喬志偉

(安順學(xué)院 資源環(huán)境與工程學(xué)院，貴州 安順 561000)

磷是作物生長(zhǎng)最重要的營(yíng)養(yǎng)元素之一，土壤磷含量及其有效性對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要作用。黃壤是貴州農(nóng)業(yè)最主要的土壤類(lèi)型，土壤有效磷的含量較低[1，2]，化學(xué)磷肥中的有效態(tài)磷易與土壤中的鋁、鐵、鈣等離子結(jié)合成難溶態(tài)磷，造成磷素在土壤中累積，磷肥利用率降低[3]；貴州屬于典型的喀斯特區(qū)域，水土流失嚴(yán)重，累積在土壤中的磷素會(huì)隨著水土流失對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生影響。因此如何提高該區(qū)域土壤有效磷含量和磷肥利用率是磷素研究的重點(diǎn)之一。

溶磷細(xì)菌是一類(lèi)在難溶態(tài)磷有效化過(guò)程中發(fā)揮重要作用的微生物，馮哲葉等[4]研究表明在土壤中接種溶磷細(xì)菌可以顯著增加土壤有效磷含量，Anzury等[5]、Pradhan等[6]研究都證明溶磷細(xì)菌可以增加土壤有效磷和提高土壤磷素有效性。溶磷細(xì)菌主要通過(guò)分泌低分子量有機(jī)酸溶解難溶態(tài)磷[7，8]。目前，關(guān)于黃壤區(qū)溶磷細(xì)菌的研究資料及可利用的菌株資源較少，且溶磷細(xì)菌對(duì)土壤酸堿緩沖響應(yīng)如何等問(wèn)題有待解決。本試驗(yàn)對(duì)黃壤區(qū)篩選出的1株假單胞菌溶磷特性進(jìn)行了研究，并通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH模擬土壤酸堿緩沖特性對(duì)其生長(zhǎng)和溶磷能力的影響，以期為該區(qū)域溶磷細(xì)菌的研究提供高效的菌株資源，并為其利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株來(lái)源

試驗(yàn)用溶磷細(xì)菌是通過(guò)PVK平板分離法，從貴州省安順市西秀區(qū)的農(nóng)田土壤(質(zhì)地為黃壤)中篩選出的，并在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過(guò)形態(tài)觀察、生理生化特征和16sRNA 序列分析，鑒定其屬于假單胞菌屬，編號(hào)為P1。

1.1.2 培養(yǎng)基

溶磷能力測(cè)定培養(yǎng)基(NBRIP培養(yǎng)基)：葡萄糖 10.0 g， 硫酸銨0.1 g，氯化鉀 0.2 g，硫酸鎂 0.25 g，磷酸三鈣5.0 g，氯化鎂 5.0 g，蒸餾水1.0 L，調(diào)節(jié)pH到7.0；活化培養(yǎng)基: 蛋白胨10.0 g, 牛肉膏5.0 g，氯化鈉 5.0 g，蒸餾水1.0 L，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 P1對(duì)難溶態(tài)磷(磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵及磷礦粉)溶解能力的測(cè)定

在活化培養(yǎng)基中接種P1菌株，于28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，將菌液按照1%(菌液體積與培養(yǎng)液體積比)的量接種在滅菌的NBRIP培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩箱(30 ℃、150 r·min-1)培養(yǎng)7 d，取發(fā)酵液測(cè)定其有效磷的含量，重復(fù)3次，同時(shí)設(shè)置不接菌的對(duì)照處理，測(cè)定P1對(duì)磷酸三鈣的溶解能力(接菌后培養(yǎng)液有效磷的含量與對(duì)照處理的差值即為溶磷能力)。

在NBRIP培養(yǎng)基中，將磷酸三鈣等質(zhì)量替換為磷酸鋁、磷酸鐵、磷礦粉等，培養(yǎng)基其它成分和培養(yǎng)條件不變，測(cè)定P1對(duì)各難溶態(tài)磷的溶磷能力。

1.2.2 培養(yǎng)基中不同種類(lèi)的碳源及氮源對(duì)P1溶磷能力的影響

在NBRIP培養(yǎng)基中，將葡萄糖分別等質(zhì)量替換為蔗糖、乳糖、淀粉和甘露醇，培養(yǎng)基的其余成分不變，接種活化后的P1菌液培養(yǎng)并測(cè)定菌株溶磷能力，確定最佳的碳源；確定最佳碳源后，分別以硝酸鉀、硝酸鈉、氯化銨、硝酸銨為氮源替換硫酸銨(氮原子摩爾質(zhì)量相同)，接菌培養(yǎng)測(cè)定菌株的溶磷能力，以確定最佳氮源。

1.2.3 培養(yǎng)液初始pH對(duì)P1溶磷能力的影響

在NBRIP培養(yǎng)基中，通過(guò)0.01 mol·L-1的HCl和0.01 mol·L-1的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的初始pH，將培養(yǎng)液初始pH分別調(diào)節(jié)為4、5、6、7、8、9，將活化后的P1菌液接種在不同初始pH且滅菌的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7 d后測(cè)定發(fā)酵液有效磷含量。

1.2.4 培養(yǎng)液pH緩沖對(duì)P1溶磷能力的影響

將菌液按照1%(菌液體積與培養(yǎng)液體積比)的量接種在滅菌的NBRIP培養(yǎng)基中，在恒溫振蕩箱(30 ℃、150 r·min-1)振蕩培養(yǎng)。在第1、2、3、4、5、6、7天測(cè)定培養(yǎng)液pH、有效磷和菌液密度(OD600)，當(dāng)培養(yǎng)液pH降至7.0以下，用滅菌后的0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)至7.0(+NaOH)。同時(shí)設(shè)置不調(diào)節(jié)pH的對(duì)照處理(-NaOH)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.5 P1培養(yǎng)液有效磷含量、pH值及菌液密度(OD600)的測(cè)定

培養(yǎng)液有效磷測(cè)定：將P1發(fā)酵液在4 ℃，6 000 r·min-1的條件下離心8 min，取上清液通過(guò)鉬銻抗比色法測(cè)定；pH直接用pH計(jì)測(cè)定；菌液密度(OD600)測(cè)定：取培養(yǎng)好菌株發(fā)酵液10 mL于25 mL的離心管中，調(diào)節(jié)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1 500 r·min-1，將菌液離心5 min并吸取上清液3 mL，再加入3 mL 1 mol·L-1的HCl，在600 nm處比色測(cè)定，以未接菌的對(duì)照作為參比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)采用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分析軟件為Excel2003和SASV8.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 假單胞菌P1對(duì)不同難溶態(tài)磷酸鹽的溶解能力

假單胞菌P1在不同難溶態(tài)培養(yǎng)液中有效磷含量及溶磷能力見(jiàn)表1。P1在以磷酸三鈣為唯一磷源條件下培養(yǎng)液中有效磷含量最高，為558.08 mg·L-1，比對(duì)照處理顯著增加了16.84倍；在以磷酸鋁和磷酸鐵為難溶態(tài)磷源的培養(yǎng)液中有效磷含量分別為132.45、231.46 mg·L-1，比對(duì)照處理顯著增加了2.73倍和3.62倍；在磷礦粉為磷源的培養(yǎng)液中有效磷含量最低，僅為26.49 mg·L-1。菌株溶磷能力是培養(yǎng)液中有效磷含量與相應(yīng)對(duì)照處理的差值，P1對(duì)磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵、磷礦粉的溶磷能力分別為526.80、96.98、181.38、22.03 mg·L-1。

2.2 培養(yǎng)基不同種類(lèi)的碳源及氮源對(duì)P1溶磷能力的影響

培養(yǎng)基不同種類(lèi)的碳源及氮源對(duì)P1培養(yǎng)液有效磷影響見(jiàn)表2。培養(yǎng)基不同種類(lèi)的碳源P1培養(yǎng)液有效磷含量不同，以葡萄糖作碳源P1培養(yǎng)液中有效磷含量是最高的558.08 mg·L-1，顯著高于其它碳源；以蔗糖和乳糖等雙糖作為碳源P1培養(yǎng)液有效磷含量都在400 mg·L-1以上；以淀粉等多糖作為碳源P1培養(yǎng)液有效磷含量最低，僅為173.78 mg·L-1；不同碳源培養(yǎng)液有效磷的含量表明菌株對(duì)碳源的利用效率，P1對(duì)單糖的利用效率最高，雙糖次之，對(duì)多糖的利用率最低。P1對(duì)甘露醇也有一定的利用能力，在以甘露醇為碳源條件下培養(yǎng)液有效磷含量為291.6 9 mg·L-1。試驗(yàn)最佳碳源為葡萄糖。

以葡萄糖為碳源，培養(yǎng)基不同種類(lèi)的氮源對(duì)P1培養(yǎng)液有效磷含量的影響不同，不同氮源條件下P1培養(yǎng)液有效磷含量在385.07～558.08 mg·L-1，P1菌株在以硫酸銨和氯化銨作為氮源培養(yǎng)液中有效磷含量分別為558.08和544.31 mg·L-1，在以硝酸鉀和硝酸鈉為氮源條件下P1培養(yǎng)液有效磷含量分別為400.64和385.07 mg·L-1，P1以氨態(tài)氮為氮源培養(yǎng)液有效磷含量顯著高于以硝態(tài)氮為氮源；以硝酸銨為氮源培養(yǎng)液有效磷含量為469.78 mg·L-1。P1在以葡萄糖為碳源、硫酸銨為氮源的條件下培養(yǎng)液有效磷含量最高，為558.08 mg·L-1。

表1 假單胞菌P1在不同種類(lèi)難溶態(tài)磷培養(yǎng)液中有效磷含量及溶磷能力Table 1 Available phosphorus content and phosphorus solubilizing ability of P1 in different kinds of insoluble phosphorus

表2 不同碳源和氮源P1培養(yǎng)液有效磷含量Table 2 Available phosphorus contents in P1 medium with different carbon and nitrogen sources 單位：(mg·L-1)

2.3 培養(yǎng)液初始不同pH值對(duì)P1溶磷能力的影響

培養(yǎng)液初始pH的不同對(duì)P1培養(yǎng)液有效磷含量影響見(jiàn)表3。培養(yǎng)液初始pH不同P1培養(yǎng)液有效磷含量不同。培養(yǎng)液初始pH從4到7，隨著pH 的增加，P1培養(yǎng)液有效磷含量從358.44 mg·L-1顯著增加到558.08 mg·L-1；當(dāng)培養(yǎng)液pH超過(guò)7時(shí)，隨著pH的增加，培養(yǎng)液有效磷減少，培養(yǎng)液初始pH從7到增加到9，培養(yǎng)液有效磷含量從558.08 mg·L-1降低到508.39 mg·L-1。

2.4 培養(yǎng)液pH緩沖對(duì)P1生長(zhǎng)及溶磷能力的影響

通過(guò)0.1 mol·L-1的NaOH來(lái)調(diào)節(jié)P1培養(yǎng)液中的pH(+NaOH)，同時(shí)設(shè)置不調(diào)節(jié)pH 的對(duì)照(-NaOH)，-NaOH與+NaOH條件下不同培養(yǎng)時(shí)間P1培養(yǎng)液有效磷含量、菌液密度OD600、培養(yǎng)液pH的變化分別如圖1 A、1B、1C所示。

表3 培養(yǎng)液初始不同pH值下P1培養(yǎng)液有效磷含量

由圖1A可知，未調(diào)節(jié)pH處理P1培養(yǎng)液中有效磷含量從第1天到第6天呈增加的趨勢(shì)，含量從199.80 mg·L-1顯著增加到575.44 mg·L-1，在第7天培養(yǎng)液有效磷含量比第6天減少17.36 mg·L-1，為558.08 mg·L-1，減少量不顯著；通過(guò)0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH處理P1培養(yǎng)液有效磷含量在第1天到第4天呈增加的趨勢(shì)，含量從199.80 mg·L-1顯著增加到446.44 mg·L-1，從第4天到第7天，培養(yǎng)液中有效磷含量從446.44 mg·L-1顯著減少到171.06 mg·L-1。與不調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH處理相比，從第2天開(kāi)始，調(diào)節(jié)pH處理培養(yǎng)液有效磷的含量顯著降低，在第2天、3天、4天、5天、6天、7天，調(diào)節(jié)pH處理培養(yǎng)液有效磷含量分別比對(duì)照處理減少71.24、74.23、70.34、133.20、319.07、387.02 mg·L-1。培養(yǎng)液pH緩沖對(duì)P1溶磷能力影響顯著。

由圖1B可知，在第2天、4天、5天和6天調(diào)節(jié)pH處理P1培養(yǎng)液菌液密度(OD600)與未調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH處理相比差異不顯著，在第3天、7天兩者之間OD600值分別相差0.024和0.018， pH緩沖對(duì)P1生長(zhǎng)的影響較小。

由圖1C可知，未調(diào)節(jié)pH處理P1培養(yǎng)液中pH從第1天到第6天呈減小的趨勢(shì)，pH值從5.90顯著減少到3.57，在第7天培養(yǎng)液pH值比第6天增加了0.52，為4.09；通過(guò)0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH處理P1培養(yǎng)液pH在第1天到第3天呈減少的趨勢(shì)，pH值從5.90顯著減少到4.35，從第3天到第7天，pH呈增加的趨勢(shì)，pH值從4.35增加到6.38。未調(diào)節(jié)pH處理培養(yǎng)液pH在第1～6天逐漸減少，而調(diào)節(jié)pH處理培養(yǎng)液pH值僅在第1～3天減小，從第4天開(kāi)始pH值增加，調(diào)節(jié)pH處理對(duì)培養(yǎng)液pH的影響顯著。

-NaOH表示未調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH處理，+NaOH表示調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH處理，不同小寫(xiě)字母表示在P為0.05水平下的顯著性差異(P<0.05)-NaOH indicated that the pH of culture medium was not regulated, +NaOH indicated the pH of culture medium was regulated, and different lowercase letters showed significant differences (P< 0.05)圖1 -NaOH與+NaOH條件下不同培養(yǎng)時(shí)間P1培養(yǎng)液有效磷含量(A)、菌液密度OD600(B)、培養(yǎng)液pH(C)的變化Fig.1 Changes of available phosphorus contents (A), density of bacterial solution OD600(B) and medium pH(C) of P1 at different culture times under -NaOH and +NaOH conditions

3 討論與結(jié)論

溶磷細(xì)菌溶磷能力的大小是評(píng)價(jià)其應(yīng)用潛能的指標(biāo)之一，將溶磷細(xì)菌接種在含有難溶態(tài)磷酸鹽的培養(yǎng)液中，通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液有效磷含量反映在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下菌株溶磷能力的大小，進(jìn)而篩選高效溶磷菌株。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者一般以磷酸三鈣作為難溶態(tài)磷源，Guzel等[9]試驗(yàn)用溶磷細(xì)菌在磷酸三鈣培養(yǎng)液中有效磷含量為490.00 mg·L-1；蔡璐等[10]在百脈根根際篩選出一株高效溶磷細(xì)菌LC15，培養(yǎng)7 d后在磷酸三鈣培養(yǎng)液中的可溶性磷為400.49 mg·L-1；喬策策等[11]從玉米根際篩選出多株溶磷細(xì)菌，在以磷酸三鈣為唯一磷源的培養(yǎng)條件下溶磷量最高為487.67 mg·L-1；梅新蘭等[12]從石灰性土壤中分離出的溶磷細(xì)菌，其培養(yǎng)液有效磷含量在13.25～559.57 mg·L-1；張淑紅[13]篩選的101株溶磷細(xì)菌中培養(yǎng)液有效磷含量最高可達(dá)653.60 mg·L-1；本試驗(yàn)中假單胞菌P1在磷酸三鈣培養(yǎng)液中的有效磷含量為558.08 mg·L-1，且該菌株在磷酸鋁、磷酸鐵和磷礦粉培養(yǎng)液中溶磷量分別比對(duì)照處理顯著增加了2.73、3.62、4.94倍，P1不僅對(duì)磷酸三鈣具有較高的溶解能力，且對(duì)其他難溶態(tài)磷都有一定的溶解作用，是一株具有應(yīng)用潛力的高效溶磷菌株。

溶磷細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)基中不同碳源和氮源的利用不盡相同[14]，合適的碳源和氮源可以為其生長(zhǎng)提供所需要的物質(zhì)來(lái)源和能量來(lái)源，對(duì)溶磷能力產(chǎn)生影響。李海云等[15]在紅三葉草根際篩選的溶磷細(xì)菌以葡萄糖為碳源溶磷能力顯著高于其它碳源；黃達(dá)明等[16]從土壤作物根際篩選的伯克氏溶磷菌以葡萄糖為碳源、草酸銨為氮源溶磷能力最強(qiáng)；陳炫等[17]研究了從甘蔗根際篩選出的2株溶磷細(xì)菌，一株對(duì)乳糖和氯化銨的利用率最高，一株以葡萄糖和硝酸鉀為碳氮源溶磷能力最強(qiáng)；本試驗(yàn)中P1以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源培養(yǎng)液有效磷含量最高，為558.08 mg·L-1。P1以氨態(tài)氮為氮源培養(yǎng)液有效磷含量顯著高于以硝態(tài)氮為氮源，Scervino等[18]研究發(fā)現(xiàn)溶磷細(xì)菌在不同種類(lèi)的氮源下產(chǎn)生有機(jī)酸的種類(lèi)和含量不同，最終表現(xiàn)在溶磷能力上的差異。

研究溶磷細(xì)菌的最終目的在于應(yīng)用，由于土壤自身對(duì)酸堿的緩沖特性，將溶磷細(xì)菌施入土壤中，土壤pH基本不發(fā)生變化，因此有必要研究溶磷細(xì)菌對(duì)pH 緩沖的響應(yīng)。本試驗(yàn)通過(guò)調(diào)節(jié)P1培養(yǎng)液pH來(lái)模擬土壤對(duì)酸堿的緩沖特性。接種溶磷細(xì)菌培養(yǎng)液pH會(huì)下降[19]，本試驗(yàn)通過(guò)0.1 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH，P1培養(yǎng)液有效磷含量顯著低于未調(diào)節(jié)pH處理，pH緩沖對(duì)菌株溶磷能力有較大影響，這與虞偉斌等[20]、李娜等[21]研究結(jié)果一致。在第2天、3天調(diào)節(jié)pH處理培養(yǎng)液有效磷含量與未調(diào)節(jié)pH處理的差值分別為71.24、74.23 mg·L-1，遠(yuǎn)低于第5、6天的差值，在第7天的差值達(dá)到最大，為387.02 mg·L-1，說(shuō)明P1菌株在前3天對(duì)pH緩沖有較強(qiáng)的響應(yīng)能力，調(diào)節(jié)pH處理培養(yǎng)液pH的變化也說(shuō)明了這一觀點(diǎn)，調(diào)節(jié)pH處理P1培養(yǎng)液pH從第1天到第3天呈減少的趨勢(shì)，而第4天到第7天呈增加的趨勢(shì)。菌株在生長(zhǎng)前期具有較強(qiáng)緩沖能力是因?yàn)榕囵B(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，菌株生長(zhǎng)旺盛，產(chǎn)酸能力強(qiáng)，因此緩沖能力較強(qiáng)，在第7天，基本喪失了緩沖能力，因此為微生物生長(zhǎng)提供充足的生長(zhǎng)基質(zhì)，可以增強(qiáng)菌株對(duì)酸堿緩沖的響應(yīng)。