王炳華，胡建國(guó)，童光森

(1.浙江商業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 旅游烹飪學(xué)院，杭州 310053；2.濟(jì)南大學(xué)，濟(jì)南 250002；3.四川旅游學(xué)院，成都 610100；4.成都大學(xué)肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610106)

魚(yú)露制備主要是利用一些低值魚(yú)蝦及其下腳料通過(guò)微生物分解原料中的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)發(fā)酵制備的一款具有咸鮮適口風(fēng)味的調(diào)味品[1]。因其在發(fā)酵過(guò)程中經(jīng)多種微生物參與，其營(yíng)養(yǎng)較為全面，富含多種風(fēng)味成分，氨基酸組成合理，含有可溶性短肽、?；撬岬瓤寡趸钚晕镔|(zhì)，是我國(guó)常用的一種調(diào)鮮調(diào)味品[2]。

傳統(tǒng)魚(yú)露制備發(fā)酵周期較長(zhǎng)，含鹽量高，與低鹽的健康理念相悖，較高的鹽濃度雖然可以有效地抑制腐敗菌繁殖，但是同時(shí)也降低了酶解活力，延長(zhǎng)了發(fā)酵周期[3]。低鹽發(fā)酵魚(yú)露降低了鹽添加量，通過(guò)曲種添加、調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度等縮短了發(fā)酵周期，有效地克服了傳統(tǒng)發(fā)酵存在的弊端，但低鹽發(fā)酵魚(yú)露過(guò)程中存在的風(fēng)味不明顯、生物胺含量較高等問(wèn)題，主要是受微生物影響[4]。微生物菌群變化及其微生態(tài)作用直接影響成品魚(yú)露的品質(zhì)，微生物作用在魚(yú)露生產(chǎn)中具有重要地位[5]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)白酒、陳醋、黃豆醬等發(fā)酵過(guò)程中的微生物動(dòng)態(tài)變化相關(guān)研究較多，但是對(duì)低鹽發(fā)酵魚(yú)露的微生物動(dòng)態(tài)變化研究較少，生產(chǎn)企業(yè)缺少相關(guān)依據(jù)，通過(guò)分析影響魚(yú)露品質(zhì)的相關(guān)微生物在發(fā)酵不同階段的變化，探討其與主要理化指標(biāo)的關(guān)系，可以解釋魚(yú)露品質(zhì)指標(biāo)形成的本質(zhì)，為低鹽魚(yú)露發(fā)酵工藝提供了理論依據(jù)[6]。

基于此，通過(guò)研究低鹽發(fā)酵方式制備的鳀魚(yú)魚(yú)露在發(fā)酵過(guò)程中不同階段微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況，分析其pH值、氨基酸態(tài)氮(AAN)、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)等理化指標(biāo)以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸的含量動(dòng)態(tài)變化情況，探討低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露過(guò)程中微生物菌群與理化指標(biāo)的聯(lián)系，分析其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與游離氨基酸的變化情況，為低鹽魚(yú)露發(fā)酵工藝改良及相關(guān)研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳀魚(yú)：購(gòu)于舟山漁港；木瓜蛋白酶、pH緩沖液、米曲霉3.042：購(gòu)于浙江匯寧生物科技有限公司；食鹽：市售；甲醇、乙腈：均為色譜純；其他試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GJJ-2/32均質(zhì)機(jī) 杭州惠和機(jī)械設(shè)備有限公司；HT-1300潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；FE28 pH計(jì) 德州市高通實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FA2104B電子天平 上海精密儀器儀表有限公司；恒溫水浴鍋 江蘇金怡儀器科技有限公司；GL22M離心機(jī) 湖南邁達(dá)儀器有限公司；LN-998多功能料理機(jī) 廣東省中山市創(chuàng)冠電器廠；DHG恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BJPX-I生化培養(yǎng)箱 山東科博生物產(chǎn)業(yè)有限公司；ATN-300型全自動(dòng)凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；KG203快速DNA提取檢測(cè)試劑盒 北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司；S-433D氨基酸分析儀 北京安信科儀器設(shè)備有限公司；TSQ 9000 GC-MS聯(lián)用儀 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鳀魚(yú)魚(yú)露制備

參考袁樹(shù)昆[7]、鄒敏[8]的方法。

鳀魚(yú)酶解：將鳀魚(yú)清洗干凈，猛火蒸50 min，放入多功能料理機(jī)攪打成漿，添加pH緩沖液調(diào)勻至pH值6.0，固液比為1∶4，加入2.5%木瓜蛋白酶，加熱至55 ℃，酶解6 h。

曲種制備工藝：將麩皮與魚(yú)糜按1∶2比例接種米曲霉培養(yǎng)液0.6%，添加200%的水，培養(yǎng)溫度33.5 ℃，培養(yǎng)時(shí)間8 d。

發(fā)酵工藝：將鳀魚(yú)酶解液與麩皮按9∶1比例混合，添加0.9%曲種，加鹽9.3%，在31 ℃，發(fā)酵期間每5 d攪拌一次，發(fā)酵80 d。

1.3.2 微生物總DNA提取與16S rDNA鑒定

取發(fā)酵0，20，40，60，80 d鳀魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵液，過(guò)濾去除大顆粒物質(zhì)，將發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)用C2HCl3O2沉淀，在4 ℃下離心30 min，收集微生物細(xì)胞；使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA[9]。

DNA 16S rDNA PCR擴(kuò)增體系：包含12.5 Master Mix(Taq酶、dNTP混合物以及反應(yīng)緩沖液)，27F 引物1.5 μL，1492R引物1.5 μL，模板DNA 1.5 μL，雙蒸水15.5 μL；16S rDNA PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性(96 ℃，3 min)，變性(95 ℃，30 s)，復(fù)性(60 ℃，30 s)，延伸(72 ℃，30 s)，共進(jìn)行40次循環(huán)；72 ℃延伸8 min；將PCR產(chǎn)物送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將微生物16S rDNA序列在GenBank進(jìn)行同源性檢索，并采用MAGA 5.0軟件進(jìn)行序列分析[10]。

1.3.3 理化指標(biāo)測(cè)定

pH值的測(cè)定參考李可人等[11]的方法；氨基酸態(tài)氮的測(cè)定參考鄒大維等[12]的方法；揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定參考方靖等[13]的方法；揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定采用GC-MS，參考王炳華等[14]的方法；游離氨基酸的測(cè)定參考姜慧嫻等[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

采用SAS 8.1與Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與制圖，所有試驗(yàn)平行3次，p<0.05為顯著性差異[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法從低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露的不同發(fā)酵時(shí)間分離出厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)等36個(gè)門(mén)，以及部分無(wú)法鑒定序列，魚(yú)露微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，根據(jù)相對(duì)豐度，本研究選取豐度值較高的前10位進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并測(cè)定菌落總數(shù)，并計(jì)算各門(mén)數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。

表1 不同發(fā)酵時(shí)期菌群門(mén)類數(shù)量Table 1 The number of phyla of microbial flora in different fermentation periods

注：數(shù)量單位lg(個(gè)/mL)。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中菌群門(mén)類組成豐度Fig.1 Abundance of phyla composition of microbial flora in the fermentation process

由表1和圖1可知，低鹽鳀魚(yú)魚(yú)露在發(fā)酵過(guò)程中其微生物菌群主要分布在厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)等。擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度波動(dòng)較小，分別從前期的1.23%、1.35%、1.54%到發(fā)酵后期的2.05%、1.34%、2.6%，屬于優(yōu)勢(shì)菌群；厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，從發(fā)酵0 d的52.32%下降到16.32%，數(shù)量從6.02 lg(個(gè)/mL)減少到3.89 lg(個(gè)/mL)，主要是受其門(mén)中的乳桿菌目、芽孢桿菌等厭氧或兼性厭氧微生物的影響，低鹽魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中，微生物菌群總量增加，對(duì)其門(mén)類微生物起抑制作用；變形菌門(mén)的相對(duì)豐度呈上升趨勢(shì)，從發(fā)酵初期的38.23%上升到65.23%，數(shù)量相對(duì)穩(wěn)定，從5.88 lg(個(gè)/mL)減少到5.41 lg(個(gè)/mL)，變形菌門(mén)中的假單胞菌目等是嗜氧微生物，微生物菌群總量增加并不影響其門(mén)類微生物的生長(zhǎng)。

綜上分析，低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露在發(fā)酵過(guò)程中，受外界環(huán)境及鹽度影響，微生物菌群總量增加，對(duì)微生物種類有一定影響，菌群主要分布在厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)等，變形菌門(mén)與厚壁菌門(mén)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的豐度相對(duì)較高，屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。

2.2 低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露過(guò)程中pH值含量變化分析

圖2 發(fā)酵過(guò)程中pH的變化Fig.2 Changes in pH values during fermentation

pH的變化在一定程度上反映了低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露酸度的變化，其是反映乳酸發(fā)酵的一個(gè)重要指標(biāo)[17]。由圖2可知，實(shí)驗(yàn)樣品在發(fā)酵0 d時(shí)pH值為7.15，在發(fā)酵的前40 d呈上升趨勢(shì)，在第40天時(shí)，pH值達(dá)到了7.68，之后持續(xù)下降，在發(fā)酵第80天時(shí)，pH值下降到6.59，結(jié)合微生物群落結(jié)構(gòu)變化情況分析，pH值變化與厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)微生物生長(zhǎng)一致，發(fā)酵前期變形菌門(mén)中的假單胞菌目等嗜氧微生物開(kāi)始繁殖，乳酸菌等有益菌種不能充分抑制雜菌的生長(zhǎng)，使pH值呈上升趨勢(shì)，在40 d后，各種微生物數(shù)量達(dá)到頂峰，有益菌種對(duì)雜菌的抑制作用引起pH值下降，微生物中的嗜鹽乳酸菌成為后期的優(yōu)勢(shì)菌種，直接影響魚(yú)露的發(fā)酵效果。

2.3 低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露過(guò)程中AAN值與TVB-N值變化分析

圖3 發(fā)酵過(guò)程中AAN值與TVB-N值變化Fig.3 Changes in AAN and TVB-N values duringfermentation

魚(yú)露中的氨基酸態(tài)氮(AAN)含量是反映其發(fā)酵過(guò)程中氮源被有益微生物利用的程度，其利用程度越高，說(shuō)明鮮味物質(zhì)含量越多，感官指標(biāo)的鮮味越佳,氨基酸態(tài)氮(AAN)是衡量鳀魚(yú)魚(yú)露質(zhì)量的重要指標(biāo)[18]。揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)主要是指鳀魚(yú)魚(yú)露在發(fā)酵過(guò)程中原料肉蛋白被腐敗微生物分解的情況，其含量越高表明氨基酸被破壞的越多[19]。由圖3可知，低鹽鳀魚(yú)魚(yú)露在發(fā)酵前40 d，AAN含量迅速增加，20～40 d增長(zhǎng)快于0～20 d，主要是在發(fā)酵前40 d，魚(yú)露中微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，各種優(yōu)勢(shì)菌相互競(jìng)爭(zhēng)，分泌大量蛋白酶，充分水解鳀魚(yú)蛋白質(zhì)，游離氨基酸含量上升。在發(fā)酵40～80 d，AAN含量開(kāi)始平緩下降，其主要受鳀魚(yú)蛋白質(zhì)含量影響，分解速度下降，其游離氨基酸含量趨于穩(wěn)定。低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露中TVB-N含量始終呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵后期其含量達(dá)到80.21 mg/dL，含量略高，但是在發(fā)酵結(jié)束后存儲(chǔ)過(guò)程中易被去除，TVB-N值上升與微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜有關(guān)，復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu)導(dǎo)致乳酸菌外的雜菌生長(zhǎng)比較旺盛，腐敗微生物對(duì)鳀魚(yú)蛋白質(zhì)分解較快，造成TVB-N值一直呈上升趨勢(shì)。

2.4 低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化分析

本文采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)測(cè)定低鹽鳀魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，分別在0，20，40，60，80 d 5個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)魚(yú)露樣品中共檢測(cè)出28種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中酸類6種、醇類5種、醛類與酮類7種、酯類3種、含氮化合物5種以及其他2種。不同發(fā)酵節(jié)點(diǎn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異較大，在發(fā)酵0 d時(shí)共檢測(cè)出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)9種，其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是腌制液及鳀魚(yú)中的風(fēng)味。在發(fā)酵過(guò)程中的20，40，60，80 d 4個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)分別檢測(cè)出揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)21種、23種、26種、26種，整體分析其在發(fā)酵過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈增加趨勢(shì)。

醇類是低鹽鳀魚(yú)魚(yú)露中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，在20，40，60，80 d 4個(gè)不同發(fā)酵時(shí)間節(jié)點(diǎn)其占樣品總量的34.06%、44.81%、34.81%和33.54%。發(fā)酵0 d時(shí)揮發(fā)性物質(zhì)主要是腌制液與鳀魚(yú)肉本身所含風(fēng)味物質(zhì)。酸類物質(zhì)中的閾值較高，對(duì)魚(yú)露整體風(fēng)味影響不大。前期酸類總量較低，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，其總量增加，這與pH值的檢測(cè)結(jié)果一致。醇類物質(zhì)主要是鳀魚(yú)脂肪氧化以及氨基酸水解產(chǎn)物，其閾值較低，對(duì)整體風(fēng)味影響較大。醛類物質(zhì)是降解產(chǎn)物，其中魚(yú)露中的戊醛、己醛、2-甲基丙醛、3-甲基丁醛等濃度較高，賦予魚(yú)露青草、麥芽香等令人愉快的氣味。庚醛主要呈現(xiàn)魚(yú)腥味，經(jīng)過(guò)發(fā)酵其含量降低，抑制腥味的呈現(xiàn)。酯類物質(zhì)主要是醇類和酸類物質(zhì)經(jīng)過(guò)酯化反應(yīng)的產(chǎn)物，某些酯類物質(zhì)呈現(xiàn)水果和花的香味，豐富魚(yú)露的風(fēng)味[20]。含氮化合物主要來(lái)源于美拉德反應(yīng)或熱分解的產(chǎn)物，其閾值較低，呈現(xiàn)青草味，對(duì)魚(yú)露風(fēng)味有一定影響。

綜合分析，低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)種類增加，其呈味感受受發(fā)酵時(shí)間影響，主要是隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，魚(yú)露微生物菌群中的優(yōu)勢(shì)菌種對(duì)雜菌的抑制作用，抑制不利風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，微生物菌群是低鹽鳀魚(yú)魚(yú)露發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生特征風(fēng)味的重要影響因素。

表2 魚(yú)露主要揮發(fā)性成分測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of main volatile components in fish sauce ng/g

注：“-”表示未檢測(cè)出。

2.5 低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露過(guò)程中游離氨基酸的含量變化

表3 主要游離氨基酸測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of main free amino acids mg/dL

魚(yú)露中的游離氨基酸是其鮮味物質(zhì)的重要組成部分，是評(píng)價(jià)魚(yú)露鮮味的主要指標(biāo)，也是評(píng)價(jià)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)[21]。由表3可知，游離氨基酸總量和必需氨基酸總量隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，0～40 d增加幅度較大，40 d后趨于穩(wěn)定增長(zhǎng)，其增長(zhǎng)趨勢(shì)與氨基酸態(tài)氮(AAN)含量變化一致，其與低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，前期優(yōu)勢(shì)菌相互競(jìng)爭(zhēng)，分泌大量蛋白酶，充分水解鳀魚(yú)蛋白質(zhì)，游離氨基酸含量上升。在發(fā)酵40～80 d，分解速度下降，其游離氨基酸含量趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)果與討論

通過(guò)研究低鹽發(fā)酵方式制備的鳀魚(yú)魚(yú)露在發(fā)酵過(guò)程中不同階段微生物群落結(jié)構(gòu)的變化情況，分析了pH值、氨基酸態(tài)氮(AAN)、揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)等理化指標(biāo)以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、游離氨基酸的含量動(dòng)態(tài)變化情況，研究結(jié)果表明：低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露在發(fā)酵過(guò)程中，受外界環(huán)境及鹽度的影響，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，微生物菌群總量增加，菌群主要分布在厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、放線菌門(mén)等，變形菌門(mén)與厚壁菌門(mén)在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中豐度相對(duì)較高，屬于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。微生物菌群結(jié)構(gòu)變化直接影響pH值、AAN值與TVB-N值的變化：在發(fā)酵的前40 d pH值呈上升趨勢(shì)，達(dá)到了7.68，然后持續(xù)下降，在發(fā)酵第80天時(shí)，pH值下降到6.59；在發(fā)酵前40 d，AAN含量迅速增加，20～40 d增長(zhǎng)快于0～20 d，在發(fā)酵40～80 d，AAN含量開(kāi)始平緩下降；TVB-N含量始終呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵后期其含量達(dá)到80.21 mg/dL。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，其種類增加，呈味感受增強(qiáng)，微生物菌群中的優(yōu)勢(shì)菌種抑制不利風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，游離氨基酸總量和必需氨基酸總量與魚(yú)露中微生物菌群結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，前期優(yōu)勢(shì)菌相互競(jìng)爭(zhēng)，分泌大量蛋白酶，充分水解鳀魚(yú)蛋白質(zhì)，游離氨基酸含量上升，后期趨于穩(wěn)定。

本研究明確了低鹽發(fā)酵鳀魚(yú)魚(yú)露過(guò)程中微生物菌群與理化指標(biāo)的聯(lián)系，分析了其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與游離氨基酸的變化情況，為低鹽魚(yú)露發(fā)酵工藝改良及相關(guān)研究提供了理論依據(jù)及方法借鑒。