申露露，徐 娥*，肖英平， 桂國(guó)弘， 呂文濤， 任敏敏

（1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州310021）

近年來(lái)，產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是畜牧養(yǎng)殖中誘發(fā)初生動(dòng)物腹瀉，從而導(dǎo)致動(dòng)物死亡的重要致病菌，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）作為重要的益生菌之一（Liao等，2015），其能夠促進(jìn)有益菌群的增殖，抑制有害菌群的生長(zhǎng)、繁殖（朱曉慧等，2002），并于2009年被批為一種新的飼料添加劑 （桂國(guó)弘等，2016）。 Yang（2012）等報(bào)道，日糧中添加丁酸梭菌可降低肉雞盲腸中大腸桿菌的數(shù)量，提高肉雞盲腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數(shù)量。丁酸梭菌對(duì)畜禽感染大腸桿菌具有保護(hù)作用 （邢帥等，2018）。另有研究表明，丁酸梭菌能抑制機(jī)體中促炎性因子的表達(dá)，提高抗炎性因子IL-10的表達(dá)（Liu 等，2017）。 趙敏孟等（2018）提出丁酸梭菌提高畜禽免疫力與血清細(xì)胞因子含量和抑制腸道炎癥的發(fā)生有關(guān)。但丁酸梭菌早期干預(yù)對(duì)肉雞抵抗大腸桿菌感染和腸道炎癥反應(yīng)的影響還鮮見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)用丁酸梭菌作早期干預(yù)，通過(guò)ETEC攻毒，研究丁酸梭菌對(duì)雛雞大腸桿菌感染攻毒后死亡率和下痢率以及腸道炎癥因子和抗菌肽基因表達(dá)的影響，為丁酸梭菌作為畜牧業(yè)生產(chǎn)中預(yù)防大腸桿菌引起的疾病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 丁酸梭菌MIYAIRI II 588，購(gòu)自日本米雅利桑株式會(huì)社；產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88（菌株編號(hào)：CVCC1556），購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和分組情況如表1所示，試驗(yàn)選用200只健康1日齡肉雞（ROSS308，購(gòu)自江蘇鎮(zhèn)江騰達(dá)孵化廠），隨機(jī)分為2組，每組100只雞，分別為丁酸梭菌組和對(duì)照組，在1～3 d時(shí)每天對(duì)丁酸梭菌組灌喂1 mL濃度為109cfu/mL的丁酸梭菌菌液，對(duì)照組灌喂1 mL生理鹽水。到7 d時(shí)把丁酸梭菌組再隨機(jī)分為丁酸梭菌組 （CB組）和丁酸梭菌+大腸桿菌組（CB+EC組），同時(shí)對(duì)照組也隨機(jī)分成大腸桿菌組（EC組）和對(duì)照組（Control組），在7 d時(shí)對(duì)丁酸梭菌+大腸桿菌組（CB+EC組）、大腸桿菌組（EC組）每天灌喂1 mL 108cfu/mL大腸桿菌液，其余組灌喂1 mL生理鹽水。

表1 試驗(yàn)處理情況

試驗(yàn)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物房進(jìn)行，試驗(yàn)前對(duì)動(dòng)物房全舍及飼養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格消毒，飼養(yǎng)周期為14 d。試驗(yàn)為自由采食，自由飲水，人工投料，每天投喂3次，24 h光照，使用白熾燈調(diào)節(jié)動(dòng)物房室內(nèi)溫度，第一周溫度保持37℃，之后每周逐漸減低2～3℃直至室溫?；A(chǔ)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)成分如表2所示。

表2 日糧組成及主要營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 樣品采集 在肉雞大腸桿菌攻毒第3天（第10日齡）和第7天（第14日齡），從各試驗(yàn)組隨機(jī)取8只肉雞，取回腸組織中段放入1.5 mL離心管中，液氮速凍后轉(zhuǎn)置于-80℃超低溫冰箱保存，用于炎癥因子和抗菌肽基因表達(dá)分析。

1.4 熒光定量PCR 采用TRIzol Plus RNA Purification Kit（Invitrogen）試劑盒提取回腸組織RNA，用Nanodrop-2000測(cè)定所提取RNA的濃度和質(zhì)量，采用SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Invitrogen公司）反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。所用引物相關(guān)信息見(jiàn)表3。以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定，按照 Power SYBR○RGreen PCR Master Mix試劑盒（TaKaRa），采用CFX96熒光定量PCR儀 （美國(guó)Bio-Rad）進(jìn)行Real-Time PCR檢測(cè)。反應(yīng)體系為20μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性1 min；40個(gè)循環(huán)（95 ℃變性 15 s，63 ℃退火 25 s，收集熒光）。

表3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS軟件單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，基因相對(duì)表達(dá)量運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果

2.1 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞死亡率和下痢率的影響 如表4所示，灌喂丁酸梭菌的雛雞未出現(xiàn)死亡情況，對(duì)照組和大腸桿菌組中雛雞死亡率為3%。各組雛雞在灌喂大腸桿菌后均出現(xiàn)了下痢的情況，其中大腸桿菌組下痢率為73.52%，大腸桿菌+丁酸梭菌組下痢率為29.41%，可見(jiàn)丁酸梭菌可顯著降低大腸桿菌攻毒引起的腹瀉。

表4 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞死亡率和下痢率的影響%

2.2 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞回腸炎癥因子表達(dá)的影響 如圖1所示，攻毒3 d后肉雞回腸組織炎癥反應(yīng)相關(guān)基因TNFα、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）的表達(dá)量在各組無(wú)顯著差異 （P＞0.05），丁酸梭菌組 Toll樣受體 4（TLR4）和白細(xì)胞介素8（IL-8）的表達(dá)量顯著低于大腸桿菌組和大腸桿菌+丁酸梭菌組（P＜0.05）。而丁酸梭菌組和大腸桿菌+丁酸酸梭菌組抗炎癥因子白細(xì)胞介素10（IL-10）的表達(dá)量顯著高于大腸桿菌組（P ＜ 0.05）。

攻毒7 d后結(jié)果如圖2所示，回腸組織炎癥反應(yīng)相關(guān)基因TNFα、IL-1β和IL-8的表達(dá)量各組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。大腸桿菌組與丁酸梭菌組＋大腸桿菌組TLR4的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和丁酸梭菌組（P＜0.05）。大腸桿菌組抗炎因子IL-10的表達(dá)量顯著低于其他各組（P＜0.05）。

2.3 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞回腸內(nèi)源性宿主防疫肽表達(dá)的影響 如圖3所示，在攻毒3 d后AvBD9和Cath-B1在回腸組織中的表達(dá)量各組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），而丁酸梭菌組AvBD10表達(dá)量極顯著的高于其他各組（P＜0.01）。

攻毒7 d后回腸組織內(nèi)源性宿主防御肽表達(dá)結(jié)果如圖4所示，丁酸梭菌組與大腸桿菌組回腸組織中AvBD9的表達(dá)量顯著高于其他組 （P＜0.01），Cath B1表達(dá)量各試驗(yàn)組均顯著高于對(duì)照組 （P＜0.01）。AvBD10在各組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），但丁酸梭菌組和丁酸梭菌+大腸桿菌組的表達(dá)量較高。

3 討論

3.1 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞死亡率和下痢率的影響 ETEC是一種引起初生幼畜腹瀉的主要病原體。ETEC入侵腸道后，會(huì)引起腸道功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致急性腹瀉（Dubreuil等，2016）。 邢帥（2018）等研究表明，丁酸梭菌對(duì)仔豬感染大腸桿菌引起的應(yīng)激反應(yīng)有保護(hù)作用。本試驗(yàn)結(jié)果也顯示丁酸梭菌作為一種益生菌，可以降低雛雞因大腸桿菌引起的下痢，與前人研究結(jié)果一致（李海花等，2017；Hayakawa 等，2016）。 丁酸梭菌可能是抑制了雛雞腸道內(nèi)大腸桿菌的黏附素和腸毒素的表達(dá)，降低雛雞的腹瀉。

3.2 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞回腸組織中炎癥因子表達(dá)的影響 動(dòng)物機(jī)體炎癥反應(yīng)主要是由于血清中抗炎性因子和促炎性因子失調(diào)導(dǎo)致的。有研究表明，在動(dòng)物飼糧中添加益生菌可調(diào)節(jié)血清中抗炎性因子和促炎性因子的表達(dá)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體炎癥反應(yīng)有改善作用（李玉鵬等，2017）。丁酸梭菌可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，主要是通過(guò)特異性受體調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫通路（楊玲等，2018）。在本試驗(yàn)回腸組織中，10 d時(shí)TNFα、IL-1β無(wú)顯著性差異 （P＞0.05），相比EC組與CB+EC組，丁酸梭菌組IL-8基因的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），而IL-8是導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)促炎性因子，IL-8的表達(dá)量降低，說(shuō)明丁酸梭菌可以調(diào)控IL-8的表達(dá)來(lái)改善機(jī)體炎癥反應(yīng)；同時(shí)與CB組相比，大腸桿菌組炎癥抑制因子IL-10的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），丁酸梭菌能促進(jìn)炎癥抑制因子的表達(dá)，與李玉鵬（2017）等研究一致；14 d時(shí) TNFα、IL-1β、IL-8 沒(méi)有顯著 性差異 （P ＞0.05）。與CB＋EC組相比，大腸桿菌組IL-10的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），同時(shí)這段時(shí)間肉雞的腹瀉情況有所好轉(zhuǎn)，表明丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞引起的腹瀉有一定改善作用。因此，丁酸梭菌早期干預(yù)可以提高雛雞血清中抗炎性因子的表達(dá)，同時(shí)抑制促炎性因子的表達(dá)。

3.3 丁酸梭菌對(duì)大腸桿菌攻毒肉雞回腸內(nèi)源性宿主防疫肽表達(dá)的影響 宿主防御肽（HDPs），又被稱作抗菌肽（AMPs），大多由20～100個(gè)氨基酸組成，廣泛表達(dá)于動(dòng)植物的各個(gè)組織中（Shafee等，2016；Schneider等，2010）。 宿主防御肽在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，對(duì)各種病原物質(zhì)具有廣譜抗性，能直接殺滅各種細(xì)菌、病毒、真菌等（張龍等，2017）。同時(shí)，宿主防御肽具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和炎癥反應(yīng)。因此，宿主防御肽具有很高的應(yīng)用價(jià)值，可直接作為抗菌劑或者疫苗輔劑，或者作為免疫及生殖調(diào)控劑等（Hancock 等，2012；Skerlavaj等，1996）。 宿主防御肽作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，在病原菌感染機(jī)體時(shí)，腸道內(nèi)抗菌肽基因會(huì)相應(yīng)的表達(dá)（Su等，2018）。本研究結(jié)果可以看出在大腸桿菌攻毒后的第3天，丁酸梭菌組AvBD10的表達(dá)量顯著高于其他試驗(yàn)組，而AvBD9和CathB1在各個(gè)試驗(yàn)組之間沒(méi)有顯著差異，可能原因是丁酸梭菌早期定植在雛雞體內(nèi)主要調(diào)節(jié)AvBD10的表達(dá)，有研究表明AvBD10 mRNA在雞的卵黃囊上皮細(xì)胞中高度表達(dá)，參與先天免疫（Zhang等，2019）。攻毒后第7天，丁酸梭菌組與大腸桿菌組AvBD9在回腸組織的表達(dá)量顯著增加（P＜0.01），試驗(yàn)組CathB1表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組顯著增加（P＜ 0.01），在三個(gè)試驗(yàn)組中都無(wú)顯著性差異。AvBD10在各組中都無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而丁酸梭菌組與丁酸梭菌+大腸桿菌組的 AvBD10表達(dá)量都高于對(duì)照組與大腸桿菌組。從總體結(jié)果可以看出丁酸梭菌可以提高雛雞腸道抗菌肽基因的表達(dá)，對(duì)大腸桿菌早期攻毒肉雞腸道有一定的保護(hù)作用。

4 結(jié)論

丁酸梭菌早期干預(yù)可以在一定程度上降低大腸桿菌攻毒肉雞腸道中的炎癥反應(yīng)和提高抗菌肽基因的表達(dá)，從而減少大腸桿菌引起的下痢。