霍雯 李佳蜜 徐小萍 賴瑞聯(lián) 陳曉慧 林玉玲 陳裕坤 賴鐘雄

摘? 要：本研究以龍眼胚性愈傷組織為材料，根據(jù)龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用RACE-PCR和RT-PCR技術(shù)獲取龍眼DlICE1 cDNA全長序列，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析與低溫脅迫下表達(dá)分析。結(jié)果表明，龍眼DlICE1 cDNA全長為2327 bp，其中開放式閱讀框（ORF）序列長1614 bp，共編碼537個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，龍眼DlICE1編碼的蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定的弱酸性蛋白，不具有典型的信號(hào)肽，且不屬于分泌蛋白;亞細(xì)胞定位表明其位于細(xì)胞核內(nèi)，與甜橙的同源蛋白親緣關(guān)系最近;實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，龍眼DlICE1能夠有效響應(yīng)低溫脅迫，低溫誘導(dǎo)其表達(dá)量提高。研究結(jié)果顯示，龍眼DlICE1基因參與龍眼胚性愈傷組織抗寒過程。

關(guān)鍵詞：龍眼;胚性愈傷組織;DlICE1基因;基因克隆;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

中圖分類號(hào)：S667.2? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Cloning and Expression of Low Temperature Stress of DlICE1 in Dimocarpus longan Lour.

HUO Wen， LI Jiami*， XU Xiaoping， LAI Ruilian， CHEN Xiaohui， LIN Yuling， CHEN Yukun，

LAI Zhongxiong**

Institute of Horticultural Biotechnology， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 35002， China

Abstract： In this experiment， the embryogenic callus of longan were used as the materials， the cDNA sequence of DlICE1 was cloned from longan embryogenic callus by the method of RACE-PCR and RT-PCR， then it was analyzed by bioinformatical methods and expression analysis under low temperature stress. The full-length sequence of DlICE1 was 2327 bp， which contained an 1614 bp open reading frame encoded 537 amino acids. The bioinformatics analysis indicated that DlICE1 belonged to the unstable acidic protein， which didnt has a typical signal peptide and wasnt a secreted protein; subcellular localization indicated that it is located in the nucleus， which was closest to the homologous protein of sweet orange. The qRT-PCR results indicated that the longan DlICE1 could effectively respond to low temperature stress and induce increased expression at low temperature. In summary， the study suggests that the longan DlICE1 gene may be involved in the cold resistance in longan embryogenic callus.

Keywords： Dimocarpus longan Lour.; embryogenic callus; DlICE1 gene; gene cloning; real-time fluorescent quantitative PCR;

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.05.016

植物在生長發(fā)育過程中，不斷受到各種非生物脅迫而嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量、品質(zhì)以及生長發(fā)育。低溫是一類重要的非生物因子，可以使植物受到不同程度的傷害甚至死亡。很多植物在寒冷環(huán)境下長期生長逐漸進(jìn)化形成了一套感受和傳導(dǎo)寒冷信號(hào)的系統(tǒng)，并能夠產(chǎn)生一系列適應(yīng)寒冷環(huán)境的變化，以增強(qiáng)抗寒能力[1]。低溫誘導(dǎo)植物抗寒性提升的過程稱為冷馴化[2]，Weiser等[3]首次提出植物在冷馴化過程中基因表達(dá)發(fā)生改變的觀點(diǎn)。

CBF轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控信號(hào)路徑是目前為止研究最廣泛、最受認(rèn)可的非依賴于ABA途徑的轉(zhuǎn)錄因子之一。具體過程為ICE1（inducer of CBF expression 1）——CBF轉(zhuǎn)錄因子——CRT/DRE（C- repeat binding factor/dehydration-responsive element binding）基序——冷誘導(dǎo)基因COR（cold- regulated）表達(dá)——植物抗寒性提升。ICE1基因?qū)儆赽HLH基因家族，能編碼一種特定蛋白結(jié)合到CBF3基因啟動(dòng)子的MYC順式元件上，進(jìn)而誘導(dǎo)CBF3編碼CBF轉(zhuǎn)錄因子，CBF與COR基因的順式作用元件結(jié)合，促使COR下游基因表達(dá)，進(jìn)而提高植株抗寒能力[4]。故ICE1的過量表達(dá)可以使植物抗寒能力提高[5]。在低溫脅迫下，過表達(dá)水稻RsICE1可以使其下游冷調(diào)控基因OsD REBL和OsTPP1在轉(zhuǎn)錄水平上顯著上調(diào)，說明RsICE1參與了CBF/DREB1冷調(diào)控信號(hào)網(wǎng)絡(luò)[6]。王意程等[7]發(fā)現(xiàn)低溫處理有利于蘋果愈傷組織花青苷的累積;低溫可以誘導(dǎo)蘋果愈傷組織冷信號(hào)基因MdICE1以及花青苷合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表達(dá)。

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是無患子科（Sapindaceae）龍眼屬（Dimocarpus）植物，屬于亞熱帶果樹，喜溫懼冷，年均適應(yīng)生長的溫度為20～22 ℃。溫度是影響龍眼生長、結(jié)實(shí)的重要因素，對(duì)其產(chǎn)量和品質(zhì)均會(huì)造成不利影響。因此，研究龍眼抗寒相關(guān)基因，有助于進(jìn)一步探討龍眼抗寒機(jī)理的相關(guān)問題，對(duì)提高龍眼產(chǎn)量、品質(zhì)有著重要意義。本研究以龍眼‘紅核子胚性愈傷組織及其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為材料和基礎(chǔ)，對(duì)DlICE1基因進(jìn)行克隆以及生物信息學(xué)分析，同時(shí)采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同溫度處理下DlICE1的表達(dá)情況，以期為龍眼抗寒機(jī)制的后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供的‘紅核子品種龍眼胚性愈傷組織（LC2細(xì)胞系）[8]。龍眼胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GenBank登錄號(hào)為SRA059205。

1.2? 方法

1.2.1? 材料處理? 將生長狀態(tài)良好的龍眼胚性愈傷組織置于不同溫度條件下暗培養(yǎng)24 h，設(shè)置的溫度梯度為0、4、8、12、16、20、24、28、32、36 ℃。暗培養(yǎng)完成后將材料放入液氮中冷凍15 min，隨后放入?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 總RNA提取及cDNA第一鏈合成? 采用Tripure法提取龍眼胚性愈傷組織總RNA，經(jīng)超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及吸光值（OD值），以A260/A280下OD值在1.8～2.0之間的測(cè)定結(jié)果為宜;采用SMART RACE試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈用于基因克隆;采用TaKaRa公司提供的熒光定量試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。

1.2.3? 引物設(shè)計(jì)? 從龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中查找、提取DlICE1已有的部分轉(zhuǎn)錄組序列（1599 bp），將其序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST，與其他物種進(jìn)行同源性對(duì)比。下載DlICE1基因同源性較高的幾個(gè)序列，如甜橙（Citrus sinensis）、楊樹（Populus trichocarpa）、胡楊（Populus euphratica）等，進(jìn)行DNAMAN同源對(duì)比，參考PCR引物設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用DNAMAN 6.0軟件設(shè)計(jì)3′RACE、5′RACE及全長驗(yàn)證引物，同時(shí)根據(jù)全長驗(yàn)證獲得序列結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物（表1），并將引物序列發(fā)送至北京六合華大基因有限公司進(jìn)行引物合成。

1.2.4? 目的基因的擴(kuò)增? 以逆轉(zhuǎn)錄的龍眼cDNA為模板，將酶、通用引物、設(shè)計(jì)的RACE引物和無菌水同時(shí)加入PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。參照林玉玲[9]的試驗(yàn)方法，將獲得的PCR產(chǎn)物目的片段用1%凝膠電泳鑒定條帶是否為目的片段，切割目的片段，進(jìn)行膠回收，PMD18-T載體進(jìn)行目的片段的連接，隨后在目的片段連接產(chǎn)物中加入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)化;將轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物進(jìn)行涂板，使其在含LB加Amp的培養(yǎng)板上培養(yǎng)12 h，隨后進(jìn)行挑菌，挑取多個(gè)單克隆，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，經(jīng)凝膠電泳驗(yàn)證，將陽性克隆子發(fā)送給上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.5? 生物信息學(xué)分析? 對(duì)克隆得到的基因序列使用DNAMAN獲得對(duì)應(yīng)氨基酸序列。采用ExPASy對(duì)DlICE1蛋白進(jìn)行基本理化性質(zhì)分析;采用SignalP 4.0 Server進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè);采用Prot Comp進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析;采用TMHMM分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域;采用NCBI-Protein Tools進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);采用NetPhos 2.0 Server進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)與其他功能位點(diǎn)預(yù)測(cè);利用COILS Server預(yù)測(cè)卷曲結(jié)構(gòu);利用Jpred3預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu);利用SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu);采用MEGA 6.0進(jìn)行同源性和分子系統(tǒng)進(jìn)化樹分析;使用MEGA 6.0將以上序列載入，采用采用最小鄰近法，設(shè)置Bootstrap為1000進(jìn)行分子同源系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析? 按照趙雙宜等[10]建立的方法分別提取不同溫度處理后的龍眼胚性愈傷組織總RNA并編號(hào)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，采用PrimeScript? RT Reagent Kit（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)參照Lin等[11-12]的步驟方法進(jìn)行，以龍眼EIF4a、EF-la和FSD作為內(nèi)參基因，采用羅氏LightCyclers? 480和SYBR? Prumix EX Taq? Ⅱ?qū)Σ煌瑴囟忍幚硐慢堁跠lICE1基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次。最后按照Livak[13]等的方法進(jìn)行定量計(jì)算，并通過Excel軟件對(duì)Cp值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與圖標(biāo)制作，采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)顯著性差異分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 龍眼DlICE1 cDNA全長序列獲得

以龍眼‘紅核子胚性愈傷組織為材料提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，采用RACE-PCR技術(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到兩條目的條帶，5′-RACE和3′-RACE所得片段長度分別約為500 bp和400 bp，與目的片段大小一致，產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示。

拼接后進(jìn)行全長驗(yàn)證，獲得龍眼DlICE1 cDNA序列全長為2327 bp，其中ORF區(qū)域長度為1614 bp，編碼537個(gè)氨基酸。將所得cDNA序列在NCBI上進(jìn)行在線BLAST同源性比對(duì)，結(jié)果顯示該序列與其他物種的DlICE1基因同源性均較高，其中與甜橙和河岸葡萄的ICE1同源性最高，其相似率都高達(dá)82%，試驗(yàn)結(jié)果可確認(rèn)所得序列為龍眼DlICE1基因的序列。運(yùn)用DNAMAN獲取ORF序列和氨基酸序列如圖2所示。

隨著近期龍眼基因組的公布[28] ，人類對(duì)龍眼的認(rèn)識(shí)取得突破性進(jìn)展，以后的科研試驗(yàn)可以從基因組水平上對(duì)龍眼的生長發(fā)育和進(jìn)化起源等重大問題入手，有利于新基因的發(fā)現(xiàn)與物種的改良等。在此研究基礎(chǔ)上，結(jié)合龍眼基因組數(shù)據(jù)的運(yùn)用，研究ICE1基因與其他相關(guān)基因在龍眼抗寒過程中的相互作用以及培育龍眼抗寒新品種有了新方向。

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