韓利峰，歐陽惠枝，張 雪，林亞娟，徐 偉，王曉穎

（福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122）

聚合物膠束（polymeric micelles，PMs）由兩親性高分子聚合物在水性環(huán)境中自組裝形成，其由親水性外殼和疏水性內(nèi)核組成且具有納米級粒徑結(jié)構(gòu)的載體［1-2］，能將疏水性藥物包載于其疏水內(nèi)核中，以增加水難溶性藥物的溶解度［3］。阿霉素（DOX）又稱多柔比星，通過插入DNA雙鏈結(jié)構(gòu)及抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ（TOP2）的功能，破壞DNA結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生細胞毒性作用［4］。但其溶解度低且無靶向性，易被糖蛋白外排引起多藥耐藥性，并且在臨床應用中易引發(fā)嚴重的毒副反應［5-6］。本課題組前期以維生素E聚乙二醇琥珀酸酯（TPGS）、羧甲基殼聚糖（CMCS）、甘草次酸（GA）和大黃酸（R）為原料，分別合成了TPGS-甘草次酸偶聯(lián)物（TG偶聯(lián)物）和TPGS修飾的羧甲基殼聚糖-大黃酸偶聯(lián)物（TCR偶聯(lián)物），本研究以TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物的混合物（TCR-TG）作為載體材料，制備載DOX的納米膠束（DOX／TCR-TG膠束），并進行了制備工藝優(yōu)化，為克服DOX臨床應用缺陷尋找解決辦法。

1 實驗材料

1.1 試劑與材料 TG偶聯(lián)物、TCR偶聯(lián)物（自制）；鹽酸阿霉素（DOX·HCl，大連美倫生物技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純）、葡萄糖（分析純）、甘露醇（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；MWCO 14000透析袋（上海綠鳥科技發(fā)展有限公司）。

1.2 儀器 NICOMPTM 380ZLS動態(tài)激光粒徑測定儀（美國Santa Bbarbara公司）；MS105DU十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京譜析通用儀器有限責任公司）；JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；ALPHA1-2 LD冷凍干燥機（德國Christ公司）。

2 方 法

2.1 DOX含量測定方法的建立 采用紫外-分光光度法對DOX／TCR-TG膠束中DOX的含量進行測定。

2.1.1 檢測波長的確定 分別取DOX·HCl、TPGS、GA和R適量，用甲醇溶解稀釋至合適濃度，在波長200～800 nm范圍內(nèi)進行掃描，確定DOX含量測定的檢測波長。

2.1.2 線性關(guān)系考察 精密稱取2 mg的DOX·HCl，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得0.2 mg／mL的DOX儲備液，將此溶液稀釋為 10、15、20、25、30 和 40 μg／mL的系列濃度，以甲醇為空白溶液，在檢測波長處測定其吸光度值，以吸光度A對濃度C（μg／mL）進行線性回歸。

2.1.3 精密度試驗 取 15、20、40 μg／mL 的 DOX·HCl溶液，以甲醇為空白溶液，測定其吸光度值，計算RSD值。

2.1.4 回收率試驗 精密稱取TCR-TG載體材料6 mg，用1 mL水溶解，取100 μL置于5 mL容量瓶中，加入 0.2 mg／mL DOX·HCl儲備液，甲醇稀釋至刻度，分別配制成15、20、40 μg／mL 的 DOX·HCl溶液，每個濃度3份，在檢測波長處測定吸光度值，計算回收率。

2.2 載藥膠束制備及工藝考察

2.2.1 DOX·HCl脫鹽 精密稱取適量 DOX·HCl，用適量DMSO溶解后，磁力攪拌下加入三乙胺（DOX·HCl∶TEA＝1∶3，n／n），攪拌過夜，即得脫鹽后 30 mg／mL DOX的DMSO溶液。

2.2.2 DOX／TCR-TG膠束制備 采用透析法制備，稱取TCR偶聯(lián)物和TG偶聯(lián)物的混合載體材料18 mg，加超純水3 mL，冰水浴探頭超聲10 min，緩慢滴加濃度為30 mg／mL DOX的DMSO溶液352.9 μL到TCR-TG混合載體溶液中，劇烈攪拌20 min后，冰水浴探頭超聲30 min，置透析袋中，蒸餾水為透析介質(zhì)，透析12 h。結(jié)束透析后，冰水浴探頭超聲20 min，用0.8 μm微孔濾膜過濾，冷凍干燥即得DOX／TCR-TG膠束。

2.2.3 TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物混合比例考察 按照 TG 偶聯(lián)物與 TCR 偶聯(lián)物質(zhì)量比為 3∶1、2∶1、1∶1、1∶2 和 1∶3 稱取混合偶聯(lián)物共 18 mg，按照“2.2.2”項下方法制備DOX／TCR-TG膠束，滴加400 μL DOX的DMSO溶液（30 mg／mL），考察TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物的不同混合比例對TCR-TG混合載體載藥的影響。

2.2.4 藥物與載體的質(zhì)量比（藥載比，m／m）的考察稱取 “2.2.3”項下篩選得到的最佳混合比例載體材料，按照“2.2.2”項下方法，改變DOX的質(zhì)量來考察藥載比為 1∶1、1∶1.3、1∶1.5、1∶1.7 和 1∶2 時，對載藥的影響。

2.3 DOX／TCR-TG膠束凍干制劑的制備 采用冷凍干燥技術(shù)將膠束凍干成固體，以利于膠束長期儲存。以載藥膠束凍干后外觀、再分散性、粒徑及分布、載藥量和包封率為評價指標，對其凍干制劑進行研究。

2.3.1 載藥膠束凍干制劑的制備 以“2.2”項下篩選的最佳比例按透析法制備DOX／TCR-TG膠束。結(jié)束透析后，冰水浴探頭超聲20 min，加入適量凍干保護劑，用0.8 μm濾膜過濾，冷凍干燥即得。

2.3.2 凍干保護劑考察 以甘露醇和葡萄糖為凍干保護劑，其用量均為0.1%、0.2%和 0.4%（m／v），按“2.3.1”項下方法制備，考察上述凍干保護劑對DOX／TCR-TG膠束的外觀、再分散性、粒徑及分布、載藥量和包封率的影響。

2.4 載藥量和包封率的測定 采用紫外-可見分光光度法測定DOX／TCR-TG膠束的載藥量（drug loading capacity，DL）及其包封率（entrapment efficiency，EE）。精密稱取 4 mg DOX／TCR-TG 膠束，加2 mL純水溶解，取250 μL用甲醇稀釋至5 mL容量瓶，按“2.1”項下方法測定DOX吸光度值，并計算DOX的濃度，根據(jù)下列公式計算DOX／TCR-TG膠束的DL和EE。

上式中，m1為載入膠束中的DOX的量，m2為DOX的投藥量，m為DOX／TCR-TG膠束的質(zhì)量。

2.5 DOX／TCR-TG膠束的粒徑及分布 稱取4 mg DOX／TCR-TG膠束，冰水浴探頭超聲10 min，配制成1 mg／mL的膠束水溶液，用0.8 μm濾膜過濾，常溫下用激光粒度儀（DLS）測定膠束的粒徑及分布。

2.6 DOX／TCR-TG膠束的形態(tài)學研究 使用透射電子顯微鏡（TEM）觀察載藥納米膠束的形貌。取適量DOX／TCR-TG膠束溶液，滴于銅網(wǎng)上，用濾紙吸去多余的溶液，2%的磷鎢酸溶液負染，室溫干燥，于透射電鏡下觀察拍照。

3 結(jié) 果

3.1 DOX含量測定方法的建立

3.1.1 DOX含量檢測波長的確定 對DOX·HCl、TPGS、GA和R進行紫外全波長掃描，以甲醇為空白對照，確定在498 nm為DOX的測定波長，在該波長下其他各成分對DOX測定無干擾，見圖1。

3.1.2 DOX標準曲線及線性范圍 吸光度A對濃度C（μg／mL）進行線性回歸，繪制標準曲線。線性回歸方程為 A＝0.020 7C－0.022 2（r＝0.999 5），在 15～40 μg／mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度和回收率 高、中和低3個濃度的精密度與回收率均符合方法學要求，其中日內(nèi)精密度RSD值分別為0.72%、0.39%和0.73%；日間精密度分別為1.06%、1.42%和1.18%；回收率分別是（100.11±0.98）%、（101.98±2.61）%和（99.70±1.91）%。

3.2 TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物混合比例的影響TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物混合比例對包載DOX的影響，見表1。TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物混合比為2∶1、1∶1 和 1∶2 時，載藥量和包封率均較其他比例的高，粒徑相差不大，且混合比為1∶2時，Zeta電位值為（-20.07±2.76）mV，穩(wěn)定性更好，故確定 TG 偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物的混合投料比為1∶2。

表1 TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物比例對載藥能力的影響

表1 TG偶聯(lián)物與TCR偶聯(lián)物比例對載藥能力的影響

TG∶TCR／（m ／m）3∶1 2∶1 1∶1 1∶2 1∶3 1∶4粒徑／nm 118.97±2.16 142.67±20.39 158.70±25.51 144.37±33.80 145.40±23.51 271.97±29.12粒徑分布／PDI 0.15±0.03 0.14±0.05 0.14±0.02 0.18±0.01 0.21±0.03 0.16±0.10 Zeta 電位 ／mV-4.23±5.39-14.03±1.63-15.87±4.51-20.07±2.76-16.86±6.42-15.05±1.75 DL／%22.54±2.77 25.77±1.63 25.68±1.37 26.45±1.36 23.48±1.43 20.53±3.36 EE／%42.35±4.90 53.34±1.29 53.54±7.39 56.12±4.44 50.73±4.50 41.14±7.28

3.3 藥載比的影響 藥物與載體材料的投料比對混合聚合物膠束包載DOX能力的影響見表2。由表可知，當藥載比為1∶1時，載藥量最高，但其粒徑較大，Zeta電位絕對值最小，故穩(wěn)定性較差。而藥載比為 1∶1.7 時，其粒徑為（121.3±8.49）nm，且包封率達到（62.59±6.39）%，故綜合考慮粒徑及分布、Zeta電位、載藥量和包封率，最終確定藥物與載體的投料比為 1∶1.7。

表2 藥載比對載藥能力的影響

表2 藥載比對載藥能力的影響

DOX∶TCR-TG／（m／m）1∶1 1∶3 1∶1.5 1∶1.7 1∶2粒徑／nm 140.53±6.43 132.27±10.70 133.43±37.25 121.30±8.49 116.20±5.81粒徑分布／PDI 0.19±0.02 0.17±0.01 0.15±0.02 0.21±0.02 0.16±0.02 Zeta 電位 ／mV-17.39±1.23-20.63±2.59-20.33±0.8-21.90±0.2-20.80±2.6 DL／%33.26±2.59 29.06±1.13 27.94±0.69 31.22±3.19 23.59±1.15 EE／%47.46±2.58 51.11±1.55 54.85±1.95 62.59±6.39 55.61±4.51

3.4 不同凍干保護劑的影響 凍干保護劑對DOX／TCR-TG膠束凍干制劑研究結(jié)果見表3。DOX／TCRTG凍干制劑均具有良好的復溶性，復溶后均為紅色澄清透明液體。綜合考慮各考察指標，最終選用0.1%甘露醇為凍干保護劑，雖然粒徑稍大，但其分布均勻，包封率、載藥量最好。

表3 不同凍干保護劑的影響

表3 不同凍干保護劑的影響

凍干保護劑無保護劑0.1%甘露醇0.2%甘露醇0.4%甘露醇0.1%葡萄糖0.2%葡萄糖0.4%葡萄糖粒徑／nm 133.77±9.15 160.57±21.72 137.97±7.15 136.70±1.22 137.57±1.27 128.20±2.43 131.17±6.37粒徑分布／PDI 0.14±0.01 0.11±0.04 0.11±0.01 0.09±0.03 0.10±0.03 0.12±0.01 0.10±0.02 Zeta 電位 ／mV-18.41±2.64-17.65±1.45-12.69±3.03-16.19±7.52-13.72±2.83-14.59±5.93-17.17±4.61 DL／%30.05±6.61 30.70±0.56 26.86±1.17 19.74±1.57 29.36±1.51 28.43±1.17 20.30±2.87 EE／%45.40±0.11 73.08±3.65 53.68±3.78 72.88±5.55 69.71±4.67 69.14±4.93 54.52±6.31

3.5 DOX／TCR-TG膠束粒徑及形態(tài)學 DOX／TCRTG載藥膠束的粒徑分布如圖2所示，TEM形態(tài)學特征圖如圖3所示，由圖可見膠束粒徑分布均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)圓整。

4 討 論

透析法是將兩親性聚合物和藥物共同溶解于與水互溶的混合溶劑中，然后倒入透析袋中，置于水中透析除去混合溶劑，待溶劑除去完全，透析袋中便是包載藥物的膠束水溶液。透析法具有操作簡單、載藥效率高等特點，故本研究采用透析法制DOX／TCR-TG混合膠束。

通過對DOX／TCR-TG膠束的粒徑及分布、載藥量和包封率的綜合評價，最終確定TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物的最佳混合比例為1:2，DOX與TCR-TG載體的最佳藥載比為1:1.7，所制備載藥膠束粒徑較小，分布均勻，載藥量和包封率均較高，為后續(xù)深入研究該膠束遞藥系統(tǒng)奠定了良好的基礎(chǔ)。

本文所用載體材料TG偶聯(lián)物中甘草次酸具有肝靶向性，有利于引導DOX到達肝部治療肝癌；TG偶聯(lián)物和TCR偶聯(lián)物中的TPGS具有P-糖蛋白抑制功能，有利于克服DOX在應用中多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生；并且該兩種偶聯(lián)物混合后對DOX有良好的增溶作用，克服了DOX水溶性差的缺點。綜上，該混合膠束對DOX的包載和遞送作用具有較好的臨床應用前景，其體內(nèi)、外研究將進一步深入研究。