王 曉，賀 丹，李文婷，阿迪拉·斯依提，韓 蕊，董 穎△

(1. 北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科， 北京 100034； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科， 烏魯木齊 830011)

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升且有年輕化趨勢。近年我國每年新增病例近5萬例，死亡近1.8萬例[1]。臨床病理實踐中，內(nèi)膜癌一直被分為兩型(Ⅰ型和Ⅱ型)，絕大多數(shù)(80%～85%)為Ⅰ型癌，以內(nèi)膜樣腺癌(endome-trioid endometrial carcinoma, EEC)為代表，預(yù)后相對良好；Ⅱ型癌，即非子宮內(nèi)膜樣癌(non-endometrioid endometrial carcinoma, NEEC)，主要為漿液性癌和透明細胞癌，預(yù)后差。臨床實踐中仍有大約15%～20%的高級別子宮內(nèi)膜樣癌會術(shù)后復(fù)發(fā)，預(yù)后差，而部分早期的Ⅱ型內(nèi)膜癌，預(yù)后相對較好。近年來，腫瘤基因組圖譜中心(the cancer genome atlas, TCGA)基于高通量檢測及數(shù)據(jù)分析，提示子宮內(nèi)膜癌可分為4個分子分型[2]：(1)POLE基因超突變型，(2)微衛(wèi)星不穩(wěn)定高突變型，(3)低拷貝數(shù)型，(4)高拷貝數(shù)型。每個分子亞型都具有各自獨特的分子異常，其預(yù)后及潛在治療靶點不盡相同，腫瘤組織學(xué)類型也不一致。實際上，子宮內(nèi)膜癌是一組異質(zhì)性強的腫瘤，其本質(zhì)是腫瘤分子特征的差異性。

子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病有地域差異，不同人種的發(fā)病特點也不完全一致，美國的研究數(shù)據(jù)顯示，白人與黑人女性患病風(fēng)險接近，但黑人女性更易患Ⅱ型內(nèi)膜癌且晚期居多[3]。我們對近年新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜癌病例的分析顯示，漢族女性子宮內(nèi)膜癌病例遠高于維吾爾族(約5～6倍)，但新疆地區(qū)的人口組成中漢族與維吾爾族已接近持平。新疆腫瘤醫(yī)院是該地區(qū)唯一的腫瘤醫(yī)院，其收治的病例大致反映出該地區(qū)腫瘤發(fā)病的特點，當前對維吾爾族與漢族女性子宮內(nèi)膜癌的特點研究還缺乏對比分析。

微小RNA(microRNA，miRNA)是近年癌癥研究的熱點，它們是高度保守的非編碼小RNA，結(jié)合于相應(yīng)mRNA 3′端非翻譯區(qū)，抑制mRNA翻譯或促使其降解，在轉(zhuǎn)錄后沉默基因表達，參與胚胎發(fā)育、細胞增殖分化等重要生命活動。研究顯示，miRNA異常表達與腫瘤發(fā)病密切相關(guān)，子宮內(nèi)膜癌具有特征性miRNA表達譜，構(gòu)成其獨特復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中扮演重要角色[4]。

本研究采用Taqman低密度芯片和實時定量PCR技術(shù)篩選和檢測144例子宮內(nèi)膜癌miRNA表達特點，并對比分析其在維吾爾族與漢族女性子宮內(nèi)膜癌中的表達特點，闡述其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

收集北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科近年來漢族女性子宮內(nèi)膜癌石蠟組織82例(Ⅰ型癌53例，Ⅱ型癌29例)，新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院62例維吾爾族女性子宮內(nèi)膜癌(49例Ⅰ型癌，13例Ⅱ型癌)，分別以正常子宮內(nèi)膜石蠟組織作為對照。標本經(jīng)10%(體積分數(shù))中性緩沖甲醛液固定，石蠟包埋，材料保存良好。所有病例在手術(shù)前均未進行治療，由兩位病理醫(yī)師復(fù)閱切片，組織學(xué)分類參照2014版《WHO女性生殖系統(tǒng)腫瘤分類標準》[5]，并完善相關(guān)臨床病理資料。兩所醫(yī)院病理科的組織病理標本前期固定、自動脫水的流程類似。

1.2 RNA提取

采用RNeasy FFPE(德國Qiagen公司)試劑盒提取石蠟組織總RNA，將5 μm厚石蠟切片6～8張置于EP管中，按照說明書操作。采用Nanodrop ND-2000分光光度計檢測光密度值(D)，以評價提取產(chǎn)物中RNA的質(zhì)量及濃度。D260 nm/D280 nm≥1.8者進行后續(xù)表達譜和實時熒光定量PCR檢測。

1.3 miRNA表達譜分析

采用TaqMan低密度芯片(Taqman miRNA low-density array，TLDA)，對維吾爾族、漢族女性各1例漿液性癌以及各1例絕經(jīng)期內(nèi)膜組織為對照進行miRNA表達譜分析。芯片含A+B板，可以同時進行754條成熟人miRNA的檢測(美國Applied Biosystems公司)。首先用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將500 ng RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，引物采用Megaplex Primer Pools(含有低密度芯片中所有miRNA及內(nèi)參照的逆轉(zhuǎn)錄引物)，再將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA加入到TLDA中，然后應(yīng)用ABI-7900HT實時定量PCR儀分析，miRNA的表達情況使用SDS version 2.3 軟件(美國Applied Biosystems公司)分析。

1.4 實時定量PCR檢測

結(jié)合文獻從表達譜中篩選出5個miRNA(miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145)，在維吾爾族與漢族子宮內(nèi)膜癌石蠟組織中進一步驗證分析其表達特點。逆轉(zhuǎn)錄方法同上，用TaqMan單管MicroRNA試劑盒(美國Applied Biosystems公司)檢測并定量miRNA。以U6 小核RNA(small nuclearRNA, snRNA)作為內(nèi)參照，每管反應(yīng)重復(fù)3次，Ct值取平均值。腫瘤組織相對對照組織的差異倍數(shù)采用2-ΔΔCt法計算，ΔΔCt=ΔCt腫瘤組-ΔCt對照組=(Ct腫瘤組miRNA-Ct腫瘤組U6)-(Ct對照組miRNA-Ct對照組U6)。所有實時定量PCR檢測均在北京大學(xué)第一醫(yī)院病理科實驗室完成。

1.5 免疫組織化學(xué)染色

采用Dako EnVision免疫組織化學(xué)檢測試劑盒對4 μm石蠟組織切片進行免疫組織化學(xué)染色?？贵w為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNA methyltransferase 3B，DNMT3B)(52A1018，Abcam，體積比1 ∶250)。染色結(jié)果評估采用免疫反應(yīng)評分(immunoreactive score, IRS)系統(tǒng)[6]，將IRS≥6定義為DNMT3B過表達，IRS<6定義為DNMT3B表達正常。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0及Graphpad prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的連續(xù)變量采用平均值±標準誤表示，兩組間比較采用t檢驗；分類變量采用卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗，雙側(cè)P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 144例子宮內(nèi)膜癌臨床病理特點

本組144例子宮內(nèi)膜癌包括維吾爾族患者62例，漢族患者82例。兩民族之間子宮內(nèi)膜癌發(fā)病年齡、組織學(xué)類型、臨床分期等差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，但漢族女性子宮內(nèi)膜癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(27.5%)高于維吾爾族女性(9.8%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.040)。

維吾爾族中49例為EEC，13例為NEEC，患者年齡33～77歲，中位年齡55歲，其中48例行全子宮切除術(shù)，41例同時行淋巴結(jié)清掃。臨床分期：79.2%為Ⅰ期，4.2%為Ⅱ期，8.3%為Ⅲ期，8.3%為Ⅳ期。

漢族中53例為EEC，29例為NEEC，年齡37～80歲，中位年齡54歲，其中81例行全子宮切除術(shù)，40例同時行淋巴結(jié)清掃。臨床分期：67.9%為Ⅰ期，14.8%為Ⅱ期，17.3%為Ⅲ期。

2.2 miRNA表達譜分析

應(yīng)用TLDA對維吾爾族與漢族女性各1例漿液性癌和1例絕經(jīng)期內(nèi)膜對照進行miRNA表達譜分析，差異倍數(shù)≤0.125或≥8為界值。與正常對照相比，此例維吾爾族漿液性癌共有130個miRNA表達存在顯著差異，其中59個表達降低，71個表達升高；此例漢族漿液性癌共有143個miRNA表達存在顯著差異，41個表達降低，102個表達升高。

對比兩例Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌miRNA的表達：兩例患者中35個miRNA變化一致，其中均升高28個，均降低7個；有23個miRNA的表達特點截然相反(表1)。更突出的特點是93個miRNA在維吾爾族患者中輕微變化，但在漢族患者中顯著升高或降低；90個miRNA在維吾爾族患者中顯著升高或降低，但在漢族患者中變化輕微。

表1 維吾爾族與漢族Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中表達差異的miRNAs

2.3 實時定量PCR法對比維吾爾族與漢族子宮內(nèi)膜癌miRNA表達

以實時定量PCR法檢測62例維吾爾族女性子宮內(nèi)膜癌(對照組為正常內(nèi)膜組織13例，包括7例增殖期、1例分泌期、5例絕經(jīng)期)和82例漢族女性子宮內(nèi)膜癌(對照組為正常內(nèi)膜13例，包括9例增殖期、1例分泌期、3例絕經(jīng)期)中，miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145的表達。在對照組的正常子宮內(nèi)膜組織中，各miRNA在增殖期、分泌期和絕經(jīng)期內(nèi)膜及兩民族間的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.1miR-141、miR-200a、miR-205在子宮內(nèi)膜癌中的表達特點 與正常對照相比，子宮內(nèi)膜癌中miR-141、miR-200a、miR-205的表達顯著升高(P<0.05)。分組分析顯示兩民族表達特點類似，miR-141、miR-200a在維吾爾族表達更高，高于漢族，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.020，P=0.028，圖1，表2)。進一步分析顯示，miR-141、miR-200a在維吾爾族EEC和NEEC中表達水平近似(表2)，而在漢族NEEC中表達更高，高于EEC，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.029，P=0.010，表3)。miR-205在兩民族間表達水平近似，在EEC和NEEC中差異也無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖1)。維吾爾族EEC中，具有侵襲性臨床病理特點的腫瘤miR-200a有表達更高的趨勢，且高級別腫瘤中表達水平高于低級別腫瘤組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.044)，NEEC組無此特點(表2)，維吾爾族EEC中miR-141有類似表達趨勢。漢族女性EEC和NEEC中，miR-200a表達與臨床病理特點的關(guān)聯(lián)性呈相反的特點，NEEC組miR-200a的表達更高，EEC組中具有侵襲性臨床病理特點的腫瘤，miR-200a表達更低，而NEEC組具有侵襲性臨床病理特點的腫瘤，miR-200a有表達更高的趨勢(表3)，miR-205在不同臨床病理特點分組間表達的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.2子宮內(nèi)膜癌miR-145、miR-143的表達特點 在144例子宮內(nèi)膜癌中，與正常對照相比，子宮內(nèi)膜癌中miR-143的表達降低，miR-145的表達升高。分組分析顯示，miR-145、miR-143在維吾爾族與漢族中的表達特點相反，維吾爾族中表達升高，漢族中表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001，圖1)。與正常對照相比，維吾爾族Ⅱ型癌(NEEC)中miR-145升高更明顯(P=0.001)，也高于Ⅰ型癌(差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義)，且在侵襲性相對不強的腫瘤(腫瘤級別低、肌層浸潤淺、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、無脈管浸潤)中表達水平更高，其中，在肌層浸潤深度<1/2的病例中miR-145顯著升高(P=0.042)，其他指標未見顯著差異(表2)。miR-143具有相似的趨勢，另外，與正常對照相比，Ⅰ型癌(EEC)中miR-145和miR-143僅有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表2)。漢族女性EEC和NEEC中miR-145和miR-143表達均顯著降低，但在EEC具有侵襲性病理特點的腫瘤中，miR-145和miR-143均降低得更明顯，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NEEC不具此特點(表3)。

2.4 維吾爾族與漢族女性子宮內(nèi)膜癌DNMT3B的表達特點及與miR-145、miR-143的關(guān)聯(lián)性

Spearman相關(guān)分析顯示，漢族女性子宮內(nèi)膜癌中miR-145和miR-143與DNMT3B呈負相關(guān)(R=-0.256，R=-0.239)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.020，P=0.030)。

維吾爾族女性子宮內(nèi)膜癌也存在較高的DNMT3B過表達(71.0%, 44/62)，且明顯高于漢族(53.7%，44/82，P=0.035，圖2)，但DNMT3B表達與miR-145、miR-143表達無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

維吾爾族與漢族EEC和NEEC的DNMT3B表達特點不盡相同，EEC中兩民族DNMT3B的過表達率類似，而NEEC中，維吾爾族(84.6%)顯著高于漢族(41.4%，圖2)。同時，維吾爾族子宮內(nèi)膜癌(包括EEC、NEEC)多數(shù)具有侵襲性病理特點的腫瘤中DNMT3B有過表達率更高的趨勢(個別組未見此特點，可能與例數(shù)過少有關(guān))，而漢族女性這一特點僅見于EEC，NEEC未見此特點(表4)。

3 討論

子宮內(nèi)膜癌發(fā)病有地域差異，不同人種發(fā)病特點也不完全一致。我們對新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院近年收治的子宮內(nèi)膜癌病例分析顯示，漢族女性子宮內(nèi)膜癌數(shù)量顯著高于維吾爾族(598/92)，而且漢族淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(13.9%)高于維吾爾族(3.3%)[7]，與本組研究結(jié)果類似，目前對維吾爾族與漢族女性子宮內(nèi)膜癌的差異性原因和機制還缺乏相關(guān)研究。

表2 miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145在維吾爾族女性EEC (n=49)和NEEC (n=13)中的表達

a, 48 Uygur women received hysterectomy; b, 41 Uygur women received lymphadenectomy. EEC, endometrioid endometrial carcinoma; NEEC, non-endometrioid endometrial carcinoma; SE, standard error.

表3 miR-141、miR-200a、miR-205、miR-143、miR-145在漢族女性EEC (n=53)和NEEC (n=29)中的表達

a, 81 Han women received hysterectomy; b, 40 Han women received lymphadenectomy. Abbreviations as in Table 2.

本研究以TaqMan芯片技術(shù)分析了維吾爾族與漢族女性NEEC中miRNA的表達特點，相對于對照的絕經(jīng)期內(nèi)膜組織，維吾爾族女性漿液性癌組織中59個miRNA表達降低，71個升高，漢族41個降低，102個升高。少部分miRNA(23個)在兩民族中的表達特點截然相反，表達趨勢一致的miRNA有35個，但更突出的特點是許多miRNA在一個民族中表達升高或降低，而在另一個民族中不表達或表達非常少(分別為93個和90個)。與以往文獻數(shù)據(jù)和本課題組先前對漢族女性Ⅰ型癌miRNA表達譜的分析進行對照，83%異常表達的miRNA與以往文獻報道一致，提示不同種族和人群的Ⅰ型內(nèi)膜癌具有相對一致的miRNA表達特點[8-13]。同時，目前有限的針對Ⅱ型內(nèi)膜癌的研究顯示，Ⅰ/Ⅱ型癌大部分miRNA表達相似，少部分存在差異。有研究報道17個miRNA在兩型內(nèi)膜癌中的表達有顯著差異，包括miR-675、miR-375、miR-570等[14]。以往文獻研究結(jié)果間接提示維吾爾族與漢族Ⅱ型癌中差異表達的miRNA數(shù)量應(yīng)該不會太高，與本研究結(jié)果似乎不完全一致，本研究結(jié)果可能間接反映出維吾爾族與漢族在種族、遺傳背景等多種因素中有差異。另一方面，本研究僅分別用1例維吾爾族和1例漢族NEEC組織與各自1例對照組織進行miRNA表達譜分析，數(shù)據(jù)可能存在一定程度偏差。同時，不同研究采用的標準或側(cè)重角度有所不同，也是導(dǎo)致結(jié)果差異的原因之一。

表4 維吾爾族與漢族女性子宮內(nèi)膜癌中DNMT3B的表達特點

Abbreviations as in Table 2.

miR-200家族和miR-205在子宮內(nèi)膜癌中普遍升高[15-16]，許多研究都證實這一現(xiàn)象，提示miR-200家族和miR-205可能是子宮內(nèi)膜癌的腫瘤標志物。miR-200家族有5個成員，根據(jù)種子序列分為兩組，miR-141/miR-200a為一組(AACACU)，miR-200b/miR-200c/miR-429為另一組(AAUACU)。本組數(shù)據(jù)與文獻報道一致，144例子宮內(nèi)膜癌中miR-141和miR-200a顯著高表達，同時整體上維吾爾族的表達顯著高于漢族。進一步分析發(fā)現(xiàn)，維吾爾族Ⅰ型癌(EEC)中，這兩個miRNA升高的腫瘤更具侵襲性，而漢族中的特點相反，miR-200a表達升高的腫瘤侵襲性相對減弱。另外，漢族Ⅱ型癌(NEEC)中，miR-200a表達升高的腫瘤趨向更具侵襲性，而維吾爾族不具有此特點。miR-205在兩民族的子宮內(nèi)膜癌中均升高，EEC與NEEC中的表達特點沒有明顯差異。結(jié)合以往文獻，本研究結(jié)果支持miR-141、miR-200a、miR-205高表達是內(nèi)膜癌的主要分子特征之一，但miR-141、miR-200a在兩民族間及不同組織學(xué)類型的子宮內(nèi)膜癌中扮演的角色可能不同，其功能及相關(guān)機制值得進一步探討。

miR-145及miR-143在中胚層起源的組織(包括子宮、卵巢和睪丸等)中高表達，在多種惡性腫瘤(如卵巢癌、大腸癌、膀胱癌等)中表達降低，被認為是最具普遍性的抑癌基因[17-18]。我們先前的研究顯示，漢族女性子宮內(nèi)膜癌組織中miR-145及miR-143的表達顯著降低，特別是Ⅰ型癌，miR-145或miR-143低表達的病例有生存預(yù)后差的趨勢，且與其預(yù)測靶基因DNMT3B呈負相關(guān)[19]。本組82例漢族女性子宮內(nèi)膜癌的研究結(jié)果與先前結(jié)果基本一致，提示漢族女性內(nèi)膜癌miR-145或miR-143的表達降低，解除對DNMT3B基因的靶向抑制，可能是DNMT3B高表達的因素之一。

62例維吾爾族女性子宮內(nèi)膜癌的數(shù)據(jù)結(jié)果與漢族不同，首先，維吾爾族miR-145和miR-143的表達特點與漢族相反，呈顯著升高，DNMT3B也顯著過表達，且miR-145和miR-143表達升高與DNMT3B過表達均在Ⅱ型癌中更突出，但兩者并無明顯關(guān)聯(lián)性，可能提示維吾爾族miR-145和miR-143的高表達并未抑制DNMT3B基因表達，可能存在miR-145和miR-143以外的因素參與DNMT3B的調(diào)節(jié)。

其次，維吾爾族中，miR-145和miR-143升高在Ⅱ型癌更突出，且miR-145和miR-143升高的腫瘤侵襲性相對減弱；而在漢族中，miR-145和miR-143表達降低的腫瘤更具侵襲性。另外，總體上漢族子宮內(nèi)膜癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于維吾爾族，可能提示與miR-145、miR-143在維吾爾族中升高，發(fā)揮抑癌作用有關(guān)。

綜上，我們對144例子宮內(nèi)膜癌的分析發(fā)現(xiàn)，miR-141和miR-200a普遍表達升高，但在維吾爾族與漢族女性及Ⅰ/Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中扮演的角色可能不盡相同。miR-145和miR-143在兩民族子宮內(nèi)膜癌中的表達特點相反，但無論在維吾爾族或漢族子宮內(nèi)膜癌，miR-145和miR-143可能均發(fā)揮抑癌作用。維吾爾族與漢族女性子宮內(nèi)膜癌的臨床病理特點可能存在一定差異，上述miRNA表達差異及作用靶基因的差異可能與之有一定關(guān)聯(lián)性。