馮黎霞 何瑞芳 左然玲

關(guān)鍵詞：菠菜潛隱病毒;RT-PCR;菠菜;檢測

菠菜（Spinacia oleracea L.）是中國普遍栽培的蔬菜之一。菠菜潛隱病毒（Spinach latent virus，SpLV）是菠菜上重要的種傳病毒病害，曾用名為GE36，屬雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）等軸不穩(wěn)環(huán)斑病毒屬（Ilarvirus）。SpLV基因組結(jié)構(gòu)為單鏈正義五分體RNA，必需有3個(gè)大的組分（RNA1、RNA2、RNA3）及1～2個(gè)小的組分（RNA4、RNA5）或外殼蛋白一起才能完成侵染過程，主要侵染菠菜、番茄、藜麥、甜菜、雞冠花、黃瓜、克利夫蘭煙、黏毛煙、黃花煙、菜豆等，SpLV存活期長，至少可以在菠菜、藜麥種子中存活5年，遠(yuǎn)距離傳播主要依靠種子[1-2]。SpLV目前主要分布在丹麥、芬蘭、瑞典、挪威、南斯拉夫、新西蘭、克羅地亞、美國、日本等國家或地區(qū)[3-6]，我國沒有分布，也沒有截獲的任何報(bào)道。

本研究以進(jìn)境的菠菜種子為材料，應(yīng)用一步法逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)對SpLV進(jìn)行檢測鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料 受檢材料為2019年3月廣州海關(guān)檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心植檢室接收的進(jìn)境的菠菜種子。

1.1.2 試劑 核酸提取試劑TRIzol為Invitrogen公司產(chǎn)品;RT-PCR一步法試劑盒（PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit）、DNA Marker 2000購自大連TaKaRa公司。

1.1.3 引物 SpLV RNA1組分引物SpLV-RNA1-F/R序列：5′-TGTGGATTGGTGGTTGGA-3′，5′-CTTGCTTGAGGAGAGATGTTG-3′; RNA2組分引物SpLV-RNA2-F/R序列：5′-GAACCACCGAAACCGAAA-3′，5′-CCACCTCAACACCAGTCATAG-3′;RNA3組分引物SpLV-RNA3-F/R序列：5′-GCCTTCATCTTTGCCTTTG-3′，5′-CATTTCATCTGCGGTGGT-3′;預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為722、436、213 bp[4]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 樣品RNA的提取 隨機(jī)取樣并稱取50 g菠菜種子，研磨成粉末狀，稱取0.1 g移入滅菌的 2 mL 離心管中，加入1 mL的TRIzol試劑，劇烈振蕩搖勻，室溫靜置3 min;4 ℃、12 000 g離心10 min，取上清;加入200 μL三氯甲烷，上下顛倒混勻，室溫靜置3 min;4 ℃、12 000 g離心10 min，取上層水相;加等體積的異丙醇，顛倒混勻;4 ℃、12 000 g離心10 min，棄上清;加1 mL 75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、7 500 g離心 5 min，棄乙醇;沉淀于室溫下充分干燥后，溶于 50 μL 無RNA酶的ddH2O，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增 利用一步法RT-PCR試劑盒，針對SpLV的3個(gè)不同組分進(jìn)行RT-PCR一步法檢測，擴(kuò)增體系如下：PrimeScript One Step Buffer 25 μL，上下游引物各（20 μmol/L）1 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 2 μL，最后加RNase Free H2O至總體積為50 μL。反應(yīng)參數(shù)如下：50 ℃ 30 min;94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的檢測 RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結(jié)果。PCR產(chǎn)物由廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司純化并測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果與分析

利用引物對SpLV-RNA1-F/R、SpLV-RNA2-F/R、SpLV-RNA3-F/R對菠菜種子中SpLV的3個(gè)組分進(jìn)行一步法 RT-PCR檢測鑒定。結(jié)果顯示，從待檢測樣品中分別擴(kuò)增出3條特異性條帶，大小分別為722、436、213 bp，與預(yù)期片段大小相符（圖1），初步判斷待測樣品可能感染了SpLV， 在底物和引物濃度完全一致的情況下，獲得的RNA2組分?jǐn)U增產(chǎn)物的濃度明顯比RNA1、RNA3高。

2.2 序列分析

產(chǎn)物核苷酸序列測序拼接后可知，擴(kuò)增的目的片段大小分別為722、436、213 bp，在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行核酸序列Blast。結(jié)果表明，其中722 bp核苷酸片段與分離物SRP059420 RNA1組分（GenBank登錄號：KY695012.1）核苷酸序列的同源性為99.72%，與美國分離物（GenBank登錄號：U93192.1）核苷酸序列的同源性為99.58%，與番茄分離物（GenBank登錄號：DQ457000.1）核苷酸序列的同源性為9787%;436 bp核苷酸片段與分離物SRP059420 RNA2組分（GenBank登錄號：KY695013.1）核苷酸序列的同源性為100.00%，與美國分離物（GenBank登錄號：U93193.1）核苷酸序列的同源性為9977%;213 bp核苷酸片段與分離物SRP059420（KY695014.1）和菠菜分離物（GenBank登錄號：U93194.1）RNA3組分核苷酸序列同源性均為10000%。進(jìn)一步驗(yàn)證得出，3個(gè)不同大小的 RT-PCR產(chǎn)物均為SpLV的特異性產(chǎn)物。

3 結(jié)論與討論

菠菜潛隱病毒為五分體病毒，本研究為確定 RT-PCR擴(kuò)增到的產(chǎn)物為目標(biāo)病毒，利用特異性引物對SpLV侵染所需要的3個(gè)組分（RNA1、RNA2、RNA3）分別進(jìn)行擴(kuò)增，在擴(kuò)增條件完全一致的情況下，引物對SpLV-RNA2-F/R擴(kuò)增的RNA2組分產(chǎn)物量最大，條帶清晰，更適合日常SpLV的檢測鑒定。

菠菜種子被植物病毒感染后，種子的品質(zhì)下降，發(fā)芽率降低，芽苗生長勢減弱，更易被其他病害侵染。SpLV隨種子傳毒的效率非常高，在藜麥和菠菜上種傳率超過50%，在煙葉上超過90%[1]。韓國曾多次從輸韓菠菜種子上截獲SpLV，并在2007年把該病毒列入輸韓植物和植物產(chǎn)品檢疫性有害生物名錄。此次在菠菜種子上截獲菠菜潛隱病毒，保護(hù)了我國蔬菜種植業(yè)的安全，為防止該病毒的傳入，廣州海關(guān)對該批菠菜種子作退運(yùn)處理。但是由于有害生物分布的非均勻性以及種子帶毒率的非一致性，入境第一口岸能否檢出有害生物以便識別風(fēng)險(xiǎn)，這是一個(gè)概率事件，而不是百分之百能夠檢出有害生物的必然事件。因此國外預(yù)檢及入境后的監(jiān)管、監(jiān)測及跟蹤檢疫更為重要。

參考文獻(xiàn)：

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