故頻發(fā)，與高校安全管理機(jī)制不健全，措施落實(shí)不到位及學(xué)生實(shí)驗(yàn)室安全與管理知識(shí)匱乏有關(guān)。但目前市場(chǎng)上還沒有適合醫(yī)學(xué)本科生、研究生和醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室從業(yè)人員使用的關(guān)于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全與管理類的教材；缺少一本能幫助醫(yī)學(xué)科研者建立全面、系統(tǒng)，且實(shí)際操作性強(qiáng)的通識(shí)教育教材。

此次《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安全與管理學(xué)》獲批編寫，對(duì)各級(jí)別醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的安全使用及管理具有重要的指導(dǎo)意義；同時(shí)對(duì)于實(shí)驗(yàn)室建設(shè)與管理學(xué)分會(huì)是一個(gè)重要契機(jī)，擴(kuò)大了分會(huì)在行業(yè)內(nèi)的影響力。

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.03.008

上海市徐匯區(qū)科委重大項(xiàng)目（SHXH201794）

秦賢舉，Email：qinxj@hotmail.com

2019-12-09