曾 瑤，陸安靜，譚道鵬，秦 琳，杜藝玫， 楊夢(mèng)婷，姜 媛， 魯艷柳，何芋岐,

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

石斛是傳統(tǒng)名貴中藥材，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷代本草及《中國(guó)藥典》均有收錄，其藥材來源為蘭科石斛屬多種植物，如金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)、鼓槌石斛(D.chrysotoxumLidl.)及流蘇石斛(D.fimbriatumHook)等同屬近似種。并且自2010年版《中國(guó)藥典》起將鐵皮石斛(D.officinaleKimura et Migo)單列[1]。石斛類藥材的基源復(fù)雜主要是由于石斛類植物的自然環(huán)境繁育能力較弱，加之人類長(zhǎng)期的采挖，自然界中主流藥用石斛(如金釵石斛、鐵皮石斛等)野生品已經(jīng)瀕臨滅絕；另外，石斛屬形態(tài)近似種繁多，分布廣泛，為地方用藥就地取材代用提供了方便。但自2004年國(guó)家“十五”科技攻關(guān)項(xiàng)目-名貴珍稀藥用植物“鐵皮石斛”的工廠化高產(chǎn)栽培技術(shù)獲得重大突破后，帶動(dòng)了全國(guó)范圍內(nèi)石斛類藥材，尤其是鐵皮石斛的種植熱潮。并且種植方式也由最初的大棚栽培發(fā)展為：大棚栽培[2]、附石栽培[3]和附樹栽培[4]等三種主要栽培模式共存，大棚栽培是采用溫室以樹皮或木屑作為主要栽培基質(zhì)的工業(yè)化程度最高、產(chǎn)量最高、最為成熟的鐵皮石斛栽培模式；附石栽培是仿照野生鐵皮石斛自然生長(zhǎng)條件，以苔蘚作為生長(zhǎng)基質(zhì)，附生在巖石上的一種栽培方式；附樹栽培是仿照野生環(huán)境，將鐵皮石斛捆綁在附生樹種上的栽培方式。歷代本草認(rèn)為石斛的品質(zhì)與生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，自古有“石斛”和“木斛”之分，附石生長(zhǎng)者稱之為“石斛”，附樹生長(zhǎng)者稱之為“木斛”，并且認(rèn)為“木斛”品質(zhì)較差，不堪用[5]。2015版《中國(guó)藥典》以多糖含量作為鐵皮石斛藥材主要質(zhì)量控制指標(biāo)，對(duì)于不同栽培方式中鐵皮石斛多糖含量已有部分報(bào)道，如：郭英英等[6]考察了浙江雁蕩山地區(qū)不同附生樹種對(duì)鐵皮石斛中多糖的影響，結(jié)果表明不同附生樹種鐵皮石斛多糖含量具有顯著差異；張寧南等[7]對(duì)比研究了花盆基質(zhì)、水泥樁、竹片及4種附生樹種栽培鐵皮石斛中的多糖含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)附生在檀香、降香檀香、馬占相思樹上的鐵皮石斛石斛多糖含量較高。以上報(bào)道說明不同栽培環(huán)境下鐵皮石斛多糖含量存在一定差異，但自古認(rèn)為附石生長(zhǎng)的石斛品質(zhì)最良，但與其它栽培方式多糖含量的對(duì)比研究未見報(bào)道。

貴州是最早開展石斛人工栽培的省份之一，貴州省高度重視石斛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，將其列為農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)之一，先后出臺(tái)了《貴州省農(nóng)村產(chǎn)業(yè)革命石斛產(chǎn)業(yè)發(fā)展推進(jìn)方案(2019-2021年)》、《發(fā)展石斛產(chǎn)業(yè)助推脫貧攻堅(jiān)三年行動(dòng)方案》等實(shí)施方案，目標(biāo)將推動(dòng)貴州省石斛種植規(guī)模達(dá)到20萬(wàn)畝，2018年底已完成種植面積11.3萬(wàn)畝，主要以附樹及附石仿野生栽培為主。因此，本文以貴州大棚、附石及附樹三種栽培模式鐵皮石斛為對(duì)象，對(duì)比分析其多糖含量，為今后鐵皮石斛的栽培及質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 鐵皮石斛樣品于2018年10月采自貴州省興義市安龍縣西城秀樹農(nóng)林有限責(zé)任公司、貴州首草健康發(fā)展有限公司鐵皮石斛種植基地2年生植株，經(jīng)鑒定為鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)。

表1 鐵皮石斛樣品來源

編號(hào)栽培方式/附生樹種海拔來源XYDO01～03大棚栽培低海拔首草健康XYDO04～12附石栽培高、中、低海拔首草健康XYDO13～21木荷Schimasuperba高、中、低海拔西城秀樹XYDO22～30板栗Castaneamollissima高、中海拔西城秀樹XYDO31～36青杠Quercusacutissima高、中、低海拔西城秀樹

1.2 儀器與試劑 Spectra Max Plus 384全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司);TD5A-WS多管架臺(tái)式離心機(jī)(上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：110833-200904，中國(guó)食品藥品檢定院);無水乙醇(批號(hào)：20190508，成都金山化學(xué)試劑有限公司);苯酚(批號(hào)：2014012202，成都科倫化工試劑廠);濃硫酸(批號(hào)：20130529，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為蒸餾水。

2 方法

2.1 樣品干燥 將采集的新鮮鐵皮石斛樣品去葉后，切段，置于50℃烘箱中烘干，粉碎，過三號(hào)篩，保存待用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 稱取無水葡萄糖對(duì)照品，制備為150 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成0、30、60、90、120、150 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取1 mL各系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照《中國(guó)藥典》(2015 版，一部)中鐵皮石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.002 8X+0.067 7，R2=0.999 5，結(jié)果表明葡萄糖濃度在0～150 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見圖1)。

2.3 多糖的提取及含量測(cè)定 參照《中國(guó)藥典》(2015 版，一部)中鐵皮石斛質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的多糖提取及含量測(cè)定方法，精密稱取鐵皮石斛樣本0.3 g，加200 mL水加熱回流2 h，離心取上清，精密取2 mL上清液加10 mL無水乙醇在4℃放置1 h，離心，棄去上清，加80%乙醇 8 mL洗滌沉淀，離心棄去上清，重復(fù)1次。將沉淀用熱水溶解，放冷定容至25 mL，即為待測(cè)樣本。取待測(cè)樣本加5%苯酚和濃硫酸進(jìn)行苯酚硫酸顯色反應(yīng)，測(cè)定各樣品吸光度值，并以標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及樣品配制濃度計(jì)算出鐵皮石斛樣品中的多糖含量。

圖1 無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)果

3.1 各栽培條件下鐵皮石斛多糖含量整體可視化分析 采用R語(yǔ)言，以多糖含量為縱坐標(biāo)，高、中、低三個(gè)海拔為橫坐標(biāo)，依36份鐵皮石斛樣品多糖含量分布在坐標(biāo)象限內(nèi)，觀察不同樣品多糖含量達(dá)標(biāo)情況(如圖2中黑線為《中國(guó)藥典》鐵皮石斛多糖含量25.0%標(biāo)準(zhǔn)限)，結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖含量受海拔因素影響明顯，低海拔多糖含量達(dá)標(biāo)率明顯高于中、高海拔。其中高海拔鐵皮石斛多糖含量最大值為42.10%、最小值為11.00%、平均值為21.83%；中海拔鐵皮石斛多糖含量最大值為60.00%、最小值為7.90%、平均值為27.28%；低海拔鐵皮石斛多糖含量最大值為57.40%、最小值18.50%、平均值為35.70%。

3.2 不同海拔條件下整體鐵皮石斛樣品多糖含量差異 根據(jù)整體可視化分析情況，進(jìn)一步對(duì)不同海拔條件下鐵皮石斛樣品的多糖含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖3所示，鐵皮石斛樣品中多糖含量與其生長(zhǎng)海拔成負(fù)相關(guān)，低海拔鐵皮石斛樣品中的多糖含量最高，且與高海拔樣品具有顯著性差異(T=0.0087，P<0.05)。

圖2 鐵皮石斛多糖含量整體可視化分析圖

圖3 不同海拔鐵皮石斛多糖含量對(duì)比

3.3 相同附生方式內(nèi)不同海拔條件下的鐵皮石斛多糖含量差異 根據(jù)整體可視化分析情況，進(jìn)一步對(duì)比相同附生方式不同海拔條件下鐵皮石斛多糖含量，結(jié)果如圖4所示，附石栽培及附木荷樹栽培的低海拔鐵皮石斛多糖含量最高，與整體可視化結(jié)果一致。附青杠樹低海拔鐵皮石斛多糖含量與中海拔無顯著性差異，但高于高海拔樣品多糖含量。由于大棚栽培基地全部位于山下低海拔地帶，板栗樹在當(dāng)?shù)氐秃０螞]有分布，不具可對(duì)比條件。

3.4 不同栽培方式鐵皮石斛多糖含量的差異 以附石、附樹、大棚3種栽培方式鐵皮石斛多糖平均含量對(duì)比分析不同栽培方式對(duì)鐵皮石斛多糖含量的影響，結(jié)果如圖5所示，各栽培方式鐵皮石斛多糖含量依次為大棚>附樹>附石，不同附生樹種間鐵皮石斛多糖含量依次為板栗>木荷>青杠。

圖4 各附生方式內(nèi)不同海拔鐵皮石斛多糖含量對(duì)比

圖5 不同栽培方式及附生樹種鐵皮石斛多糖含量差異

4 討論

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)為名貴中藥材“石斛”的來源之一，具有益胃生津，滋陰清熱的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石斛具有抗腫瘤、改善記憶力、增強(qiáng)免疫力、降血脂、抗氧化等多種藥理活性，其中多糖是其主要活性成分之一[8-11]。由于長(zhǎng)期采挖，野生鐵皮石斛已經(jīng)瀕危滅絕，目前市場(chǎng)上的鐵皮石斛藥材主要來源于大棚栽培、附石栽培和附樹栽培三種栽培方式產(chǎn)品。歷代本草認(rèn)為石斛的品質(zhì)與生長(zhǎng)環(huán)境密切相關(guān)，附石生長(zhǎng)者稱之為“石斛”，附樹生長(zhǎng)者稱之為“木斛”，且“生石上者良”，“木斛”品質(zhì)較差，不堪用[5]。可見，不同生長(zhǎng)方式的鐵皮石斛入藥現(xiàn)象歷來有之，并且古人對(duì)不同來源的鐵皮石斛藥效已有說明，但石斛“生石上者良”的論述尚未見有科學(xué)依據(jù)。2015年版《中國(guó)藥典》以多糖含量作為鐵皮石斛質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，因此，本文采用藥典方法對(duì)不同栽培方法鐵皮石斛中的多糖含量進(jìn)行了對(duì)比分析，分別考察了栽培方式、附生樹種、海拔等因素，對(duì)目前全國(guó)范圍內(nèi)缺乏統(tǒng)一的種植規(guī)范現(xiàn)狀下的鐵皮石斛藥用質(zhì)量控制及其規(guī)范化種植具有一定參考價(jià)值。

研究結(jié)果顯示：不同栽培條件下，鐵皮石斛多糖含量整體可視化分析結(jié)果顯示，鐵皮石斛多糖含量受海拔因素影響最為顯著，低海拔多糖含量顯著高于中、高海拔含量。說明鐵皮石斛仿野生種植中，海拔的因素不容忽視；再結(jié)合栽培方式，大棚栽培基地均位于山下低海拔地帶，大棚栽培鐵皮石斛多糖含量最高除受施肥管理影響外，可能還有海拔因素的影響。附石栽培鐵皮石斛多糖含量隨著海拔增高而降低與整體可視化結(jié)果一致，但其平均含量低于附樹及大棚栽培，分析主要由于附石栽培受氣候變化影響較大，及其寡營(yíng)養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。為提高鐵皮石斛多糖含量，有多種施肥栽培的報(bào)道，但根據(jù)傳統(tǒng)用藥經(jīng)驗(yàn)，附石生長(zhǎng)石斛的品質(zhì)最優(yōu)，而其多糖含量最低，說明在質(zhì)量達(dá)標(biāo)的前體下，沒必要一味的追求提高鐵皮石斛的多糖含量。