姜 妮，喬國梁，王小利，周心娜，周 蕾，宋雨光，趙艷杰，任 軍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，腫瘤治療性疫苗北京市重點實驗室，北京 100038)

胰腺癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差[1]。胰腺癌發(fā)病隱匿，大部分患者就診時已為晚期，失去手術(shù)機會。晚期胰腺癌治療研究進(jìn)展緩慢，化療是長期以來主要的治療手段。盡管有研究報道，聯(lián)合氟尿嘧啶或吉西他濱以及奧沙利鉑、伊立替康、氟尿嘧啶聯(lián)合化療能使患者獲益，但此類患者的生存期始終沒有明顯的改善或者藥物副反應(yīng)太大，患者難以耐受[2]。

T細(xì)胞過繼免疫治療作為一種針對惡性腫瘤的治療手段在多種腫瘤的治療上取得了不錯的療效，引起越來越多的關(guān)注，但針對晚期胰腺癌的研究報道不多。樹突狀細(xì)胞/細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(dendritic cell/cytokine induced killer, DC-CIK)是一種常見的過繼免疫治療方法，通過體外激活和擴(kuò)增生成由DC、自然殺傷T細(xì)胞(natural killer T，NK-T)組成的混合物，輸注該種混合物可以刺激機體產(chǎn)生腫瘤特異性T細(xì)胞應(yīng)答。CIK細(xì)胞具有NK-T表型，同時表達(dá)CD56和CD3，介導(dǎo)非主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)限制的細(xì)胞毒性，而作為抗原呈遞細(xì)胞的DC，當(dāng)與CIK共培養(yǎng)時可以提高細(xì)胞增殖率并增強CIK的抗腫瘤活性，由于其快速增殖和抗腫瘤活性強，DC-CIK治療被廣泛應(yīng)用于多種實體腫瘤中[3-4]。

S-1 (Taiho制藥公司，日本東京)是一種含替加氟、吉美嘧啶、奧替拉西鉀的口服復(fù)方制劑，其與氟脲嘧啶相比，在各種胃腸道惡性腫瘤中顯示了非劣效性，且降低了氟尿嘧啶的胃腸道毒性[5-6]。在局部晚期和轉(zhuǎn)移性胰腺癌的治療中，單藥S-1與吉西他濱相比，不僅口服便利、耐受好，而且治療效果相當(dāng)[7]，S-1一線治療轉(zhuǎn)移性胰腺癌也展示了令人鼓舞的效果[5]。此外，一項二期臨床研究結(jié)果顯示，S-1用于吉西他濱耐藥的患者時，總反應(yīng)率(overall response rate，RR)仍達(dá)到15%，中位無進(jìn)展生存期(progression-free survival, PFS)為2.0個月，中位總體生存期(overall survival, OS)為4.5個月[8]。

一項前瞻性臨床研究觀察到，在晚期胰腺癌患者中，S-1與DC-CIK聯(lián)合具有協(xié)同抗癌活性[9]，該研究中，接受S-1聯(lián)合DC-CIK治療、單獨DC-CIK治療、單獨S-1治療和最佳支持治療的4組患者的6個月PFS分別為41.6%、9.1%、0、0，6個月OS分別為62.2%、18.2%、25.0%、0，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.001)。

越來越多的證據(jù)表明，癌細(xì)胞引起的系統(tǒng)性炎癥活化可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移或促進(jìn)血管生成[10-11]。外周血中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比例(neutrophil to lymphocyte ratio, NLR)被認(rèn)為是全身炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物之一，對預(yù)測各種癌癥的預(yù)后很有價值[12]。有研究表明，在接受過化療或手術(shù)切除的胰腺癌患者中，治療前NLR升高與預(yù)后較差有關(guān)[13-15]。目前暫時未見晚期胰腺癌患者接受T細(xì)胞免疫治療中有關(guān)NLR的報道。本研究旨在評價晚期胰腺癌患者NLR的預(yù)后意義，特別是接受了DC-CIK免疫治療的患者。我們還分析了NLR與T細(xì)胞亞型的關(guān)系，希望能更好地說明NLR與DC-CIK 細(xì)胞免疫治療療效是否具有相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究獲得首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理審查委員會的批準(zhǔn)，所有患者均簽署書面知情同意書。選取北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2013年6月1日至2016年5月30日就診的患者，47例晚期胰腺癌患者符合研究標(biāo)準(zhǔn)，其中男22例、女25例，年齡36～79歲，平均(67.3±10.9)歲，TNM分期Ⅲ期7例、Ⅳ期40例，所有病理類型均為腺癌?；颊叻謩e采用DC-CIK細(xì)胞療法單獨治療(n=11)、S-1單獨治療(n=4)、DC-CIK聯(lián)合S-1治療(n=25)、最佳支持治療(n=7)。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥18歲且<80歲；(2)美國東部協(xié)作腫瘤組(Eastern Cooperative Oncology Group，ECOG)體能狀況(performance status，PS)評分0～2分；(3)通過組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)和典型的影像學(xué)診斷，證實為胰腺不可切除、局部進(jìn)展或轉(zhuǎn)移性腺癌；(4)有客觀可測量的腫瘤病灶；(5)前期未行免疫治療或化療；(6)除胰腺癌外，無并發(fā)惡性腫瘤；(7)重要臟器功能基本正常；(8)預(yù)期壽命>3個月；(9)簽署知情同意書。

1.3 治療方法

患者分為4個治療組：DC-CIK聯(lián)合S-1組、S-1組、DC-CIK組、支持治療組。遵循本組之前研究的分組方法[9]，患者根據(jù)自身意愿選擇入組。

DC-CIK的制備過程參見本組之前的研究[16]。皮下注射粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)， 動員骨髓中單個核細(xì)胞釋放入血，通過分離外周血收集單個核細(xì)胞并進(jìn)行體外擴(kuò)增。使用COBE Spectra細(xì)胞分離機(COBE BCT, Lakewood, CO, USA)采集細(xì)胞，直到CD34+細(xì)胞≥4.5×106/kg(體質(zhì)量)。25～50 mL的收集產(chǎn)物經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液區(qū)分為懸浮細(xì)胞及貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞加入干擾素-γ、白細(xì)胞介素(interleukin, IL)-2及CD3單抗體外共培養(yǎng)，產(chǎn)生CIK細(xì)胞；貼壁細(xì)胞與IL-4、腫瘤壞死因子-α和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)體外共培養(yǎng)，產(chǎn)生DC細(xì)胞；7 d后兩者混合培養(yǎng)。

S-1的劑量根據(jù)體表面積確定為：<1.25 m2，40 mg每日二次；1.25～1.50 m2，50 mg每日二次；≥1.50 m2，60 mg每日二次。每日早、晚餐后口服，連續(xù)口服14 d，休息7 d，每21天為1周期。治療一直持續(xù)到疾病惡化或出現(xiàn)不可接受的毒性反應(yīng)。DC-CIK細(xì)胞靜脈輸注20 min，每周期細(xì)胞回輸分別在患者化療第15天、17天和19天進(jìn)行，每21天為1周期?；剌敿?xì)胞數(shù)量的中位數(shù)為7.8×109，治療一直持續(xù)到疾病惡化或出現(xiàn)不可接受的毒性反應(yīng)。

1.4 觀察項目和指標(biāo)

記錄患者的病史和體格檢查，患者每周期治療前均行全血細(xì)胞計數(shù)、血清生化、腫瘤標(biāo)志物及心電圖檢查，第1周期DC-CIK細(xì)胞治療前及治療后2周檢查T細(xì)胞亞群，治療前及療效評價時行腹部和盆腔增強CT或MRI檢查，必要時行胸部增強CT檢查，定期隨訪。OS為主要觀察指標(biāo)，定義為從第1次治療到死亡的時間。PFS為次要觀察指標(biāo)，定義為從第1次治療開始直到疾病進(jìn)展或死亡或出現(xiàn)第二惡性腫瘤。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)變量表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，用雙側(cè)獨立t檢驗進(jìn)行比較，分類變量比較使用卡方檢驗。采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve, ROC)評價NLR的預(yù)測價值，采用Kaplan-Meier曲線對生存率進(jìn)行描述，用Log-Rank方法比較不同組間的差異。建立Cox比例危險模型，首先對單個危險因素與患者預(yù)后進(jìn)行單因素分析，單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入多因素分析中，確定獨立危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者特點

根據(jù)ROC曲線分析將患者分為NLR>2.5 (n=18)和NLR≤2.5 (n=29)兩組，患者特征見表1，兩組患者的基線特征差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 與NLR相關(guān)的生存分析

本研究進(jìn)行了ROC分析以確認(rèn)NLR的截斷值，最終確定將NLR>2.5 作為合適的截斷值。NLR≤2.5組患者的OS(P=0.018，圖1A)和PFS(P=0.033，圖1B)明顯優(yōu)于NLR>2.5 組的患者。分層分析發(fā)現(xiàn)，DC-CIK細(xì)胞治療組中，NLR≤2.5 的患者與NLR>2.5的患者相比，OS(P=0.032，圖2A)及PFS(P=0.031，圖2B)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，有明顯的生存優(yōu)勢。未接受DC-CIK細(xì)胞治療的患者中，NLR≤2.5的患者與NLR>2.5的患者相比，OS(P=0.213，圖2C)和PFS(P=0.562，圖2D)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 與臨床結(jié)果相關(guān)的預(yù)測因素

使用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，在調(diào)整競爭風(fēng)險因素后，NLR≤2.5和DC-CIK結(jié)合S-1仍然是PFS和OS的獨立預(yù)測因子(表2)。

表1 患者的基線特征

ECOG-PS, Eastern Cooperative Oncology Group performance status.

2.4 外周血T細(xì)胞表型分析

外周血單個核細(xì)胞的表型分析顯示，在治療前及第1個周期結(jié)束后，CD3+和CD8+/CD28+T細(xì)胞亞群在NLR≤2.5的患者中顯著增加(P<0.05)，CD8+/CD28-和CD4+/CD25+細(xì)胞亞群則顯著降低(P<0.05，圖3)。在NLR>2.5 的患者中只有CD3+T細(xì)胞亞群明顯升高(P<0.05)。

3 討論

本研究納入的患者均為晚期胰腺癌患者，在過去的幾十年當(dāng)中，這部分患者的治療效果有限，有些化療方案雖然療效肯定，但3～4級副反應(yīng)的發(fā)生率很高，限制了方案的廣泛使用。胰腺癌組織中的浸潤淋巴細(xì)胞減少、髓樣細(xì)胞功能異常、纖維組織增生明顯及腫瘤細(xì)胞死亡受體下調(diào)，導(dǎo)致其免疫原性減弱，單純的免疫治療(如疫苗、檢查點阻斷劑、非特異性免疫調(diào)節(jié)劑、過繼免疫治療、溶瘤病毒等)也療效甚微[17]。單一的治療模式效果有限，但免疫治療聯(lián)合其他治療方法卻具有協(xié)同作用，如放化療可以促進(jìn)胰腺癌腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生非特異性免疫反應(yīng)，同時通過腫瘤細(xì)胞死亡、更多的腫瘤抗原釋放，促進(jìn)特異性抗腫瘤免疫，因此聯(lián)合治療已成為目前研究的熱點。DC-CIK細(xì)胞治療被證實對多種轉(zhuǎn)移性實體瘤有效，因其副反應(yīng)小、與其他治療有協(xié)同作用,在癌癥的治療中得到了廣泛的研究和應(yīng)用。雖然由于技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范的操作規(guī)程和安全評價抗腫瘤療效的標(biāo)準(zhǔn)體系尚未確立[18]，但作為一項潛在有效的治療方法，DC-CIK治療常與其他治療手段聯(lián)合使用以期增加療效。近年來，DC-CIK聯(lián)合化療、DC-CIK聯(lián)合PD-1抗體、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DC-CIK治療、非細(xì)胞來源的靶向肽負(fù)載DC-CIK療法等取得了不錯的效果[19-20]。DC-CIK與化療聯(lián)合治療晚期胰腺癌比單一治療的療效更好，進(jìn)一步尋找療效預(yù)測因素成為進(jìn)一步的研究目標(biāo)。

表2 多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析患者臨床特征及生存

PFS, progression-free survival; OS, overall survival; ECOG-PS, Eastern Cooperative Oncology Group performance status; NLR, neutrophil to lymphocyte ratio; DC-CIK, dendritic cell/cytokine induced killer.

本研究顯示，治療前外周血NLR值是晚期胰腺癌患者生存時間的獨立預(yù)測因素，與之前的研究報道相符[21]，然而，之前的相關(guān)研究中NLR的截斷值多采用中位值，且不完全一致，降低了NLR的臨床應(yīng)用價值。我們認(rèn)為NLR作為一個連續(xù)的變量，會受到患者基線及治療方案的影響，因此探索不同群體、不同治療方案的截斷值有一定的臨床價值。我們將NLR的截斷值定為2.5，除了考慮統(tǒng)計的敏感性和特異性外，還考慮了其臨床意義。本研究發(fā)現(xiàn)，NLR≥2.5組患者的生存時間明顯小于NLR<2.5組，該差異主要體現(xiàn)在接受DC-CIK治療的患者組。DC-CIK細(xì)胞回輸提高了患者外周血淋巴細(xì)胞比例，對NLR產(chǎn)生影響，在低NLR組更為明顯，進(jìn)一步影響了治療效果，故NLR在DC-CIK組患者的預(yù)后意義可能更大。低NLR預(yù)測CIK免疫治療療效顯著，而高NLR則預(yù)示可能需要更多的CIK治療周期或其他更強的免疫治療來提高患者的生存率[22]。本研究未發(fā)現(xiàn)NLR在非DC-CIK治療組中具有預(yù)后作用，不完全排除與該組患者中接受化療的患者數(shù)量較少有關(guān)。

NLR具有預(yù)后價值的潛在機制主要在于浸潤性中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞引發(fā)了系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞浸潤，通過分泌IL-2、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α和血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)[23]，促進(jìn)腫瘤擴(kuò)散。VEGF是一種促血管生成因子，通過血管生成促進(jìn)癌癥的發(fā)展，腫瘤壞死因子α和IL-10的增加則導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)量減少和功能障礙[24]。眾所周知，淋巴細(xì)胞耗竭很大程度上反映了T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)受損，是一個不良預(yù)后特征[25]。一般來說，中性粒細(xì)胞升高和淋巴細(xì)胞減少的相對比例可能是評價個體全身炎癥反應(yīng)和結(jié)果的科學(xué)指標(biāo)，因此，NLR在一定程度上是評價預(yù)后的潛在指標(biāo)。

本研究是一項小樣本回顧性研究，今后應(yīng)該進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性研究。

綜上所述，NLR升高可作為接受DC-CIK治療的晚期胰腺癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因素，NLR有助于評估接受免疫治療患者的預(yù)后，并為高NLR的患者選擇替代治療方案。