李巧鳳，熊漢國(guó)*，熊舟翼

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.武漢農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院 農(nóng)產(chǎn)品加工中心，武漢 430200)

甜柿(non-astringent persimmon)屬柿科柿屬，是一種多年生落葉果樹(shù)，已有近千年的栽培歷史，主要分布于大別山區(qū)[1]。甜柿鮮艷多汁，含有大量的葡萄糖、果糖、多種氨基酸及礦物質(zhì)等，具有較高的食用價(jià)值，被譽(yù)為“果中圣品”[2]。此外，甜柿含有豐富的維生素C和多酚類(lèi)物質(zhì)，具有抗氧化和預(yù)防心血管疾病的作用[3]。羅田縣的甜柿因分布面積廣、種類(lèi)多、種植歷史久，被稱(chēng)為 “羅田甜柿”[4]。羅田甜柿，是我國(guó)唯一原產(chǎn)的甜柿品種，含糖量高，同時(shí)籽粒少，便于加工，是釀造果醋的優(yōu)質(zhì)原料。然而，甜柿屬于易腐爛的呼吸性果實(shí)，在采摘、運(yùn)輸過(guò)程中會(huì)造成大量殘次果，這些殘次果可用于釀造果醋，避免經(jīng)濟(jì)損失，所以開(kāi)發(fā)甜柿果醋具有廣泛的應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

果醋是以水果及其下腳料為原料，經(jīng)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵加工而成的新型酸性飲品或調(diào)味品[5]。與糧食醋相比，果醋不僅有食醋的營(yíng)養(yǎng)保健功能，還保留了水果原有的營(yíng)養(yǎng)成分和其特殊的芳香物質(zhì)[6]。碎米中含有大量的淀粉，可利用根霉菌產(chǎn)生的淀粉酶，將淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖，控制其發(fā)酵時(shí)間得到高糖低醇的甜碎米酒[7]。利用碎米產(chǎn)糖發(fā)酵得到的高糖碎米酒作為甜柿果醋發(fā)酵的調(diào)糖劑，提高發(fā)酵底物的糖度，將其加工成果醋，不僅可以得到風(fēng)味獨(dú)特、口感豐富的特色果醋，還能提高甜柿的附加值和碎米的利用率。本研究以羅田甜柿為原料，利用單因素和響應(yīng)面優(yōu)化果醋的酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段，從而確定甜柿果醋的發(fā)酵參數(shù)，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行研究，為甜柿果醋的加工和應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甜柿：購(gòu)于湖北羅田縣；碎米：購(gòu)于湖北國(guó)誠(chéng)米業(yè)糧食飼料加工廠；葡萄酒高活性干酵母：安琪酵母有限公司；滬釀1.01醋酸菌：北京食品釀造研究所；果膠酶(500 U/mg)、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、2,2′-聯(lián)氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)：上海源葉生物科技有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

WTF手持式糖度儀、恒溫培養(yǎng)箱 上海索譜儀器有限公司； 恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；pH計(jì) 上海智光儀器儀表有限公司；0-40型酒精計(jì) 浙江余姚市黃家埠玻璃儀表廠；UV-1700可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；榨汁機(jī) 合肥榮事達(dá)股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜柿果醋的加工工藝

1.3.2 操作要點(diǎn)

甜柿果漿的制備：挑選成熟、無(wú)病害的甜柿，洗凈后去蒂、去核切成小塊，用榨汁機(jī)打漿。然后向果漿中加入0.03%果膠酶，于50 ℃水浴酶解2 h，分解果膠，提高出汁率。

碎米酒的制備：將碎米蒸熟、攤涼后，加入甜酒曲，發(fā)酵3 d，然后用紗布過(guò)濾，得到高糖低醇的甜碎米酒(糖度約為23 °Bx，酒精度約為1%)。

糖度調(diào)整：將處理好的甜柿果漿、碎米酒和蒸餾水按照一定比例混合，通過(guò)評(píng)價(jià)確定混合比例，加入白砂糖調(diào)節(jié)初始糖度為16 °Bx。

酒精發(fā)酵：在甜柿果漿中接種酵母菌，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將其放置在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行酒精發(fā)酵。

醋酸發(fā)酵：酒精發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液進(jìn)行粗濾，得到甜柿果酒，接入活化擴(kuò)大培養(yǎng)后的醋酸菌，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)將果酒放置在恒溫?fù)u床中進(jìn)行醋酸發(fā)酵。

1.3.3 酒精發(fā)酵條件優(yōu)化

試驗(yàn)選取甜柿果漿、甜米酒和水體積混合比(1∶0∶1、1∶1∶0、1∶1∶1、1∶0∶2、1∶2∶0)、發(fā)酵時(shí)間(0，1，2，3，4，5，6 d)、發(fā)酵溫度(22，25，28，31，34 ℃)、酵母接種量(0.02%、0.06%、0.10%、0.14%、0.18%)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以發(fā)酵液的酒精度為指標(biāo)，確定甜柿果酒的最佳發(fā)酵參數(shù)。

1.3.4 醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化

在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以發(fā)酵方式、初始酒精度(5%、6%、7%、8%、9%)、發(fā)酵溫度(24，27，30，33，36 ℃)、醋酸菌接種量(2%、4%、6%、8%、10%)、初始pH值(3，4，5，6，7)為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以總酸含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Benhnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定醋酸發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiment

1.3.5 指標(biāo)測(cè)定

糖度：使用手持糖度計(jì)測(cè)定；酒精度：采用蒸餾法測(cè)定；總酸含量：用0.1 mol/L NaOH溶液進(jìn)行酸堿滴定(以醋酸計(jì))；DPPH·自由基清除率：參照王志煌[8]的方法測(cè)定；ABST+·自由基清除率：參照李華等[9]的方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒精發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.1.1 甜柿果漿、碎米酒和水混合比例的確定

表2 甜柿果漿、甜米酒和水的混合配比對(duì)果酒的影響Table 2 Effect of the ratio of non-astringent persimmon pulp, broken rice wine and water on fruit wine

由表2可知，甜柿果漿、碎米酒與水的體積比為1∶1∶1時(shí)釀造得到的果酒感官評(píng)價(jià)最高，甜柿果酒的口感和芳香特征均符合感官要求，糖度利用率高。但單獨(dú)添加碎米酒，會(huì)造成米酒味過(guò)重，口感較差，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致酒精度過(guò)高，造成資源浪費(fèi)。因此，試驗(yàn)選擇甜柿果漿、碎米酒與水的最佳配比為1∶1∶1。

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of fermentation time on alcohol fermentation

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液的糖度先快速降低后趨于穩(wěn)定，而酒精度的變化趨勢(shì)與糖度相反。這是由于發(fā)酵前期酵母菌生長(zhǎng)旺盛，大量的還原糖被酵母利用轉(zhuǎn)化為酒精[10]。在第4天時(shí)酒精發(fā)酵基本停止，糖度和酒精度穩(wěn)定不變。因此，選擇酒精發(fā)酵的最適發(fā)酵時(shí)間為4 d。

2.1.3 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，酒精度隨著發(fā)酵溫度的升高而增大。當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，得到的酒精度最高且發(fā)酵結(jié)束后甜柿果酒中的殘?zhí)橇孔畹?。酵母菌生長(zhǎng)有一個(gè)最適溫度，當(dāng)發(fā)酵溫度過(guò)低時(shí)，酵母菌的生長(zhǎng)繁殖和代謝緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵周期長(zhǎng)，產(chǎn)酒率低，而溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致酵母代謝異常，發(fā)酵后殘?zhí)橇扛?，發(fā)酵不完全[11]。因此，甜柿果酒發(fā)酵的最適溫度為28 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on alcohol fermentation

2.1.4 酵母接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響

圖3 酵母接種量對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of yeast inoculation amount on alcohol fermentation

在酒精發(fā)酵過(guò)程中，酵母接種量越大，其產(chǎn)酒精速率越高，周期越短。由圖3可知，酵母接種量為0.1%時(shí)，甜柿果酒的酒精度最高，為8.5%，且殘?zhí)橇康?。但?dāng)酵母接種量超過(guò)0.1%時(shí)，酒精度隨著酵母接種量的增加而下降，這是由于酵母大量繁殖，代謝旺盛，消耗了部分底物，導(dǎo)致酒精度下降，且會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的代謝廢物，影響產(chǎn)品風(fēng)味[12]。因此，選擇甜柿果酒發(fā)酵的最適接種量為0.1%。

2.2 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)

2.2.1 發(fā)酵方式

圖4 發(fā)酵方式對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of fermentation modes on aceticacid fermentation

醋酸菌是好氧菌，發(fā)酵液中的溶氧量與醋酸菌的生長(zhǎng)代謝密切相關(guān)[13]。由圖4可知，發(fā)酵前期，靜止發(fā)酵與搖床發(fā)酵相差不大，因?yàn)榇姿峋幱谏L(zhǎng)期，需氧量相對(duì)較少。但在發(fā)酵第6天后，靜止發(fā)酵液的酸度緩慢上升，而搖床發(fā)酵液的酸度快速增加。第12天后，搖床醋酸發(fā)酵已基本完成，酸度不再增加。這是由于搖床能增加發(fā)酵液中的溶氧量，為醋酸菌代謝提供充足的氧氣，縮短發(fā)酵周期[14]。因此，選擇搖床發(fā)酵方式為宜。

2.2.2 初始酒精度

圖5 初始酒精度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of initial alcohol content on acetic acid fermentation

酒精是醋酸菌生長(zhǎng)代謝所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是醋酸發(fā)酵的主要底物。由圖5可知，初始酒精度為5%～7%時(shí)，總酸隨著初始酒精度的增加而增加。但當(dāng)酒精含量超過(guò)8%時(shí)，醋酸菌產(chǎn)酸速率降低，總酸含量也顯著減少。這是因?yàn)檩^高的酒精度會(huì)抑制醋酸菌的生長(zhǎng)繁殖，降低其活力，延長(zhǎng)發(fā)酵周期。因此，選擇初始酒精度為7%左右較為合適。

2.2.3 醋酸菌接種量

圖6 醋酸菌接種量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of acetic acid bacteria inoculation amount on acetic acid fermentation

由圖6可知，不同的醋酸菌接種量，甜柿果醋中總酸含量也不同。適當(dāng)增加醋酸菌接種量可以提高產(chǎn)酸率，縮短發(fā)酵周期。接種量為6%的發(fā)酵液，總酸含量最高且產(chǎn)酸率快。但當(dāng)接種量大于6%時(shí)，產(chǎn)酸量降低，這是由于接種量過(guò)大，醋酸菌生長(zhǎng)繁殖消耗過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)菌體過(guò)早老化，影響發(fā)酵效果。因此，選擇醋酸菌接種量為6%左右較為合適。

2.2.4 發(fā)酵溫度

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on acetic acid fermentation

由圖7可知，在24～30 ℃，隨著發(fā)酵溫度升高，醋酸菌的產(chǎn)酸量上升。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，甜柿果醋的總酸含量最高，為4.36 g/dL。但溫度過(guò)高時(shí)，總酸含量下降，這是由于醋酸菌生長(zhǎng)代謝旺盛，提前老化且高溫下部分成分揮發(fā)加快，使產(chǎn)酸率降低[15]。因此，選擇發(fā)酵溫度為30 ℃左右較為合適。

2.2.5 初始pH值

圖8 初始pH值對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.8 Effect of initial pH value on acetic acid fermentation

發(fā)酵液的pH會(huì)影響醋酸菌的生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)酸速率。由圖8可知，當(dāng)初始pH在5左右時(shí)，醋酸菌代謝旺盛，產(chǎn)酸率高，發(fā)酵液中總酸含量高。但當(dāng)pH值過(guò)低或過(guò)高時(shí)，都會(huì)抑制醋酸菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致總酸含量降低，同時(shí)也會(huì)影響果醋的品質(zhì)[16]。因此，選擇醋酸發(fā)酵的初始pH為5左右較為合適。

2.3 醋酸發(fā)酵的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，以總酸含量為響應(yīng)指標(biāo)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。使用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，回歸模型的方差分析見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis of response surface experiment

續(xù) 表

注：“*”表示差異性顯著(P<0.05)；“**”表示差異性極顯著(P<0.01)。

由表4可知，回歸方程模型極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)，且相關(guān)性系數(shù)R2=0.96，說(shuō)明該模型的試驗(yàn)擬合度高，試驗(yàn)誤差小，能夠?qū)Υ姿岚l(fā)酵工藝條件進(jìn)行較好的分析和預(yù)測(cè)。由表4方差分析可知，模型的一次項(xiàng)初始酒精度A的影響極顯著(P<0.01)，醋酸菌接種量B、發(fā)酵溫度C的影響顯著(P<0.05)，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2的影響極顯著(P<0.01)，表明這3個(gè)因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響較大，而初始pH值對(duì)醋酸發(fā)酵的影響不顯著。交互項(xiàng)AD、BC的影響極顯著，其他交互項(xiàng)的影響均不顯著。

通過(guò)對(duì)回歸模型的分析得到最佳醋酸發(fā)酵工藝條件為：初始酒精度7.25%、醋酸菌接種量5.89%、發(fā)酵溫度29.78 ℃、初始pH值5，此工藝條件下得到的總酸預(yù)測(cè)值為5.28 g/dL。考慮到試驗(yàn)的可行性，將工藝參數(shù)調(diào)整為：初始酒精度7%、醋酸菌接種量6%、發(fā)酵溫度30 ℃、初始pH值5。經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)后，得到的實(shí)際總酸均值為5.31 g/dL，與預(yù)測(cè)值偏差較小，表明模型能很好地預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果，具有一定的參考價(jià)值。

2.4 甜柿果醋的抗氧化能力

圖9 不同樣品對(duì)DPPH·和ABTS+·自由基的清除能力Fig.9 The scavenging capacity of different samples to DPPH·and ABTS+· free radicals

甜柿果醋營(yíng)養(yǎng)豐富，含有大量的活性成分，如多酚類(lèi)物質(zhì)，具有一定的抗氧化能力[17]。將同濃度的甜柿果醋與市售的某品牌柿子醋及維生素C進(jìn)行清除DPPH·和ABTS+·自由基能力的比較。由圖9可知，當(dāng)甜柿果醋在體積分?jǐn)?shù)為20%時(shí)，DPPH·自由基清除率約為75%，ABTS+·自由基清除率約為63%，同比，維生素C在2 μg/mL時(shí)清除率分別約為30%、10%，表明甜柿果醋具有較強(qiáng)的抗氧化能力。甜柿果醋的DPPH·和ABTS+·自由基清除能力略高于市售的柿子醋，可能是由于柿子品種不同或發(fā)酵工藝不同，導(dǎo)致不同柿子醋的抗氧化能力有一定的差異。

3 結(jié)論

本文以甜柿為原料，添加高糖低醇碎米甜酒，對(duì)果醋的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行分析。酒精發(fā)酵的最適工藝參數(shù)為甜柿果漿、甜米酒和水配比1∶1∶1，發(fā)酵4 d，發(fā)酵溫度28 ℃，酵母接種量0.1%。醋酸發(fā)酵的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為初始酒精度7%，發(fā)酵溫度30 ℃，醋酸菌接種量6%和初始pH值5。在此條件下，發(fā)酵12 d后的甜柿果醋總酸含量可以達(dá)到5.31 g/dL，同時(shí)甜柿果醋表現(xiàn)出良好的體外抗氧化能力。本研究開(kāi)發(fā)了甜柿果醋生產(chǎn)新工藝，提高了甜柿和碎米的經(jīng)濟(jì)效益。